UNIVERSIDAD ESTATAL DE BOLIVAR

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS RECURSOS NATURALES Y DEL

AMBIENTE

CARRERA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME DE VISITA DE CAMPO

TITULO:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL HONGO
SHIITAKE (LENTINULA EDODES), CULTIVADO EN RESIDUOS
LIGNOCELULÓSICOS

AUTOR
JORDANI EDUARDO SANABRIA HINOJOZA

DIRECTOR DEL PROYECTO:

DRA. MARÍA BERNARDA RUILOVA CUEVA. PHD

BIOMETRISTA:
ING. DANILO MONTERO

REDACCION TECNICA:
ING SONIA SALAZAR

FECHA
30 DE ENERO DEL 2018
I. INTRODUCCIÓN

El consumo de hongos comestibles y medicinales ha sido una práctica común desde hace
miles de años en la cultura oriental, aunque se sabía de sus propiedades para mantener y
mejorar la salud, solo hasta hace unos pocos años estudios científico han verificado esta
información (Pérez 2016). En la actualidad, el desarrollo de nuevos productos elaborados a
base de hongos comestibles representa una industria que está en pleno auge. Desde el punto
de vista medicinal todos los macrohongos contienen metabolitos secundarios biológicamente
activos con propiedades terapéuticas y antimicrobianas dependiendo de la variedad de hongo
(González et al. 2014)..

Para la obtención de productos con interés farmacológico generalmente se utilizan extractos

de cuerpos fructíferos completos, partes de ellos, micelio obtenido en cultivo líquido o
sustancias asiladas directamente de ambos. Los extractos son preparados por contacto con
solventes adecuados por medio de maceración o destilación de los carpóforos secos, frescos
o del micelio. Frecuentemente estos compuestos naturales sirven para la preparación de una
gran variedad de derivados. Actualmente entre el 80 y 85 % de todos los productos
medicinales de los hongos son derivados de los cuerpos fructíferos, los cuales han sido
producidos comercialmente o colectados de hongos silvestres,

Las especies de Pleurotus y Lentinula producen sustancias bioactivas que exhiben

actividades antibacterianas, anticolesterólicas, antioxidantes, antitumorales,
antiinflamatorias e inmunoestimuladoras (González et al. 2014).

Las setas del Lentinula edodes se caracterizan por contener compuestos bioactivos con
propiedades antimicrobianas (Rao et al. 2009), por lo que resulta de mucho interés realizar
un estudio para determinar la actividad antimicrobiana de los metabolitos secundarios
presentes en este tipo de hongos, que le permiten retardar o inhibir completamente el
crecimiento de microorganismos patógenos encontrados en productos alimenticios
II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Determinar la actividad antimicrobiana del hongo Shiitake (Lentinula edodes sbp), cultivado
en residuos lignocelulósicos.

2.2. Objetivos específicos

 Caracterizar la composición físico-química de los sustratos (lignocelulósicos) en donde

se cultivará el hongo Lentinula edodes: aserrín de eucalipto, bagazo de caña de azúcar,
cascarilla de arroz y salvado de trigo (fuente nitrogenada)

 Evaluar la producción utilizando dos porcentajes de salvado de trigo como fuente

nitrogenada, en cada una de los tratamientos mediante indicadores de productividad
(formación de primordios, tamaño del sombrero, peso del hongo fresco y eficiencia
biológica)

 Desarrollar una metodología para la obtención del extracto del hongo e identificar sus
componentes con actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas (E. coli,
salmonella, listeria, y helicobacter).
III. HIPÓTESIS

Ho = Los extractos obtenidos a partir del hongo Lentinula edodes utilizando diferentes
disolventes presentarán actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas.

Hi = Los extractos obtenidos a partir del hongo Lentinula edodes utilizando diferentes
disolventes no presentarán actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas.
 IV. MARCO METODOLÓGICO

5.1. Ubicación del experimento

El presente trabajo investigativo se realizó en el Laboratorio de Investigación de la

Universidad Estatal de Bolívar.

5.1. Materiales

Material experimental
Hongos Lentinula edodes.
Disolventes (Cloroformo, etanol, acetato de etilo, solución de 50% de agua con 50% de
etanol).
Bacterias patógenas (E. coli, Listeria, salmonella).

Aditivos y sustratos
Muller-Hinton Agar

Equipos y materiales

 Autoclave
 Cámara de flujo laminar
 Frasco ámbar de vidrio
 Centrífuga termoregulable
 Tubos para centrífuga.
 Balanza Digital
 Calibrador de vernier
 Agitador Vortex
 Hisopos estériles
Material de laboratorio

 Material de vidrio  Material de acero  Material personal

Cajas Petri Mechero Bunsen Guantes

Tubos con tapa rosca Pinzas Alcohol antiséptico
Matraz 500 ml Bisturí Mascarilla
Pipeta de 10 ml Asa bacteriológica Mandil
Vasos de precipitación Espátula
Embudo
Probeta graduada

5.2. Métodos

Factores de estudio

Para el presente estudio se utilizaron dos factores en estudio, factor a: Estípe y Píleo del
hongo Lentinula edodes; factor b: tipos de disolventes

Tabla N° 1. Factores en estudio

FACTOR CÓDIGO COMBINACIONES

Extracto del hongo a a1= Estipe
Lentinula edodes a2= Píleo

Disolventes b b1= Cloroformo

b2= Etanol
b3= Acetato de etilo
b4= 50% etanol + 50% de agua
Fuente: Sanabria, Ruilova 2107.
Esquema del experimento
A continuación se describe las combinaciones A x B
Tabla N° 2. Esquema del Experimento

TRATAMIENTO CÓDIGO DESCRIPCIÓN

1 a1b1
2 a1b2
3 a1b3
4 a1b4
5 a2b1
6 a2b2
7 a2b3
8 a2b4
Fuente: Sanabria, Ruilova 2107.
Estipe del Lentinula + Cloroformo
Estipe del Lentinula + Etanol
Estipe del Lentinula + Acetato de Etilo
Estipe del Lentinula + 50% de etanol + 50% agua
Píleo del Lentinula + cloroformo
Píleo del Lentinula + Etanol
Píleo del Lentinula + Acetato de Etilo
Píleo del Lentinula + 50% de etanol + 50% agua

Características del experimento

Unidad experimental = 100 ml de disolvente y 15 g de hongo

Tratamientos= 8
Repeticiones= 3
Unidades experimentales= 24

5.3. Mediciones Experimentales

Se realizaron análisis al hongo cultivado y se tomaron muestras para la evaluación
antimicrobiana.

Humedad
Se procedió con la técnica determinada por la norma (AOAC925.10).

Cenizas
La medición de los valores de cenizas en los hongos utilizados en la investigación; se efectuó
con la técnica determinada por la norma (AOAC923.03).
Fibra
Se determinó la fibra presente en el Píleo y Estipe por la norma INEN 522

Grasa
La medición de los valores de cenizas en los hongos utilizados en la investigación; se efectuó
con la técnica determinada por la norma NTE INEN-ISO11085

Carbono
Se determinó el carbono presente en el Píleo y Estipe por medio del Analizador elemental.

Nitrógeno
Se determinó el nitrógeno presente en el Píleo y Estipe por medio del método DUMAS
(Analizador elemental)

Contenido de Proteína en el hongo (CPH)

Según la metodología DUMAS

Análisis Antimicrobiano
Se realizó por antibiograma de discos metodología de Kirby-Bauer.

5.4. Manejo del experimento

Siembra y recolección de hongos

 Se utilizaron residuos como: aserrín, bagazo de caña, cascarilla de arroz y salvado de trigo.
 Los materiales secos fueron picados e hidratados en agua por un tiempo aproximado de
8-12 horas, hasta alcanzar una humedad de 70-75 %. Se escurrió el exceso de agua y se
esterilizó en autoclave a 121 °C por 45 min.
 La siembra se la realizó en la cámara de flujo laminar utilizando fundas de polietileno
transparente de 40 x 60 cm, inoculando el 4 % de semilla de Lentinula en relación al
sustrato húmedo. Se perforó las bolsas en forma longitudinal y en el fondo. Posteriormente
se comprimirá el sustrato y procederá a serrar las bolsas utilizando hilo plástico (piola).
 Se incubaron las bolsas en la oscuridad a la temperatura ambiente, se realizarán
monitoreos permanentes y registrará la temperatura y la humead relativa.
 Cuando los sustratos estuvieron completamente colonizados (coloración blanco
algodonosa), se los trasladaron al cuarto de fructificación.
 Se realizó la cosecha de los hongos con la ayuda de una navaja estéril.

Preparación de Extractos

Método por Maceración

Preparación de las muestras:

 Los carpóforos de hongo Lentinula edodes fueron deshidratados y pulverizados.

 Se pesó 15 gramos en 100 ml de disolvente (Cloroformo, Etanol, Acetato de etilo, y
solución de 50% agua + 50% etanol).
 Se envasaron los extractos en frascos ámbar de vidrio y se almacenaron en un lugar libre
de la luz a temperatura ambiente por un periodo de 6 días. Realizó una agitación por día.
 Con el objetivo de separar el fluido de los sólidos presentes en los extractos macerados,
se colocaron las muestras en tubos para centrífuga.
 Se centrifugó a 8000 rpm a una temperatura de 5°C por 20 min.
 Se tamizó utilizando papel filtro.
 Los extractos obtenidos se almacenaron en refrigeración en frascos ámbar de vidrio.

Antibiograma de Disco (TÉCNICA DE KIRBY-BAUER)

Preparación del medio de cultivo Muller-Hinton Agar, el cual se preparó de la siguiente

manera:

 Se preparó el medio de acuerdo con las instrucciones de la casa manufacturadora.

 Se ajustó su pH a 7.3 con solución de NaOH 0.1N (el agar Muller Hinton comercial viene
con un pH de ya ajustado según las especificaciones de la etiqueta.
 Se pesó 38 gramos de Muller Hinton Agar por litro de agua destilada (según
especificaciones en la etiqueta).
 Se calentó la solución hasta ebullición de 3 a 5 min., cuidando que no se derrame.
 Se esterilizó en autoclave a una temperatura de 121 "C por 15 minutos.
 Se dejó reposar hasta una temperatura entre los 48 y 50°C.
 Se distribuyó el medio en cantidad aproximada entre 25-30 cc en cajas de Petrí estériles.
 Se dejó solidificar el agar en las cajas a temperatura ambiente en la cámara de flujo
laminar.

Con la finalidad que no existen gotas de agua de condensación sobre la superficie del medio
o sobre las tapas de las cajas de Petri se enfrió a 35°C aproximadamente antes de colocarle
la tapa

Preparación del Inoculo

Se seleccionó 4 colonias de las bacterias aisladas (cultivo puro), No se utilizaron cultivos de

más de 24 horas.

Se transfirió las colonias tocando la parte superior de cada una con un Aza bacteriológica a
un tubo que contenía 9 ml de solución salina al 1%, se agitó en una agitador vortex hasta
obtener una turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de McFarland.

Preparación de los discos para realizar el antibiograma

 En tubos eppendorf estériles (Autoclavado a 121°C por 15min), se colocó 1 ml de la

muestra de extracto (los extractos se prepararon para cada tratamiento).
 En los tubos con el extracto, se adicionó los discos en blanco (Oxoid ltd)(antimicrobial
susceptibility test discs) dejando reposar por 15 min.

Siembra de la muestra

 Se Sumergió un aplicador de algodón estéril, dentro del tubo de ensayo (solución salina)
que contenía la suspensión del microorganismo en estudio.
 Se colocó el aplicador por encima del nivel del contenido del tubo y se rotó contra las
paredes del mismo para remover el exceso del inóculo.
 Se tomaron las cajas Petri que contienen el Muller Hinton Agar y con el aplicador hacer
la siembra en tres direcciones.
 Se dejó secar la superficie del medio sembrado durante 5 a 10 min manteniendo la caja
con la tapa cerrada.
 Se colocaron los discos humedecidos con el extracto sobre la superficie del agar con un
dispensador o con pinzas estériles; con éstas presionar los discos ligeramente sobre el agar
para asegurar un contacto uniforme.
 Se colocaron 6 discos en la periferia dejando entre disco y disco un espacio uniforme
(aproximadamente de 2 cm.); para evitar que las zonas de inhibición queden imbricadas.
 Los discos con antibióticos se colocaron en la parte central.
 Se Incubaron las cajas a 37° C por 12 horas.
 Se leyeron las cajas después de las 18 y 24 horas de incubación.

Medición de los halos de inhibición

Se midió en milímetros el diámetro de la zona de inhibición con un calibrador Pie de Rey de

cada disco.

V. Resultados y Discusión

Resultados de la caracterización físico-química del hongo L. edodes

Resultados de humedad Resultados del Nitrógeno

Partes del hongo % de Humedad Partes del hongo % de Nitrógeno

Estipe 82 Estipe 5.93

Píleo 87 Píleo 5.05

Resultados de Cenizas Resultados del Proteína

Partes del hongo % de Cenizas Partes del hongo % de Proteína

Estipe 6,0 Estipe 33.80

Píleo 5,4 Píleo 28.80

Resultados del Fibra Resultados del carbono
Partes del hongo % de Fibra Partes del hongo % de Carbono

Estipe 6,8 Estipe 42.01

Píleo 2,3 Píleo 39.98

Resultados del Grasa

Partes del hongo % de Grasa

Estipe 1,43

Píleo 1,23

Resultados del desarrollo de la metodología para la obtención de extractos

La metodología que se utilizó en la obtención de extractos en hongo fresco es:
 Deshidratación
 Molturación
 Disolución en solventes
 Maceración
 Centrifugación
 Tamización
 Resultados de la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos, mediante la
técnica de Kirby-Bauer frente a bacterias patógenas (E. coli, salmonella y listeria).

Resultados de las pruebas antimicrobianas

LISTERIA
Mediciones de los halos de inhibición (cm)
Estipe del hongo L. edodes Píleo del hongo L. edodes Antibióticos

Clororoformo Etanol Etanol + Agua Acetato de Etilo Clororoformo Etanol Etanol + AguaAcetato de Etilo PENICILINA CIPROFLOXACINA
Rep 1 3 7 4 2 3 5 4 2 9 1
Rep 2 2 6 4 2 2 5 4 2 10 1
Rep 3 3 6 4 2 3 5 4 2 9 1

Salmonella
Mediciones de los halos de inhibición (cm)
Estipe del hongo L. edodes Píleo del hongo L. edodes Antibióticos
Clororoformo Etanol Etanol + Agua Acetato de Etilo Clororoformo Etanol Etanol + AguaAcetato de Etilo PENICILINA CIPROFLOXACINA
Rep 1 3 5 3 1 3 4 3 1 2 16
Rep 2 1 4 2 1 3 4 3 2 1 14
Rep 3 4 4 2 3 1 5 3 1 1 20

E. Coli
Mediciones de los halos de inhibición (cm)
Estipe del hongo L. edodes Píleo del hongo L. edodes Antibióticos
Clororoformo Etanol Etanol + Agua Acetato de Etilo Clororoformo Etanol Etanol + AguaAcetato de Etilo PENICILINA CIPROFLOXACINA
Rep 1 1 3 2 1 2 2 1 2 0 11
Rep 2 1 4 1 1 2 3 2 1 0 14
Rep 3 2 5 2 2 1 3 2 3 1 17
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ANEXOS

FOTOS:
Incubación del Shiitake en fundas oscuras

Inicio de la colonización Colonizacion completa del sustrato

Oscurecimiento del sustrato y aparicion de primordios

Cosecha y medicion y pesado del micelio del hongo

PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS

Secado y selección de las partes del hongo Lentinula edodes

Pulverizado y pesado de las muestras de hongo

Filtrado y envasado del extracto

ANTIBIOGRAMA DE DISCO (TÉCNICA DE KIRBY-BAUER)

Preparacion del Agar Muller-Hinton
Siembra de los microorganismos patogenos en Agar Muller-Hinton

Rotulacion de las cajas de Petri e incubación

Medición de los halos de inhibición
 ____________________________________
Ing. Marcelo García MsC.
Presidente de la Unidad de titulación

_____________________________________
Dr. Bernarda Ruilova
Directora del Proyecto de Investigación

_____________________________________
Ing. Danilo Montero
Biometrista del Proyecto de Investigación

_____________________________________
Ing. Sonia Salazar
Redacción Técnica del Proyecto de Investigación