ESPECTROFOTOMETRÍA/LUZ/CÁTEDRA DE FÍSICA/FFYB/ UBA

ACTIVIDADES: ESPECTROFOTOMETRÍA

El Taller de Espectrofotometría consta de varias etapas. En primer lugar, se analizarán los

fundamentos de la Espectrofotometría, para lo cual se retomarán contenidos relacionados
con fenómenos de absorción molecular, vistos en el Taller de Modelo Corpuscular. A
continuación, se analizarán las partes constituyentes de un espectrofotómetro y se
discutirán los controles que deben realizarse sobre este equipo para evaluar su correcto
funcionamiento.
Finalmente, una vez chequeado el funcionamiento del equipo, se procederá a cuantificar la
concentración de proteínas de una muestra. Para ello, se deberá determinar la longitud de
onda de trabajo realizando un barrido espectral, para luego seguir un protocolo de trabajo
que supone la preparación de tubos muestra, testigos y blancos, la confección de una curva
de calibración y la posterior determinación de la concentración de la muestra.
Es fundamental que lleguen al Taller con el Recorrido y el Anexo de Espectrofotometría
previamente leídos.

USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO

En el trabajo práctico utilizarán espectrofotómetros digitales, marca Jenway 6300 (Figura 1).
Estos equipos permiten variar la longitud de onda (λ) entre 320 y 1000 nm.

Figura 1. ​Espectrofotómetro digital (Jenway 6300)

INSTRUCCIONES DE USO

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1. Encendido del equipo: Una vez que se encuentre ubicado en el lugar donde se va a
utilizar, conectar el mismo a la red eléctrica (220V) y encenderlo apretando la tecla
encendido que se encuentra en la parte posterior del equipo (Figura 2). Esperar 10 minutos
hasta que se estabilice.

Figura 2

2. Selección del modo de trabajo: Los espectrofotómetros permiten trabajar en modo

absorbancia (Abs) o transmitancia % (T%). Para seleccionar el modo deseado presionar la
tecla lateral correspondiente. El modo de trabajo seleccionado aparece marcado con una
flecha en la parte inferior de la pantalla de lectura (Figura 3.a).

(a) (b)

Figura 3

3. Selección de la longitud de onda: Apretar las teclas de selección de longitud de onda

hasta obtener el valor numérico deseado. En la pantalla aparece la longitud de onda en nm
(Figura 3.b) Estos equipos permiten variaciones de 1 nm.

4. Puesta a cero: en una cubeta de medida colocar el blanco (que puede ser agua o
solvente dependiendo de la experiencia). Abrir la tapa del equipo y colocar la cubeta en el
porta-cubeta, luego cerrar la tapa. Presionar la tecla CAL y esperar (Figura 4). Aparecerá en
el visor la lectura 0,000 de absorbancia o 100 % de transmitancia, según el modo de trabajo

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seleccionado. Una vez realizada la puesta a cero, retirar la cubeta con el blanco. ​La puesta
a cero deberá realizarse cada vez que se modifique la longitud de onda.

Figura 4

5. Medida de la absorbancia de la muestra: Luego de retirar la cubeta con el blanco, colocar

la cubeta con la muestra a medir y cerrar la tapa del espectrofotómetro. Aparecerá en el
visor el valor de Abs o T% de la muestra. Registrarlo.

PARTE 1: CONTROLES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

OBJETIVO

Analizar los siguientes controles espectrofotométricos:

1- Luz espuria
2- Volumen mínimo
3- Cubetas
4- Centro de Banda
5- Linealidad fotométrica
6- Veracidad
7- Precisión

En este taller se realizarán de forma práctica los controles de Luz espuria, Volumen
mínimo, Cubetas y Linealidad fotométrica.
Junto a cada espectrofotómetro encontrarán las cartas de control del equipo, con
los resultados de los controles de Centro de Banda, Veracidad y Precisión. Deberán
analizar dichos resultados para concluir si el equipo pasa o no los controles
correspondientes.

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MATERIALES

Espectrofotómetro Jenway 6300

Cubetas para espectrofotómetro
1 cubeta de obstrucción
Gradillas, Tubos de vidrio
Pipetas de 5,0 y 10,0 mL
Soluciones de trabajo
Cartas de control del espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO

A continuación se detallan los procedimientos de todos los controles

espectrofotométricos.
Como se mencionó anteriormente, ​Uds realizarán experimentalmente los controles
de Luz espuria, Volumen mínimo, Cubetas y Linealidad Fotométrica.
Al lado de cada equipo encontrarán las cartas de control del espectrofotómetro
(planillas donde figuran los resultados experimentales de los controles), que fueron
realizadas previamente por un operador y que se encuentran dentro del tiempo
aceptable de validez para el uso del equipo. Dichas cartas poseen los resultados de
los controles de Centro de Banda, Veracidad y Precisión en forma de tablas y/o
gráficos. Deberán interpretar los resultados volcados en cada carta para concluir si
el espectrofotómetro pasa los controles en cuestión.

a. Control de luz espuria

Para realizar este control se puede trabajar a cualquier longitud de onda. Aquí la fijaremos
en la región en que posteriormente va a ser usado el equipo.
1. Seleccionar la opción transmitancia en el display del equipo.
2. Fijar con el selector de longitud de onda la λ en 500 nm.
3. Colocar 3 mL de agua en una cubeta de medida y llevar a T% = 100%. Retirarla.
4. Colocar la cubeta de obstrucción (cubeta pintada de negro) y registrar el valor de T %
obtenido.

El valor de T% registrado representa directamente el porcentaje de luz espuria. Informar

dicho valor. Se consideran como aceptables valores hasta el 1% de luz espuria.

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b. Control de volumen mínimo

1. Seleccionar la opción absorbancia (Abs) en el display del equipo.

2. Fijar con el selector de longitud de onda la λ indicada en el rótulo de la botella.
3. Colocar 3 mL de agua en una cubeta de medida y llevar a 0.000 de Abs. Retirarla y
vaciarla.
4. Colocar en la misma cubeta 0,5 ml de solución de trabajo y medir la Abs de la misma.
5. Repetir este procedimiento incrementando el volumen anterior por el agregado de más
solución coloreada a dicha cubeta. Agregar cantidad suficiente de la solución para llegar a
los siguientes volúmenes finales: 0,7; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,7;1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4;
2,5; 3,0 y 3,5 ml.
6. Registrar las Abs medidas para los distintos volúmenes.
7. Graficar Abs medida en función del volumen de solución cargado en la cubeta. A partir
del análisis del gráfico, determinar el volumen mínimo (VM) y calcular el volumen de trabajo
(VM + 20%). Trabajar de ahora en adelante, con un volumen igual o superior al volumen de
trabajo en las cubetas de lectura.

c. Control de cubetas

1. Seleccionar en el equipo el modo T%.

2. Fijar con el selector de longitud de onda la λ indicada en el rótulo de la botella que
contiene la solución que se va a usar para este control.
3. Colocar en la cubeta de medida un volumen adecuado de agua (teniendo en cuenta el
volumen de trabajo calculado anteriormente) y llevar a T% = 100%.
4. Retirar la cubeta y vaciarla, luego invertirla sobre papel absorbente para eliminar el resto
de agua.
5. Llenarla con un volumen adecuado de la solución de ​trabajo, en las mismas condiciones
que la anterior. Leer y registrar el valor de T % obtenido. Ésta será la cubeta de referencia.
6. Proceder de igual manera con todas las cubetas que se quieran utilizar y comparar la T%
leída en cada una de ellas con la de la cubeta de referencia.
7. Informar los valores de T% obtenidos para las distintas cubetas e indicar si podrán ser
utilizadas indistintamente o no.
Para poder utilizar las cubetas, la diferencia de T% entre ellas debe ser menor o igual al 1%.

d. Control de centro de banda (ver Resultados en Carta de Control)

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Si se quisiera realizar este control, se debería hacer un barrido espectral de una o varias
soluciones de referencia​, de distinto color de modo de controlar distintas longitudes de
onda. De cada sustancia coloreada se conoce el valor de λ al que presenta máxima
Absorbancia (valor de referencia).
Para ello:
1. Cargar una cubeta con agua y otra cubeta con la solución de referencia.
2. Con el selector de longitud de onda fijar diferentes valores de λ (para poder medir en
cada una de dichas λ los correspondientes valores de Abs).
Por ejemplo, para la solución de Rojo Congo, se podría proceder como se indica a
continuación:
entre 400 y 480 nm seleccionar la λ cada 20 nm
· entre 480 y 490 nm seleccionar la λ cada 5 nm
· entre 490 y 510 nm seleccionar la λ cada 2 nm
· entre 510 y 540 nm seleccionar la λ cada 10 nm
· entre 540 y 600 nm seleccionar la λ cada 20 nm
3. Para cada λ seleccionada llevar a 0.000 de Abs con la cubeta con agua.
4. Medir la Abs del rojo congo a las distintas λ seleccionadas, registrarlas.
5. Graficar Abs de rojo congo en función de la longitud de onda.
6. Determinar gráficamente la longitud de onda de máxima absorbancia. Comparar el valor
obtenido con el valor teórico de la solución de rojo congo (498+/- 1 nm).

Se considera como aceptable un corrimiento entre +/- 3 nm. En caso de que la diferencia
entre la lectura y el valor de referencia se encuentre dentro de dicho rango, la misma puede
ser considerada como error sistemático y corregirse.

e. Control de linealidad fotométrica

1. A partir de una solución de trabajo de concentración conocida (a la que llamaremos
100%), preparar diluciones para obtener soluciones de las siguientes concentraciones (%
V/V): 75%, 50%, 25% y 12,5%.
2. Realizar un barrido espectral entre las longitudes de onda comprendidas entre +/- 30 nm
respecto del valor indicado en el rótulo de la botella de la solución de trabajo cada 5 nm.
Para realizar el barrido espectral emplear la solución de trabajo. ​Para cada longitud de
onda de medida, recordar llevar a cero con agua.
3. A partir del gráfico realizado con los datos del barrido, seleccionar la longitud de onda
óptima de trabajo
4. Con el selector de longitud de onda fijar la 𝜆 óptima de trabajo .
5. Llevar a 0.000 de Abs con agua.
6. Medir las Abs de las distintas soluciones por duplicado.
7.Graficar Abs en función de la concentración (expresada en % de dilución respecto de la

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solución de trabajo).
8. Informar el rango de linealidad fotométrica, es decir, entre qué ​valores de absorbancia​,
el equipo tiene una respuesta lineal.

f. Control de veracidad (ver Resultados en Carta de Control)

Si se quisiera realizar este control,
1. Seleccionar la opción Abs en el display del equipo.
2. Seleccionar la longitud de onda de trabajo, teniendo en cuenta que la λ óptima de la
solución de Cloruro de Cobalto es 512 nm y realizando la corrección correspondiente, en
caso de existir corrimiento del centro de banda. (NOTA: Es válido considerar constante el
corrimiento de centro de banda, ya que se trabaja a longitudes de onda, cercanas a las
evaluadas en el Control de Centro de Banda)
3. Llevar a 0.000 de Abs con la cubeta que contiene agua.
4. Cargar otra cubeta con solución de referencia y medir su Abs.
5. Repetir los pasos iii) y iv) hasta obtener 10 lecturas de Abs para el Cloruro de Cobalto.
6. Calcular con estos datos la media de absorbancias (Abs​exp​)

La veracidad fotométrica se estimará según el error fotométrico% (EF%) que se calcula

según:

Donde Abs ​ref es

​ el valor consignado en el rótulo del envase.
Se considera como aceptable un error fotométrico comprendido entre +/- 5%.

g)​ ​Control de la precisión fotométrica (ver Resultados en Carta de Control)

Si se quisiera realizar este control,
1. Con los 10 valores de absorbancia, obtenidos con el cloruro de cobalto al realizar el
control de veracidad, calcular el desvío estándar (S).
2. Calcular el coeficiente de variación porcentual (CV%) según:

Se considera como aceptable un CV% menor al 1%

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h) Discutir la información de las cartas de control, sumada a los resultados de los

controles realizados en esta primera etapa​.

PARTE 2: APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA - DETERMINACIÓN

CUANTITATIVA DE CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA TÉCNICA DE
BIURET

OBJETIVOS

● Diseñar el protocolo de trabajo para la cuantificación de un analito incoloro presente

en una muestra, utilizando una técnica colorimétrica que permita su determinación.
● Determinar la longitud óptima de trabajo correspondiente a la solución coloreada
mediante un barrido espectral.
● Determinar la concentración de colágeno hidrolizado en una muestra mediante el
uso de la técnica de Biuret para determinación de proteínas.

MATERIALES

Espectrofotómetro Jenway 6300

Cubetas semimicro para espectrofotómetro
Pipetas de vidrio de 1 y 5 mL o pipetas automáticas
Reactivo de Biuret
Soluciones testigos (T) de colágeno hidrolizado (CH) de concentraciones
T1 20 mg/L
T2 40 mg/L
T3 60 mg/L
T4 80 mg/l
Dos Soluciones muestras de concentraciones desconocidas.
Tubos de hemólisis de vidrio y gradilla
Vasos de precipitado

PROCEDIMIENTO

IMPORTANTE: ​Es esencial prestar especial cuidado en el ​manejo de las soluciones​,

manteniendo su valor de pH y evitando que se contaminen. Para ello recomendamos:
-Utilizar material limpio, lavarlo bien antes de comenzar a trabajar.

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-No pipetear directamente del frasco que contiene el reactivo de Biuret Hay dispuestos
vasos de precipitados en los cuales se debe vertir una cantidad moderada del reactivo
(tener en cuenta el volumen total a utilizar).
-No usar el mismo material volumétrico para dispensar diferentes soluciones sin haberlo
lavado bien previamente.
-Usar guantes durante el trabajo práctico para evitar el contacto de los reactivos con las
manos. Los reactivos pueden tener un pH alto, que daña la piel, y las soluciones
coloreadas pueden manchar.

a) Determinación de la longitud de onda óptima de trabajo

Colocar en un tubo de vidrio 0,1 mL de Testigo 4 y 2,0 mL de reactivo de Biuret. Mezclar

delicadamente con tapón de plástico, por inversión, evitando la formación de espuma.
Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Realizar un barrido espectral entre ​510 nm
y 570 nm, cada 5 nm. Para cada longitud de onda de medida, recordar llevar a cero con
agua.
Seleccionar la longitud de onda óptima de trabajo. ​Usar dicha longitud de onda para
medir los tubos del protocolo a realizar en la parte b.

b) Determinación de la concentración de colágeno hidrolizado (CH) en una muestra

1. Preparar 15 tubos según se indica en la siguiente tabla.

Testigo 1 Testigo 2 Testigo 3 Testigo 4 Agua Muestra 1 Muestra 2 Reactivo

20 mg/mL 40 mg/mL 60 mg/mL 80 mg/mL destilada (mL) (mL) Biuret
(mL) (mL) (mL) (mL) (mL) (mL)

Tubo
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2. Mezclar delicadamente cada tubo con tapón de plástico, por inversión, evitando la
formación de espuma.
3. Incubar a temperatura ambiente 20 min.
4. Seleccionar la longitud de onda según la establecida en el item “a” y llevar a 0,000 de Abs
con agua.
5. Leer las Abs de todos los tubos.
6. Corregir los valores de Abs
7. Graficar Abs en función de concentración de CH (concentración en el tubo) de los
testigos procesados.
8. A partir del gráfico, obtener la ecuación de la recta e informar el rango de linealidad.
9. Utilizando la ecuación del gráfico, calcular la concentración de ​muestra incógnita en cada
uno de los tubos donde se procesó.

PREGUNTAS PARA DISCUTIR

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- ¿Qué ocurriría si por error no se cierra completamente la tapa del porta cubetas al realizar
una lectura de Abs? Si esta situación se mantiene cuando realizan el control de luz espuria,
¿cómo influiría en el valor de T % medido?

- ¿Qué ocurriría si se realiza el control de luz espuria con un volumen inferior al volumen
mínimo?

- ¿A qué causas podrían atribuir un valor superior al 1% de T para el dicho control?

- Cuándo el operador seleccionó la longitud de onda óptima de trabajo, ¿Qué criterio adoptó
para decidirlo?

- Para realizar el control de linealidad fotométrica se utiliza una sustancia que se sabe que
“cumple con la Ley de Lambert-Beer” y que permite medir absorbancias hasta 1,500. Si
luego realizan la medida en un espectrofotómetro observando que hay linealidad hasta
0.800 ¿a qué se podría atribuir? ¿Qué parte del instrumental puede no estar en
condiciones?

- Realizaron el control de linealidad fotométrica con Rojo Congo (cc solución madre = 1.0
g/L) y éste se cumplió hasta una Abs de 1,500 con el equipo usado. Posteriormente se
preparó una solución madre de otro colorante: Rojo Certificado, de igual concentración que
el anterior y a partir de ésta se hicieron distintas diluciones. Luego se midieron las
absorbancias de la madre y de sus distintas diluciones. La linealidad con este colorante se
mantuvo hasta a 0.800 de Abs, correspondiente a una concentración de 0.75 g/L. ¿Qué
pueden decir de dicha sustancia? ¿Podrían calcular la absortividad de dicha sustancia?
¿Qué tendrían que tener en cuenta?

- En el protocolo de la reacción con el reactivo de Biuret, ¿qué función cumple cada uno de
los tubos utilizados? ¿Por qué debe realizarse un blanco de cada uno de los reactivos a
utilizar? ¿Qué implica corregir las lecturas? ¿Podría reducirse o aumentarse de alguna
manera la cantidad de tubos preparados?

- ¿Podrían leer las absorbancias de todos los tubos del protocolo del Biuret contra el tubo
blanco de reactivo en vez de leerlo contra el tubo que contiene agua? En caso de que la
respuesta sea negativa ¿Cuáles deberían leer contra blanco de agua indefectiblemente?
- Si la concentración de proteínas calculada fuese superior a 100 g/L, ¿sería válido este
resultado? En caso de que no lo fuera, ¿Qué tratamiento realizarían con la muestra para
llegar a un valor confiable?

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- ¿Cómo procedería para el cálculo de concentración de proteínas en la muestra si el

protocolo indica un volumen para los testigos y otro diferente para la muestra?

- Usted tiene que determinar la concentración de un pigmento X, con λ máxima absorción a

580 nm. El espectrofotómetro que está usando posee un monocromador que tiene un
desplazamiento de longitud de onda emitida de +3 nm en la región de 550-600 nm. En caso
de no realizar un barrido espectral del complejo coloreado con el espectrofotómetro, y a
partir de la información que dispone, ¿Qué longitud de onda emplearía para medir las
absorbancias de los tubos del protocolo? ¿Por qué?

- ¿Cual es la diferencia más importante entre la realización de un control de centro de

banda y la realización de un barrido espectral ? ¿Para que se realiza un control de centro de
banda en un espectrofotómetro? ¿Para que se realiza un barrido espectral en un
espectrofotómetro? Realice un cuadro comparativo entre control decentro de banda y
barrido espectral.

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