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a 92 EI andalisis de las proteinas Introduccion 157 9.1.1 La clasiicacion y algunas consideraciones generales 157 91.2. La importancia del andlisis 157 9.1.3 El-contenido en los alimentos 158 Los métodos 158 9.2.1 El método de Kjeldahi 158 9.2.1.1 El fundamento 158 9.2.1.2 Los antecedentes histéricos 168 9.2.1.2.1 El método original 188 9.2.1.2.2 Las mejoras 189 Los procedimientos generales y las reacciones 159 9.2.1.3.1 Lapreparacién delamuesira 150 9.2.1.3.2 La digestion 159 9.2.1.3.3 La neutralizacién y la destlacién 159 9.2.1.3.4 La valoracién 188 9.2.1.3.5 Los céleulos 159 9213 922 923 924 925 Sam K. C. Chang 91.2.1.3.6 Algunos procedimientos ‘atlerativos 160 92.1.4 Las aplicaciones 160 El método de Dumas (0 de la combustion del nitrogen) 160 92.2.1 Elfundamento 160 92.22 El procedimiento 160 92.23 Las aplicaciones 160 La espectroscopia infraroja 161 9.2.3.1 Elfundamento 161 92.3.2 El procedimiento 161 9.23.3 Las aplicaciones 161 El método del biuret 161 92.4.1 El fundamento 161 92.4.2 El procedimiento 161 9.2.4.3 Las aplicaciones 161 El método de Lowry 162 92.5.1 El fundamento 162 925.2 El procedimiento 162 ee | 9.1 INTRODUCCION Se 9.1.1 Laclasificacién y algunas consideraciones generales Las proteinas son un componente abundante de to- das las células, y todas ellas, con Ia excepcién de las proteinas de almacenamiento, son importantes para las funciones bioldgicas y la estructura de las células. Las proteinas de los alimentos son muy complejas. Muchas de ellas han sido purificadas y caracterizadas. Las pro- teinas varian en su masa molecular, abarcando aproxi- madamente desde 5.000 hasta mas de un millén de daltonios. Estin compuestas por elementos que inclu- yen el hidrogeno, el carbono, el nitrégeno, el oxigeno y fl azufte. Veinte c-aminoacidos son las piezas para la construccién de las proteinas; los residuos aminoacidos que forman una proteina se encuentran unidos por en ces peptidicos. EI nitrégeno es el elemento mas caracte- ristico presente en las proteinas. No obstante, el conteni do de nitrégeno en las diversas proteinas alimentarias abarca desde un 13,4% hasta un 19,1% (1), debido a la variacién en la composicién especifica de aminoacidos de las proteinas. Generalmente, las proteinas ricas en los aminodcidos fundamentales contienen més nitrégeno. Las proteinas se pueden clasificar segin su composi- cién, su estructura, su funcién bioldgica o sus propieda- des de solubilidad. Por ejemplo, las proteinas simples (0 sencillas) contienen s6lo aminodcidos tras la hidrélisi mientras que las proteinas complejas (o conjugadas) con- tienen también componentes que no son aminodcidos. Las proteinas presentan conformaciones tinicas, | cuales podrian verse alteradas por agentes desnaturali- zantes tales como el calor, los Acidos, los Alcalis, la urea 8M, la guanidina-HCl 6 M, los disolventes orgénicos y los detergentes. La solubilidad, asi como las propieda- des funcionales de las proteinas, podrian verse alteradas por los agentes desnaturalizantes. El andlisis de las proteinas viene complicado por el hecho de que algunos componentes alimentarios presen- tan propiedades fisico-quimicas similares. El nitrégeno no proteinico provendria de los aminodcidos libres, los péptidos pequeiios, los acidos nucléicos, los fosfolipi dos, los aminoaziicares, Ja porfirina y algunas vitami- nas, los alcaloides, el Acido urico, la urea y los iones amonios. Por consiguiente, el contenido total de nitré- ‘geno orgénico en los alimentos representaria primordial- mente el nitrégeno procedente de las proteinas y, en menor medida, el que proviene de todas las sustancias ‘orginicas nitrogenadas distintas de las proteinas. Depen- diendo de la metodologia, otros componentes principa- les de los alimentos, incluyendo a los lipidos y los hidratos de carbono, pueden interferir fisicamente con el andlisis de las proteinas alimentarias. Se han desarrollado numerosos métodos para medir el contenido en proteinas. Los principios basicos de dichos métodos incluyen las determinaciones del nitrogeno, de los enlaces peptidicos, de los aminoacidos aromaticos, de la capacidad de unién a los tintes, de la absortividad de las proteinas en el ultravioleta (UV) y de las propiedades de dispersion de la luz. Ademas de factores tales como la sensibilidad, la exactitud, la precisién, la rapidez y el cos: te de los analisis, para la eleccién de un método apropi do para una aplicacién en particular, hay que tomar en ‘consideracién qué se esta midiendo en realidad. 9.1.2 La importancia del andlisis El anélisis de las proteinas es importante para: 1, El etiquetado nutricional. 2. La investigacién de las propiedades funciona- les. En diversos tipos de alimento, las proteinas presentan propiedades alimentarias funcionales linicas: por ejemplo, las gliadinas y las gluteninas en la harina de trigo para la panificacién, las caseinas de la leche en la coagulacién para dar productos de queso y la albimina de los huevos como agente espumante. (Véase el Capitulo 15). 3. La determinacién de la actividad biolégica. Al- ‘gunas proteinas, que incluyen a los enzimas y a los inhibidores de los enzimas, son pertinentes para laciencia de los alimentos y la nutricién: por ejem- plo, los enzimas proteoliticos que intervienen en el ablandamiento de las carnes, las pectinasas en la maduracién de las frutas y los inhibidores de la tripsina en las semillas de las legumbres, son pro- teinas. Para comparar entre distintas muestras, la actividad enzimatica se expresa, con frecuencia, en términos de su actividad especifica, lo que sig- nifica unidades de actividad enzimética por cada mg de proteina. El anilisis de las proteinas es necesario cuando usted quiere saber: 1. El contenido total de proteinas. 2. El contenido en una proteina en particular, en una mezela. 3. El contenido en proteinas, durante el aislamiento y la purificacién de una proteina. 4, El nitrogeno no proteinico. 5. la compsicisn de aminodcidos (véase el Capitu- lo 15). 157 158 Analisis de los alimentos ; api- 6. El valor nutrtivo de una proteina (véase el CoP tulo 15). 9.1.3 El contenido en los alimentos is : ja am- El contenido de proteinas en los alimentos var pliamente. Los alimentos de origen animal y las legur Tabla 9-1 El contenido de proteinas de algunos alimentos 3° cogidos. cog Porcentaje de proteinas (sobre Ia base de! ‘Atticulo alimentario ‘paso en himedo) ae Coreales y pasta ‘Aroz, marrén, de grano largo, erudo 78 ‘Aroz, blanco, de grano largo, normal, ‘crude, erriquecido 7A Haina de tigo, integral 187 Harina de maiz, integral, amarila 69 ‘Spaghetti, secos, enriquecidos 128 ‘Amidén de maiz 03 Productos lécteos Leche, entera,iquida 38 Leche, desnatada, en poh 362 ‘Queso, Cheddar 249 YYogur, natural, bajo en grasas 53 Frutas y verduras Manzanas, crudas, con piel 02 Espérragos, crudos 23 Fresas, crudas 08 LLechugas, iceberg, crudas 10 Patatas,enteras, pupa y piel 20 Legumbres, Semiles de soja, semilas meduras, crudas 365 ‘Akbias, aifionadas, todas las variedades, semilas madures, crud, 236 Tofu, crude, duro 168 Tofu, crudo, normal 81 ‘Games, aves de coral, pescados Came de vacuno, pescuezo, aguja 185 Came de vacuno, curada, came de vacuno seca 20'4 Pollo, para asar 0 para frelr, solo la pechuga, crud 2 Jamén, on fonehas, normal on Huevos, eros, ertros, a Pesca, bacla, del Petco, exao " Pescado, atin, blanco, eniatado en aceite, . ceca ws lentes de proteinas. Ep | s son fuentes excel En la Tay acoen Jos contenidos de algunos articulos ain! rios escogidos. te 9.2 LOS METODOS zon ‘Accontinuacién, se describen los fundaments, ig cedimientos generales y las aplicaciones para 4 métodos de determinacién de las proteina. Para trucetones detalladas de los procedimientos, con” métodos citados. Los métodos de Kjeldahl, de Dane ® combustion del nitrogeno) y de la espeetasen: infrarroja estén tomados del libro Official Methaa, Analysis de la AOAC International (3) y se utlizan4. bitualmente en el etiquetado nutricional y el cong Ia calidad, Los demas métodos descritos se ulican op rminmente en los laboratorios de investigaciin guy, bajan sobre las proteinas. Muchos de los métodos tas dos enel presente capitulo han sido descrito, con unpay is de detalle, en libros recientes sobre las protena los alimentos (4-6). 9.2.1 El método de Kjeldahl! 9.2.1.1 El fundamento Enel procedimiento de Kjeldahl, las proteinas yom componentes orgénicos alimentarios contenidos ens muestra, son digeridos con Acido sulfitrico en presenia de catalizadores. El contenido total de nitrégeno o- ganico es transformado en sulfato de amonio. El dget do se neutraliza con dleali y se destila sobre una dsole cidn de Acido bérico. Los aniones boratos formades valoran frente a dcido valorado, el cual, a su vez, secu vierte al nitrdgeno en la muestra. El resultado del anil- sis representa el contenido bruto de proteinas en el a+ mento, puesto que el nitrogeno proviene también & Componentes distintos de las proteinas. 9.2.1.2 Los antecedentes histéricos 92.1.2.1 Elmétodo original En 1883, Johann Keb! desarrollé el proceso basico del método de Kjelditl hoy en dia, para analizar el nitrogeno organico. LosP* Benerales en el método original incluyen: 1. La digestion con dcido sulfirico, con ss de permanganato de potasio en polvo pa* Pletar ta oxidacién y la transformacién de! Beno a sulfato de amonio. “in esi La neutralizacién del digerido diuido de la destilacién en un volumen conotide do valorado, el cual contiene yoduro y yodato de potasio. 3. La valoracién del yodo liberado, con tiosulfato de sodio valorado. 9.2.1.2.2 Las mejoras Varias modificaciones impor- tantes han mejorado el proceso de Kjeldahl original: 1. Se adicionan al acido sulfitrico catalizadores me- tilicos, tales como el mercurio, el cobre y el selenio, para completar la digestién Se ha encon- trado que el mercurio es el mis satisfactorio. Se ha informado de que el didxido de selenio y el sulfato de cobre, en una proporcién 3:1, son efec- tivos para la digestién. Igualmente, se han utiliza- do para la digestién el cobre y el didxido de titanio como un catalizador mixto (Método 988.05 de la AOAC) (3). La utilizacién del didxido de titanio y el cobre plantea menos preocupaciones de se- guridad que el mercurio en la eliminacién de re siduos, con posterioridad al andlisis. 2. Se utiliza el sulfato de potasio para elevar el pun- to de ebullicién del acido sulfirico, para acelerar la digestion. 3. Para ayudar a la liberacién del nitrégeno del mercu- . el cual tiende a retener el amonio, se aftaden sulfuro 0 tiosulfato de sodio al digerido diluido. 4. Elamoniaco se destila directamente dentro de una disolucién de acido bérico y, seguidamente, se de- termina volumétricamente frente al 4cido valorado. 5. Para determinar el contenido en nitrégeno, des- pués de la digestion, se utilizan el método colori- métrico de Nessler o la cromatografia de iones para medir el amoniaco. Bradstreet ha escrito un libro que es excelente para repasar el método de Kjeldahl para el contenido total de nitrogeno orgénico (7). El Método 955.04 es el procedi- miento basico de Kjeldahl de la AOAC. La semiautoma- tizacién, la automatizacion y la modificacién para la de- terminacién del nitrégeno en cantidades de microgramos (el método micro-Kjeldahl) han sido establecidos por la AOAC en sus Métodos 976.06, 976.05 y 960.52, res pectivamente. 9.2.1.3. Los procedimlentos generales y las reacciones 9.2.1.3.1 Lapreparacién dela muestra Los alimen- tos sélidos se muelen para que atraviesen un tamiz.de 20 mallas, Las muestras para el andlisis deberian ser homo- Béneas, No son necesarios otros preparativos especiales. El anilisis de las proteinas 159 9.2.1.3.2 La digestién Introduzca la muestra (pesa- da con exactitud) en un matraz. de Kjeldahl. Afiada el Acido y el catalizador; digiera hasta que esté limpido, para alcanzar la degradacién completa de toda la mate- ria orgénica. Como resultado de Ia reaccién entre el ni- trégeno y el acido sulfirico se forma el sulfato de amonio, que no es volatil. 4cido sulfitrico Proteina (NH,),SO, 11] calor catalizador “808 Durante la digestién, el nitrégeno de las proteinas es liberado para dar lugar a iones amonio; el écido sulfari- co oxida la materia orgénica y se combina con el amonio formado; los elementos carbono e hidrégeno se trans- forman en diéxido de carbono y agua. 9.2.1.3.3 La neutralizacién y la destilacién El dige- rido se diluye con agua. Para neutralizar el acido sulfisri- co, se adiciona una disolucién alcalina de sulfato de sodio. El amoniaco formado se destila dentro de una disolucién de Acido bérico, conteniendo los indicadores Azul de Metileno y Rojo de Metilo (Método 991.20 de la AOAC). (NH,):S0, + 2 NaOH — 2 NH; + Na,SO, + 2 H,0 Rp) NH; + H3BO; (acido bérico) > NHI + H,BOs (ion borato) [3] 9.2.1.3.4 La valoraci6n El anién borato formado (pro- porcional a la cantidad de nitrégeno) se determina volu- métricamente frente a HCI valorado. HBO; +H* > HBO; [4] 9.2.1.3.5 Los célculos Moles de HCI = moles de NH; = moles de N en la muestra (5) ‘Se deberia procesar un blanco del reactivo, para sus- traer el nitrégeno del blanco del nitrégeno de la muestra. th de N=N del HCI x volumen corregido del acido g de la muestra | eden mot * 100 F6) x donde: N del HCl = normalidad del HCI, en moles/1.000 mL 160 Anilisis de las alimentos Vol. corregido del acido = (ml de deide valorado consumidos por la muestra) ~ (mL. de Acido valorado consumidos por el blanco) 14 = peso atémico del nitrogeno Se utiliza un factor de conversion para trinsformar él porcentaje de nitrégeno en el porcentaje de la proteina bru- ta, La mayoria de las proteinas contienen un 16% de N, de modo que el factor de conversién es 6.25 (100/16 = 6.25) % de N/0,16 = % de proteina © bien, a % de N x 6,25 = % de proteina En la Tabla 9-2 se recogen los factores de conver- sién para diversos alimentos. 9.2.1.3.6 Algunos procedimientos alternatives En lugar de la destilacién y la valoracién con dcido, el amo- niaco 0 el nitrégeno se pueden cuantificar mediante: 1. La Nesslerizacién: 4.NH,OH + 2 Hel, +4 KI +3 KOH (yoduro mercirrico) > (NH;Hg,0)I + 7 KI +2 H;0 yoduro ammonobisico de dimercurio, (rojo-naranja, 440 am) [8] Este método es rapido y sensible, aunque el yoduro ammonobisico de dimercurio es coloidal y el co- lor no es estable. 2. NH; + fenol + hipoclorito > Azul de Indofenol (azul, 630 nm) 1) ol Tabla $-2 Los factores de conversién de nitrégeno a proteina para diversos alimentos. a ea a Factor —— Huevos 0 cares 625 Productos lécteos 638 Trigo 5.70 Otros coreales y semilas cleaginosss 625 ‘Almendras 5.18 Cacahuetes y nueces del Brasil (de Pert) 5.46, ‘Otros frutos secos de arbol y nuez de coco 5:30 ‘Datos extraidos de (3. 8) La medida del yolumen 4, La medida directa del amoniaco, todo de cromatografia ionic, 9.2.1.4 Las aplicaciones Ventajas: 1. Es aplicable a todo tipo de alimentos. 2. Es bart no se hace U0 de un Se a 5 Fe Shel contends on pesema ea 4 He gman Je pone cl nee Kjeldahl). Inconvenientes: 1. Mide el nitrégeno organico total, no sso ang geno proteinico. 2. Es costoso en tiempo (por lo menos, 7 heres pan completarlo). 3. Tiene una precisién menor que ¢! méodsé@ biuret. 4. El reactivo es corrosive. 9.2.2 El método de Dumas {0 de la combustién del nitrégeno) 9.2.2.1 El fundamento El método de combustion fue presentado en 1S Jean-Baptiste Dumas. Desde aquellos tiemps bt 5 modificado y automatizado para mejorar #9 a= Las muestras son sometidas a la combustion soe peraturas (700-1.000°C). El nitrégene liters oe tificado por medio de la cromatografia de s = zando un detector de conductividad térmica 12/8 El nitrégeno medido se convierte al contenido & ee na de la muestra. 9.2.2.2 El procedimiento Las muestras (de, aproximadamente. oss pesadas dentro de una cépsula de estate ¢ ge en un reactor de combustidn, en un EquiPS 2p do. El nitrogeno liberado se mide mediante °° grafo de gases incorporado. 9223 Las aplicaciones xa El método de 1a combustion €5 Um 2 sags método de Kjeldahl (10) y € = tipos de alimento. El Método 992.15 y el Método 992.23 de la AOAC son, respectivamente, para las cames y los granos de cereales, Ventajas: 1, No requiere productos quimicos peligrosos. 2. Puede ser llevado a cabo en 3 minutos. 3. Los instrumentos automatizados més recientes son capaces de analizar hasta 150 muestras, sin nece- sidad de ser atendidos. Inconvenientes: 1. Se precisa instrumentacién costosa, 2. Mide el contenido total del nitrégeno orgénico, no sélo el nitrégeno proteinico. 9.2.3 La espectroscopia infrarroja 9.2.3.1 El fundamento La espectroscopia infrarroja mide la absorcién de la radiacién (en las regiones cercana y media del infrarro- jo) por las moléculas en los alimentos u otras sustancias. Los distintos grupos funcionales presentes en un alimento absorben frecuencias diferentes de la radiacién, Para las proteinas y los péptidos, se pueden utilizar diferentes bandas caracteristicas del enlace peptidico, en el infra- rrojo medio (6,47 im) y el infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, 3.300-3.500 nm, 2.080-2.220 nm, 1.560- 1,670 nm), para estimar el contenido en proteinas de un alimento. Mediante la irradiacién de una muestra con una longitud de onda de luz infrarroja especifica para el componente a medir, es posible predecir la concentra- cién de dicho constituyente midiendo la energia que es reflejada o transmitida por la muestra (la cual es inver- samente proporcional a la energia absorbida) (11). 9.2.3.2 El procedimiento Para una descripcién detallada de la instrumentacion, la manipulacién de la muestra y la metodologia del cali- brado y la cuantificacién, véase el Capitulo 24, 9.2.3.3 Las aplicaciones La espectroscopia del infrarrojo medio se utili los analizadores infrarrojos de leche para determinar el contenido en proteinas de la leche, mientras que la es- Pectroscopia NIR ¢s aplicable a un amplio surtido de productos alimentarios (por ejemplo, el trigo, los cerea- les, las carnes y los productos lacteos) (12, 13, 3) (Méto- do 997.06 de la AOAC). Los instrumentos son costosos y deben ser calibrados adecuadamente. No obstante, las Elanélisis de las proteinas 164 Bundos y 2 minutos) por analistas con un aprendizaje minimo. 9.2.4 El método del biuret 9.2.4.1 El fundamento Cuando Jos iones eapricas se acomplejan con los enlaces peptidicos (de sustancias que contengan, al me- nos, dos enlaces peptidicos, es decir, el biuret, los pép- tidos grandes y todas las proteinas), se produce un co- lor violeta-purpiireo bajo condiciones alcalinas. Se toma la lectura, a 540 nm, de la absorbancia del color producido. La intensidad del color (0 absorbancia) es Proporcional al contenido en proteinas de la muestra (14). 9.2.4.2 El procedimiento 1. Semezelan 5 mL de un reactivo de biuret con una porcién de 1 mL. de la disolucién de las proteinas (de 1 a 10 mg de proteina/mL). El reactivo conti ne sulfato de cobre, NaOH y tartrato de sodio y potasio, el cual se utiliza para estabilizar el ion ccaprico en la disolucién alcalina. 2. Después de haber dejado reposar la mezcla de re- accién a temperatura ambiente, durante 15 6 30 minutos, se toma la lectura de la absorbancia a 540 nm, frente a un blanco del reactivo. 3. Si la mezcla de reaccién no fuese transparente, seria necesaria la filtracién o la centrifugacién an- tes de la lectura de la absorbancia. 4, Se construye una curva de calibrado de la con- centracién frente a la absorbancia, haciendo uso de la albsimina de suero bovino (BSA). 9.2.4.3 Las aplicaciones E] método del biuret ha sido utilizado para determi- nar las proteinas contenidas en los cereales (15, 16), en la carne (17), las protefnas de las semillas de soja (18) y como un ensayo cualitativo para el pienso (Método 935.11 de la AOAC, (el cual hace referencia a los méto- dos 22.012-22.013, AOAC, 10* ed,,(1965)] (19). El mé- todo de! biuret se puede utilizar, asi mismo, para medir el contenido en proteina de los extractos de proteinas. Ventajes: 1. Es menos costoso que el método de Kjeldahl; ré- pido (se puede completar en menos de 30 minu- tos); es el método més simple para el anilisis de las proteinas. 162 Anilisis de los alimentos encuentran desviaciones del color con menor el método de Lowry, la absor~ trieos (los cua frecuencia que & cidn UV 0 los métodos turbidime scriben mas abajo). 3. Muy pocas sustancias distintas de las proteinas en fos alimentos interfieren con la reaecion del biuret 4. No detecta el nitrogeno procedente de fuentes que no sean peptidicas 0 que sean distintas de las pro- teinas. Inconvenientes: 1, No es demasiado sensible, en comparacién con el método de Lowry; requiere, al menos, 2-4 mg de roteina para el ensayo. 2. Si estuviesen presentes, podria tener lugar cierta contribucién de los pigmentos biliares a la absor- bancia. 3. Una concentracién alta de sales de moni fiere con la reacci 4. El color varia con las diferentes proteinas; la ge- latina da un color rosa piirpura. 5. Podria presentarse una opalescencia en la disolu- cién final, si hubiese presentes niveles altos de lipidos o de hidratos de carbono 6. No es un método absoluto: el color se debe cali- brar frente una proteina conocida (por ejemplo, la BSA) 0 frente al método de Kjeldahl para el ni- trégeno. 9.2.5 El método de Lowry 9.2.5.1 El fundamento El método de Lowry (20, 21) combina la reacelén del biuret con la reduccién del reactivo fendlico de Folin-Ciocalteau (écido fosfomolibdico-fosfowolframi- co) por parte de los residuos tirosina y triptéfano de las. proteinas, El color azulado desarrollado, se mide a 750 fm (sensibilidad alta para una concentracién de protel- nas baja) 0 a 500 nm (baja sensibilidad para una concen- tracion de proteinas alta). El procedimiento original ha sido modificado por Miller (22) y Hartree (23) para me- jjorar la linealidad de la respuesta del color a la concen- tracién de las proteinas. 9.2.5.2 El procedimlento El siguiente procedimiento se basa en el procedimien- to modificado de Hartree (23): 1. Las proteinas a analizar se diluyen hasta un rango apropiado (20-100 ig) io inter- Made a enti solu Na tartrato-NaOH y se incuby 10 minutos, a temperatura ambiente, 4 vo de Folin recin pre Pata, ja mezela deg tba a 50°C, durante 10 minutos, 5, Se toma la lectura de la absorbancia a 45y 6, Se construye, cuidadosamente, una cura gn brado con Ia BSA, para estimar la concen de las proteinas en la muestra inedgnita cig 9.2.5.3 Las aplicaciones Debido a su simplicidad y sensibilidad,e! méa, Lowry hia sido utiizado ampliamente en la bog, de las proteinas. Sin embargo, no ha sido uilizad manera generalizada para determinar las proteins ny fistemas alimentarios, sin extraer previamente ls po teinas de Ia mezcla de alimentos. Ventajas: 1, Es muy sensible: a, De 50.a 100 veces més sensible que el més del biuret; b. De 10a 20 veces més sensible que el méné de absorcién de la radiacién UV a 280nm(é cual se describe mas abajo); c. Es de una sensibilidad similar ala neslrix cién; no obstante, es més util que la nese zacion. 2. Se ve menos afectado por la turbidez de la mus 3. Es mas especifico que Ia mayoria de ls métodos. 4, Es relativamente sencillo; puede Hevarses en 1-1,5 horas. Inconvenientes: Por los siguientes motivos, el procedimiento det * is requiere una ealibracién cuidadose pare cls aplicaciones en particular: 1. El color varia con las diferentes pres yor grado que con el método del bi 1 2. La coloracién no es estrictamente prop a concentracién de las proteinas- i. 3. La reaccién se ve interferida, en aad tiables, por la sacarosa, los Lipidos, 18 nes amortiguadoras de fosfatos: 19° dos y las hexoaminas. 4, Las concentraciones altas de azticares reductores, de sulfato de amonio y de fato de ¥ de compuestos con sulfhidrilos interfieren con la reaccién, 9.2.6 El método de Bradford di con el tinte le la union 9.2.6.1 El fundamento Cuando el Azul Brillante de Coomassie G-250 se une a las proteinas, el tinte cambia de color, desde roize a azalado, y el miximo de absorcin del tinte se desplera de 465 nm hasta 595 nm. El cambio en la absorbancia a 595 nm es proporcional a la concentracién de proteinas de la muestra (24). Al igual que otros métodos de tincién, el de Bradford se fundamenta en la naturaleza anféters de las proteinas. Cuando la disolucién que contiene Ine proteinas se acidula hasta un pH por debajo del punto iso- eléctrico de la proteina o las proteinas de interés, el tinte afiadido se une electrostaticamente. La eficiencia de la unién se ve aumentada por la interaccién hidrfoba de la molécula de tinte con la cadena polipéptica adyavemte a Jos residuos positivamente cargados en la proteina (4). En el caso del método de Bradford, el tinte unido a la protei- na presenta un cambio en su espectro de absorcién, en comparacién con el tinte no unido. 9.2.6.2 El procedimiento 1. Se disuelve el Azul Brillante de Coomassie G-250 en etanol del 95% y se acidula con dcido fosféri- co del 85%. 2. Las muestras conteniendo las proteinas (1-100 hig/mL) y disoluciones patrones de BSA se mez~ clan con el reactivo de Bradford. 3. Se toma la lectura de la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco del reactivo. 4. Se estima la concentracién de proteinas en la mues- tra, a partir de la curva de calibrado de la BSA. 9.2.6.3 Las aplicaciones EI método de Bradford utilizando Azul Brillante de Coomassie G-250, mas rapido y sensible, reemplaz6 en gran parte a los demds métodos de unién a tintes, los cuales utilizaban tintes aniénicos de acidos sulfonicos, incluyendo el colorante acido Naranja 12, el Naranja G y el Negro Amido (25). El método de Bradford ha sido utilizado con éxito para determinar el contenido en pro- teinas en los productos de las maltas y de la cerveza, y en los tubérculos de la patata (27). Este procedimiento ha sido mejorado para medir cantidades de las proteinas del orden de los microgramos (28). Debido a su rapidez, Elandlisis de las proteinas 163 Sensibilidad y a un menor niimero de interferencias que el método de Lowry, el método de Bradford ha sido am- Pliamente utilizado en la purificacién de las proteinas, Ventajas: 1. Es répido; la reaccién se puede completar en 2 minutos. 2. Es reproducible. 3. Es sensible; varias veces mas sensible que el mé- todo de Lowry. 4. No se presentan interferencias procedentes del sulfato de amonio, los polifenoles, los hidratos de carbono tales como la sacarosa 0 los cationes ta- les como el K*, el Na’ y el Mg?*. 5. Mide las proteinas y los péptidos con una masa molecular aproximadamente igual o mayor que 4.000 Da. Inconvenientes: 1, Sufre interferencias con los detergentes tanto iénicos como no iénicos, tales como el Triton X- 100 y el dodecilsulfonato de sodio. Sin embargo, los errores debidos a pequefias cantidades (0,1%) de dichos detergentes pueden ser corregidos util zando los controles adecuados. 2. El complejo proteina-tinte puede adherirse a las cubetas de cuarzo. El analista debe utilizar cubetas de vidrio 0 de plistico. 3. Lacoloracién varia con los diferentes tipos de pro- teinas, La proteina patrén debe ser elegida cui- dadosamente. 9.2.7 El método del dcido bicinconinico (BCA) 9.2.7.1 El fundamento Las proteinas reducen los tones cipricos a jones cuprosos, bajo condiciones alcalinas (29). El ion cuproso se acompleja con el reactive BCA, de color verdoso manzana, para dar lugar a un color pur- piireo, La intensidad del color formado es proporcional a la concentracién de las proteinas. 9.2.7.2 El procedimlento 1, Mezele (en un paso) la disolucién de proteinas con el reactivo BCA, el cual contiene la sal sédica del BCA, carbonato de sodio, NaOH, y sulfato de cobre, a pH 11,25. 2, Incube a 37°C, durante 30 minutos; o bien a tem- peratura ambiente, durante 2 horas; 0 bien a 60°C, durante 30 minutos. ilisis de fos alimentos 164 depende de la set ratura mas alta da La eleccién de la temperatura ‘bilidad deseada. Una tempe tuna mayor respuesta de color, 3, Tome la lectura de la absorbancia de la disolu: ign, a 562 nm, frente a un blanco del reactive 44, Construya una curva decalibrado uilizando la BSA. 9.2.7.3 Las aplicaciones El método del BCA ha sido utilizado en la extraccién y la purificacién de las proteinas. La conveniencia de este procedimiento para la medida de las proteinas en Tos si- temas alimentarios complejos no ha sido publicada. ‘Ventajas: 1. La sensibilidad es comparable a Ja del método de Lowry; la sensibilidad del método del BCA a es- cla micro (0,5-10 jig) es superior que la corres- pondiente al método de Lowry. 2. El mezclado en una sola etapa es mas fécil que en ‘el método de Lowry. 3. Elreactivo es més estable que el reactivo de Lowry. 4, Los detergentes no iénicos y las sales amortigua- doras no interfieren con la reaccién. 5. Las concentraciones medias de reactivos desnatu- ralizantes (guanidina-HC! 4 M o urea 3 M) no in- terfieren. Inconvenientes: 1. La coloracién no es estable con el tiempo. El analista debe controlar cuidadosamente el tiempo para la lectura de la absorbancia. 2. Cualquier compuesto capaz de reducir Cu? a Cut conducira a la formacién de color. 3. Los azicares reductores interfieren en un grado ma- yor que en el método de Lowry. También interfieren __ Tas concentraciones altas de sulfato de amonio. 4. Las variaciones de coloracién entre las distintas proteinas son similares a las del método de Lowry. 9.2.8 El método de la absorcién a 280 nm en el ultravioleta (UV) 9.2.8.1 El fundamento Las proteinas presentan una fuerte absorcién en el UV a 280 nm, debida principalmente a los residuos trip- téfano y tirosina en las proteinas. Dado que el conteni- do en tript6fano y tirosina en las proteinas de cada una de las fuentes alimentarias es bastante constante, se dria utilizar la absorbancia a 280 nm para estimar la con. centracién de las proteinas, haciendo uso de la ley de Beer. Puesto que cada proteina presenta 4 cign de aminoiicidos aromaticos nica, pag "Py, Gin del contenido en proteinas se deben den Coeficiente de extincion (Ergo) 0 la absonivign™®a (Em) para cada una de las proteinas. idad oy 9.2.8.2 EI procedimiento 1, Se solubilizan las proteinas en una amortiguadora o alcalina, 2, Se toma la lectura de la absorbancia dg cidn de proteinas, a 280 nm, frente a ys del reactivo. blancy 3, Se calcula la concentracién de las prot, acuerdo con la ecuacién ® Proens g isola A= abe (, donde: ‘A = absorbancia a = absortividad (coeficiente de absorcién) b = longitud del camino éptico de la célula o cubeta ¢ = concentracién 9.2.8.3. Las aplicaciones El método UV 280 nm ha sido empleado para des. minar el contenido en proteinas de la leche (30) y ks productos carnicos (31). No ha sido utilizado ampls- mente en los sistemas alimentarios. Como mejor, et técnica se aplica a los sistemas de protesnas purifcads, © bien a las proteinas que han sido extrafdas mediate dilcalis o agentes desnaturalizantes, tales como la uet 8M, Aunque los enlaces peptidicos de las proteins sorben més fuertemente a 190-220 nm que a 280 an, regién del UV bajo es mas dificil de medir. Ventajas: 1, Esrdpido y relativamente sensible. (A 480.00 requieren 100 ug o mas de proteinas; ¢s veces mas sensible que el método del bu 2. No se presentan interferencias por parte dels de amonio y otras sales amortiguadorss 3. No es destructivo; las muestras pueden ae zadas para otros andlisis, ras la determine las proteinas; utilizado muy ampliamente deteccién post-columna de las proteins Inonvenientes: P La 1. Los dcidos nucleicos absorben tambié” oe) Las proporciones entre la absorcion #280 las proteinas puras y los dcidos nucleicos ton 1,75 ¥ 05; fespectivamente. Se puede corregir a absorcién de los acidos nucleicos a 280 nm, si la cién de la absorcién a 280 nm/260 nm es co- Focida. También se pueden corregir los acidos frucleicos Utilizando un método basado en la dife- rencia entre la absorcién a 235 nm y a 280 nm (32). 2, Los contenidos en aminodcidos aromaticos en las proteinas procedentes de diversas fuentes, difie- ren considerablemente. 3, Ladisolucién debe ser limpida e incolora. La tur- bidez debida a las particulas suspendidas en la di- solucién aumentard falsamente la absorbancia. 4. Para utilizar este método, se requiere un sistema relativamente puro. 93. UNA COMPARACION DE LOS METODOS 83 + La preparacién de la muestra: Los métodos de Kjeldahl, de Dumas y la espectroscopia infrarroja requieren poca preparacién. Generalmente, un ta- mafio de particula de 20 mallas, 0 més pequefio, es satisfactorio para estos métodos. Algunos de Jos instrumentos NIR més recientes pueden reali- zar medidas directamente sobre los granos ente- ros y otros productos burdamente granulados, sin necesidad de una molienda u otra preparacion de lamuestra. Los demas métodos descritos en el pre- sente capitulo requieren particulas finas para la extracci6n de las proteinas de los sistemas alimen- tarios complejos. © El fundamento: Los métodos de Dumas y de Kjeldahl miden directamente la cantidad total del nitrégeno organico elemental en los alimentos; otros métodos miden las diversas propiedades de las proteinas. Por ejemplo, el método del biuret mide los enlaces peptidicos y el método de Lowry mide una combinacién de los enlaces peptidicos y los aminodcidos tript6fano y tirosina. La espec- troscopia infrarroja es un método indirecto para estimar el contenido en proteinas, basado en Is energia absorbida cuando una muestra es someti- daa una radiacién infrarroja de una longitud de ‘onda especifica para el enlace peptidico. © La sensibilidad: Los métodos de Kjeldahl, de Dumas y del biuret son menos sensibles que los métodos de Lowry, de Bradford, del BCA o del UV. ° Lara Después de que el instrumento haya sido calibrado debidamente, la espectroscopia infrarroja es, probablemente, el mas rapido de los Elaniilisis de as proteinas 165 métodos comentados. En la mayoria de los demés métodos que implican medidas espectrofotomé- tricas (colorimétricas), hay que separar las protel- nas de los materiales insolubles interfirientes, an tes de mezclar con los reactivos colorantes, o bien hay que eliminar los materiales insolubles del com= plejo coloreado proteina-reactivo después del mezclado. No obstante, la velocidad de la deter” minacién en los métodos colorimétricos y en el de Dumas es mas répida que Ia del método de Kjeldahl. 9.4 ALGUNAS CONSIDERACIONES ESPECIALES 1, Para seleccionar un método en concreto para una aplicacién especifica, hay que tener en cuenta Ia sensibi- lidad, la exactitud y la reproducibilidad, asi como las propiedades fisico-quimicas de los materiales alimenta- rios. Se deberfan interpretar cuidadosamente los datos, para reflejar qué se esta midiendo realmente. 2. Los métodos de procesado de los alimentos, tales como el calentamiento, pueden reducir la posibilidad de extraer las proteinas para su andlisis y provocar una esti- macién a la baja del contenido en proteinas, cuando es determinado mediante métodos que supongan una etapa de extraccién (9). 3, Todos los métodos, con la excepcién de los méto- dos de Dumas y de Kjeldahl, y del método UV para las proteinas purificadas, requieren el uso de una proteina patrén, o de referencia, o bien un calibrado frente al mé- todo de Kjeldahl. En el caso de los métodos que hacen uso de una proteina patron, se presupone que las prote!- nas contenidas en las muestras presentan una compos ‘cién y un comportamiento semejantes en comparacién con la proteina patrén, Es importante la eleccién de un patron que sea adecuado, para un tipo de alimento espe- cifico. 4, El nitrégeno no proteinico se encuentra presente en pricticamente todos los alimentos. Para determinar el nitrégeno proteinico, las muestras se extraen, habi- tualmente, bajo condiciones alcalinas y se precipitan, a continuacién, con Acido tricloroacético 0 con Acido sulfosalictlico. La concentracién del acido utilizado afec- ta al rendimiento de la precipitacién. Por consiguiente, el contenido del nitrégeno que no procede de las protef- nas puede variar con el tipo y la concentracién del reac- tivo utilizado. Se podria utilizar el calentamiento para ayudar en la precipitacién de las proteinas por medio del Acido, el alcohol u otros disolventes orgdnicos. Ademés 166 Anilisis de los alimentos de los métodos de precipitacién con dcido utilizados para la determinacién del nitrégeno que no proviene de las se podrian utilizar otros métodos menos em- Piricos tales como la dialisis y 1a ultrafiltracién y Ia cro- matografia en columna, para separar las proteinas de las sustancias no proteinicas pequeftas. 5. En la determinacién del valor nutritivo de las pro- teinas de los alimentos, incluyendo la digestibilidad de las proteinas y Ia relacién de Ia eficiencia proteica (PER), se utiliza habitualmente el método de Kjeldahl, con un factor de conversién de 6.25, para determinar el contenido en proteinas brutas. La PER podria ser subes- timada en e! caso de que hubiese presente en los alimen- tos una cantidad sustancial de nitrogeno que no proceda de las proteinas. Una muestra de alimento con un conte nido mayor de nitrdgeno no procedente de las proteinas (especialmente si el nitrégeno no proteinico no contiene muchos aminodcidos o péptidos pequefios) puede pre- sentar una PER més baja que una muestra de alimento que contenga una estructura o composicién semejantes y, sin embargo, una cantidad inferior de nitrogeno no Proteinico, 9.5 RESUMEN Han sido descritos métodos para determinar el conte- nido en proteinas de los alimentos, basados en las carac- teristicas singulares de las proteinas y los aminodcidos. Los métodos de Kjeldahl y de Dumas miden el nitroge- no. La espectroscopia infrarroja se basa en la absorci6n de una longitud de onda de la radiacion infrarroja espe- cifica del enlace peptidico. Las interacciones entre el cobre y el enlace peptidico intervienen en el andlisis a través de los métodos del biuret y de Lowry. Los ami- nodcidos estan implicados en los métodos de Lowry, de a union a los tintes y del UV a 280 nm. El método del BCA hace uso del potencial reductor de las proteinas en medio alcalino. Los diversos métodos difieren en su ra- pidez y sensibilidad. Ademaés de los métodos comentados, cominmente uti- lizados, hay otros métodos disponibles para la cuantifica- cién de las proteinas. Debido a la naturaleza compleja de os diversos sistemas alimentarios, se pueden encontrar problemas, en distintos grados, en el anilisis de las pro- teinas mediante los métodos disponibles. Los métodos répidos pueden ser adecuados para los propésitos del con- trol de la calidad, mientras que se requiere un método sen- sible para el trabajo con una cantidad diminuta de protei- nas, Habitualmente, los métodos colorimétricos indirectos requieren el uso de un patrén de proteinas cuidadosamen- te seleccionado, o bien un calibrado fren, oficial (por ejemplo, el de Kjeldah}), “ng. PREGUNTAS DE REPASO Qué nsiderar a la hora ge, método para Ia determinacién de las Proteinay? ey ‘método de Kjeldahl para el andlisis de las de tres pasos principales. Enumere estas etapar ee {que se evan a cabo y describa en palabras qué an pa. ste Explique claramente por qué se pueden utilizar jy de HCI como una medida indirecta del contenido de una muestra, 3. gPor qué es diferente, para los diversos alimentos conversion del nitrdgeno medido por el métnde de® proteinas y cémo se obtiene el factor de g25y al 4, {Como se pueden utilizar la nesslerizacién, oben ¢ mmiento que hace uso del fenoly el hipoclotito congas procedimiento de Kjeldahl, y emo podrian ésos pee, cen practica? 5. Establezea las diferencias y explique Ia base quia ig suientes técnicas, las cuales pueden ser utilizadas Ficar las proteinas en el control de la calidad oenleinan gacién: EI método de Kjeldahl EI método de Dumas (o de la combustién de tig, La espectroscopia infrarroja. EI método del biuret. El método de Lowry. El método de Bradford. EI método del BCA. h. La absorbancia a 280 nm. i. La absorbancia a 220 nm. 6. Para cada una de las situaciones desertas a continucin tifique e1 procedimiento de ensayo de proteinas a viliarst apropiado, ¢ indique la base quimica del método(esdecii# 5 lo que realmente mide?) a. El etiquetado nutricional. b. Laelucién de las proteinas intactas desde una coast ‘cromatografia; método cuaitativo o semicuniai"s ¢. La elucién de las protefnas intactas, desde una lun cromatografia; método colorimétrico, uantii 4d. Un método répido, de control de la calidad, pa nido en proteinas de las semillas de los cereale ling Pe eoeeore 9.7 EJERCICIOS — o 1. Unas alubias pintas precocinadas y sesh lizadas, por duplicado, en busca del contenido Por git teinas, utlizando el método de Kjeldahl. ° 8 siguientes datos: Contenido en humedad = 8,0% eso de la muestra nim, 1 = 1,015 8 so de la muestra nim. 2 = 1,025 g Peemalidad del HCL utilizado para la valoracién = 0,1142 mL. Hct consumido para la muestra nim, 1= 22,0 mL HCI consumido para la muestra nim. 2 = 22,5 mL. HCI consumido para el blanco del reactive = 0,2 mL. Caleule el contenido bruto en proteinas, tanto sobre la base del peso hiimedo como del peso en seco de las alubias pintas, ‘suponiendo que las proteinas de tas alubias pintas contienen tun 17,3% de nitrégeno. ‘Una fraccién de proteinas de 10 mL, recuperada de una cro- ‘matografia en columna, fue analizada en busca de las protei- nas utilizando el método del BCA. Se obtuvieron los datos siguientes, de un anélisis por duplicado, utilizando Ia BSA como patron: BSA Absorbencia mgm media a 562 nm 02 0,25 04 0.53 06 0.74 08 0.92 10 4,20 La absorbancia promedio de una muestra de 0,5 mL fue de 0,44. Caleule el contenido en proteinas (mg/mL) y la cantidad total de las proteinas de esta fraccién de la columna, Soluclones Contenido en proteinas = 19,8% sobre la base del peso en hi- redo; 21,4% sobre la base del peso en seco. . Contenido en proteinas = 0,68 mg/mL. Cantidad total de pro- teinas = 6,8 mg. 9.8 REFERENCIAS 1. Jones, D. B, 1931. Factors for converting percentages of nitrogen in foods and feeds into percentages of proteins. U.S. Dept. Agric. Circular nim. 183. Agosto. USDA, Washington, DC. 2. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. 2001. USDA Nutrient Database for Standard Re- ference, Release 14, Nutrient Data Laboratory Home Page. http:/www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp | 3. AOAC International. 2000. 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