Anda di halaman 1dari 14

Bovine Estrogens (ES) ELISA Kit

1. Introduksi
Kit ELISA Sandwich Kuantitatif ini hanya untuk digunakan dalam penelitian in vitro saja, bukan
untuk obat, rumah tangga, terapeutik atau diagnostik aplikasi! Kit ini dimaksudkan untuk
digunakan untuk menentukan tingkat ES (selanjutnya disebut "analit") dalam Bovine asli yang
tidak dilarutkan. cairan tubuh, homogenat jaringan, sekresi atau sampel tinja. Kit ini TIDAK
cocok untuk menguji sumber non-biologis zat.

2. Pertunjukan
Sensitivitas: Sensitivitas kit ini adalah 1.0pg / ml.
Rentang Deteksi: Rentang deteksi kit ini adalah 3.12pg / ml-100pg / ml.
Kekhususan: Tidak ada reaktivitas silang yang signifikan atau interferensi antara analit dan
analog ini diamati.
Reprodusibilitas: CV Intra-assay (%) dan CV Inter-assay (%) kurang dari 15%. [CV (%) = SD /
mean × 100].

3. Bahan yang Disediakan

Catatan: Gradien konsentrasi Standar dari SVI ke SI diikuti oleh: 100,50,25,12.5,6.25,3.12pg /


ml.

4. Bahan Yang Diperlukan tetapi Tidak Disediakan


4.1) Air suling atau air deionisasi.
4.2) Kertas penyerap atau serbet kertas.
4.3) Pipet dan tip pipet sekali pakai.
4.4) Pembaca ELISA mampu mengukur absorbansi pada 450 nm.
4.5) Inkubator suhu konstan yang dapat memberikan kondisi inkubasi stabil hingga 37 ° C ± 0,5
° C.

5. Tindakan pencegahan
5.1) Dibatasi oleh keterampilan dan pengetahuan saat ini, tidak mungkin bagi kita untuk
menyelesaikan deteksi lintas-reaktivitas antara analit ini dan semua itu analog, oleh karena itu,
reaksi silang mungkin masih ada di spesies atau bahan lain.

5.2) Dipengaruhi oleh faktor-faktor termasuk viabilitas sel, jumlah sel dan juga waktu
pengambilan sampel, sampel dari supernatan sel budaya TIDAK cocok untuk dideteksi oleh kit
ini.

5.3) Reagen dan piringan kit ini dan parameter desain teknisnya hanya cocok dan dirancang
untuk optimal kinerja untuk sampel asli murni dalam pengujian ini, dan karena kemungkinan
ketidakcocokan antara antigen / antibodi dari pabrikan lain dan antibodi / antigen yang
digunakan dalam kit ini (seperti perbedaan dalam epitop konformasi yang dilapisi oleh bahan
kimia lingkungan atau perbedaan dalam epitop linear, dan seterusnya), protein yang diekstraksi
atau protein rekombinan TIDAK cocok untuk dideteksi oleh ini kit, dan tolong jangan mengganti
reagen dari satu kit ke kit lain dan hanya menggunakan reagen yang disediakan oleh produsen,
dan terlebih lagi, kami TIDAK akan bertanggung jawab untuk menggunakan kit ini atau bagian
dari kit ini untuk melakukan eksperimen lain (seperti blot barat, imunohistokimia, spike /
recovery dan sebagainya) secara sewenang-wenang.

5.4) Setiap kit telah benar-benar lulus tes Q.C. Namun, hasil dari pengguna akhir mungkin tidak
konsisten dengan data internal kami karena beberapa kondisi transportasi atau penyimpanan
yang tidak terduga, atau suhu lingkungan yang berbeda, peralatan laboratorium, operasi,
pemipaan, pencucian, suhu inkubasi atau waktu, dan usia kit. Varians pengujian di antara sumur
atau kit mungkin juga muncul dari faktor-faktor ini.

5.5) Kit dari produsen yang berbeda dengan barang yang sama mungkin menghasilkan hasil yang
berbeda, karena produsen yang berbeda dapat menggunakannya antigen atau antibodi yang
berbeda, dan proses produksi.

5.6) Solusi Berhenti yang disarankan untuk menggunakan kit ini adalah larutan asam, jadi harap
cukup memperhatikan keamanan saat menggunakannya. Serum dan plasma harus ditangani
sebagai berpotensi berbahaya dan mampu menularkan penyakit. Sarung tangan sekali pakai
harus dipakai selama prosedur pemeriksaan, karena tidak ada metode tes yang diketahui dapat
menawarkan jaminan lengkap bahwa produk yang berasal dari darah tidak akan menular agen.
Oleh karena itu, semua turunan darah harus dianggap berpotensi menular dan praktik
laboratorium yang baik harus diikuti.
6. Pengumpulan dan Penyimpanan Sampel
6.1) Serum - Serum sentrifugal selama kurang lebih 20 menit pada 1000 × g (atau 3000 rpm)
dalam 30 menit setelah pengumpulan. Mengumpulkan supernatan dengan hati-hati, uji segera
atau simpan sampel pada -20 ° C atau -80 ° C. Hindari siklus pembekuan / pencairan berulang.
6.2) Plasma - Kumpulkan plasma menggunakan EDTA atau heparin sebagai antikoagulan.
Sampel sentrifugal selama sekitar 20 menit 1000 × g (atau 3000 rpm) dalam 30 menit setelah
pengumpulan. Kumpulkan supernatan secara hati-hati, uji segera atau simpan sampel di -20 ° C
atau -80 ° C. Hindari siklus pembekuan / pencairan berulang.

6.3) Darah - Kumpulkan darah menggunakan EDTA atau heparin sebagai antikoagulan. Sampel
sentrifugal selama kurang lebih 15 menit pada 1500 × g (atau 5000 rpm) dalam 30 menit setelah
pengumpulan. Kumpulkan supernatan secara hati-hati, uji segera atau simpan sampel pada -20 °
C atau -80 ° C. Hindari siklus pembekuan / pencairan berulang.

6.4) Cairan Tubuh Lainnya (Cairan Limfatik dan Cairan Serebrospinal) - Sampel Centrifuge
selama kurang lebih 20 menit pada 1000 × g (atau 3000 rpm) dalam 30 menit setelah
pengumpulan. Kumpulkan supernatan secara hati-hati, uji segera atau simpan sampel pada -20 °
C atau -80 ° C. Hindari siklus pembekuan / pencairan berulang.

6.5) Tissue homogenates - Pembuatan homogenat jaringan akan bervariasi tergantung pada jenis
jaringan. Hapus kelebihan darah dan ditimbang sebelum homogenisasi. Giling jaringan menjadi
potongan kecil dan dihomogenisasi dalam jumlah tertentu PBS (Biasanya 10mg jaringan ke
100μl PBS.). Setelah itu, sentrifugasi homogenat selama kurang lebih 15 menit pada 1500 × g
(atau 5000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan hati-hati, uji segera atau simpan sampel pada -
20 ° C atau -80 ° C. Hindari siklus pembekuan / pencairan berulang.

6.6) Sekresi (Saliva, Urin, Cairan Synovial dan sebagainya) - Sampel sentrifus selama sekitar 20
menit pada 1000 × g (atau 3000 rpm) dalam 30 menit setelah pengumpulan. Kumpulkan
supernatan secara hati-hati, uji segera atau simpan sampel pada -20 ° C atau -80 ° C. Hindari
siklus pembekuan / pencairan berulang.

6.7) Feses - Kumpulkan dan sampel yang benar-benar mengguncang dalam jumlah tertentu PBS
(Biasanya 10mg jaringan sampai 100μl PBS.). Setelah itu, sentrifugasi homogenat selama sekitar
20 menit pada 1500 × g (atau 5000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan hati-hati, uji segera atau
simpan sampel pada -20 ° C atau -80 ° C. Hindari siklus pembekuan / pencairan berulang.

6.8) Catatan Penting:


6.8.1) Meskipun kami telah mendaftarkan sebagian besar sampel yang mungkin, tetapi ini
TIDAK berarti analit ada di semua contoh yang terdaftar ini, karena beberapa analit hanya ada di
beberapa organel, sel, atau jaringan tertentu.

6.8.2) Kami hanya bertanggung jawab untuk kit itu sendiri, tetapi tidak untuk sampel yang
dikonsumsi selama pengujian. Pengguna harus menghitung kemungkinan jumlah sampel yang
digunakan dalam seluruh tes. Harap pastikan bahwa sampel yang cukup tersedia.
6.8.3) Sampel segar tanpa penyimpanan lama direkomendasikan untuk pengujian. Jika tidak,
degradasi protein dan denaturisasi dapat terjadi pada sampel tersebut dan akhirnya mengarah
pada hasil yang salah. Sampel yang akan digunakan dalam 5 hari dapat disimpan pada 2-8 ° C,
sebaliknya sampel harus disimpan pada -20 ° C (≤ satu bulan) atau -80 ° C (≤ dua bulan) untuk
menghindari hilangnya bioaktivitas dan kontaminasi. Hindari diulang membekukan / mencairkan
siklus.

6.8.4) Sampel yang dikenai hemolisis secara kasar tidak cocok untuk digunakan dalam pengujian
ini, sehingga sampel harus disentrifugasi secara adekuat dan tidak ada hemolisis atau granul
diizinkan.

6.8.5) Kit tidak dapat menguji sampel yang mengandung natrium azida (NaN3), karena NaN3
akan menghambat aktivitas lobak peroksidase (HRP).

6.8.6) Jika sampel tidak ditunjukkan dalam manual, percobaan awal untuk menentukan validitas
kit ini diperlukan.

7. Reagen Persiapan dan Penyimpanan


Tolong simpan plate dan semua reagen pada 2 ° C-8 ° C.
7.1) Jangka waktu yang valid dari kit ini adalah enam bulan pada 2 ° C-8 ° C. Paket tidak boleh
digunakan setelah tanggal kedaluwarsa.

7.2) Solusi Cuci (1 ×) - Encerkan satu volume Larutan Cuci (20 ×) dengan sembilan belas
volume air terionisasi atau air suling. Diluted Solusi Cuci stabil selama satu bulan pada 2 ° C-8 °
C. Solusi Pencucian yang Tidak Dicuci dan pereaksi lainnya stabil selama enam bulan pada 2 °
C-8 ° C.

7.3) Ketika kit dibuka, silakan gunakan semua Microelisa Stripplate sesegera mungkin setelah
mengeluarkan plate dari kantong foil. The Microelisa Stripplate dapat dilepas, jadi harap
kembalikan sumur yang tidak digunakan ke kantong foil yang berisi paket pengering, dan saring
ulang sepanjang tepian zip-seal untuk mencegah damps. Pereaksi yang tersisa masih perlu
disimpan pada 2 ° C-8 ° C.

8. Prosedur Pengujian
Silakan periksa semua reagen dan peralatan sebelum percobaan dan pastikan semuanya benar
dan baik!
Harap lakukan eksperimen secara ketat untuk mengikuti prosedur pengujian dan JANGAN
mengubah prosedur pengujian apa pun secara sewenang-wenang!
8.1) Bawa semua reagen dan sampel ke suhu kamar (18 °C-25 °C) pada suhuh ruangan selama
30 menit sebelum memulai prosedur pengujian. Jangan megunakan air panas untuk mencairkan
sampel atau reagen. Jika perlu, lakukan sentrifugasi berkecepatan rendah selama satu atau dua
detik untuk mengendapkan ke bagian bawah botol. The Microelisa Stripplate dilepas, lepaskan
strip yang tidak terpakai dari plat frame, kembalikan ke kantong alumium foil dengan pak
pengering, dan tutup kembali untuk mencegah kelembaban.
8.2) Set Sumur standar, Sumur sampel dan Sumur Kontrol, tambahkan Standar 50μl ke setiap
Sumur dengan baik, tambahkan Sampel 50μl pada tiap-tiap sampel, tambahkan Sample Diluent
50μl ke setiap kontrol dengan baik. Dianjurkan agar semua Standar, sampel dan Sampel
Pengencer menjadi ditambahkan pengulangan ke plate.

8.3) Tambahkan 100μl pereaksi HRP-konjugat ke masing-masing sumur, tutup dengan Membran
Pelapisan Penutupan dan inkubasi selama 60 menit pada 37 °C.

8.4) Cuci pale sebanyak 4 kali.


8.4.1) Pencucian Manual - Tuang campuran inkubasi dari sumur ke dalam bak cuci atau wadah
limbah yang tepat. Menggunakan pipet atau menyemprotkan botol, isi masing-masing dengan
baik dengan Wash Solution (1 ×), setelah satu menit didiamkan, balikkan dan tekan palte ke
penyaring kertas atau tisu sampai tidak ada uap air yang muncul. Ulangi prosedur ini sebanyak
empat kali.
Catatan: Pegang sisi bingkai plat dengan kuat saat mencuci piring untuk memastikan bahwa
semua strip tetap aman dalam bingkai.

8.4.2) Pencucian Otomatis - Kosongkan tempatnya /sumur, lalu cucilah piring empat kali
menggunakan Wash Buffer (1 ×). Selalu Pastikan mesin cuci benar-benar kosong dari cairan dan
atur volume isian pada 350μl / well / wash. Setelah pencucian akhir, balikkan plate, dan
keringkan dengan memukul plate ke kertas atau tisu/sabret sampai tidak ada uap air yang
muncul.

8.5) Tambahkan Solusi Chromogen A 50μl dan Chromogen Solution B 50μl secara berurutan.
Kemudian hindarkan dari cahaya dan di inkubasi selama 15 menit pada 37 ° C.

8.6) Tambahkan 50μl Stop Solution ke setiap sumur. Warna di dalam sumur harus berubah dari
biru menjadi kuning.

8.7) Bacalah kepekatan (O.D.) pada 450 nm menggunakan pembaca ELISA selama 15 menit
setelah penambahan Stop Solution (Sekitar 5 menit adalah waktu terbaik.).

8.8) Catatan Penting :


8.8.1) Lindungi semua reagen dari cahaya langsung selama penyimpanan dan inkubasi. Semua
tutup botol reagen harus tertutup rapat untuk mencegah penguapan dan kontaminasi
mikroorganisme.

8.8.2) Jangan pisahkan palte dari kantong aluminium foil sebelum digunakan. Mungkin ada
beberapa substansi berkabut di dalam sumur ketika pelat itu dibuka pada saat pertama. Ini tidak
akan berpengaruh pada hasil uji akhir.

8.8.3) Gradien konsentrasi Standar kit ini telah mencakup lebih dari kisaran konsentrasi ini analit
dalam sampel asli, jadi jangan mengunakan sampel yang tidak asli saat menggunakan kit kami,
silakan uji sampel asli murni langsung, jika tidak sampel yang disiapkan oleh buffer kimia lisis
dapat menyebabkan hasil yang tidak diharapkan atau terkontaminasi, dan terlebih lagi, tingkat
analit ini yang telah diencerkan dapat keluar dari jangkauan deteksi kit.
8.8.4) Sampel Pengencer lebih dari PBS, itu juga mengandung sedikit pentabil dan pengawet. Ini
dibuat dengan baik sebagai Kosong / Kontrol reagen (nilai nol yang disesuaikan) untuk
percobaan, karena Standar juga mengandung sedikit penstabil dan pengawet, jadi jangan
menggunakan PBS anda sendiri atau reagen lain sebagai reagen Blank / Control, bahkan jika
anda anda telah menggunakan PBS anda sendiri untuk mengumpulkan sampel anda.

8.8.5) Penambahan Sampel atau Reagen: Harap dengan hati-hati menambahkan sampel ke sumur
dan aduk dengan lembut agar tidak berbusa. Jangan sentuh dinding well. Untuk setiap langkah
dalam prosedur, total waktu pengeluaran untuk penambahan reagen atau sampel ke pelat uji
harus tidak melebihi 10 menit. Ini akan memastikan waktu berlalu yang sama untuk setiap
langkah pemppetan, tanpa gangguan. Pengulangan semua standar dan sampel, meskipun tidak
diperlukan, tetapi dianjurkan. Untuk menghindari kontaminasi, harap gunakan tip pipet sekali
pakai untuk setiap transfer.

8.8.6) Inkubasi: Untuk memastikan hasil yang akurat, proses penutupan yang rapat selama
inkubasi sangat diperlukan. Jangan biarkan sumur terbuka dalam waktu lama di antara langkah-
langkah inkubasi. Setelah reagen ditambahkan ke strip sumur, jangan biarkan strip kering setiap
saat selama pengujian. Waktu inkubasi dan suhu harus diperhatikan. Jangan kocok saat inkubasi,
karena itu akan mempengaruhi reaksi pengikatan antigen dan antibodi jika tidak tidak dikocok
dengan rata.

8.8.7) Pelat Cuci: Prosedur pencucian sangat penting. Pengeringan yang sempurna pada setiap
langkah sangat penting untuk hasil yang terbaik. Setelah pencucian terakhir, bersihkan sisa
pencucian solusi dengan disedot/menghilangkan setiap setetes air dan sidik jari bagian bawah
plate. Pencucian yang tidak mencukupi akan menghasilkan ketidak akuratan dan pembacaan
absorbansi yang tidak tepat.

8.8.8) Pengontrolan Waktu Reaksi: Amati perubahan warna setelah menambahkan Substrat
(misalnya pengamatan sekali setiap 10 menit). Substrat harus berubah dari tidak berwarna atau
biru muda menjadi gradasi warna biru. Warna yang berubah di dalam sumur akan berubah dari
biru menjadi kuning setelah menambahkan Stop Solusi. Jika warnanya berubah menjadi hijau,
ini menunjukkan bahwa Stop Solusi belum tercampur secara menyeluruh.

8.8.9) Chromogen Solution B mudah terkontaminasi, harus tetap berwarna atau biru muda
sampai ditambahkan ke plate, hindarkan dari cahaya.
9. Perhitungan Hasil
9.1) Rata-rata pembacaan ulangan untuk setiap standar dan sampel untuk mengurangi kepekatan
optik rata-rata kontrol (VB / C).
9.2) Menggunakan perangkat lunak kurva pas profesional untuk membuat kurva standar
(biasanya sebagian besar kurva adalah linier, dan beberapa kurva adalah kuadratik atau kubik)
dan menghitung tingkat analit ini.

9.3) Catatan: Setiap variasi suhu ruangan, peralatan, operasi, pemipetan, pencucian, suhu atau
waktu inkubasi, dan umur kit/ kadar luasa dapat menyebabkan variasi hasil. Setiap pengguna
harus mendapatkan kurva standarnya sendiri.
Rat Estrogen(E) ELISA Kit

Catalog Number.
MBS703614
Untuk penentuan kuantitatif konsentrasi estrogen tikus endogenik dalam serum, plasma,
supernatan kultur sel, homogenat jaringan.

Sisipan paket ini harus dibaca seluruhnya sebelum menggunakan produk ini.

PRINSIP DARI SAAT INI

Uji ini menggunakan teknik immunoassay inhibisi enzim kompetitif. Pelat mikrotiter yang
disediakan dalam kit ini telah dilapisi sebelumnya dengan antibodi kambing-anti-kelinci. Standar
atau sampel ditambahkan ke sumur mikrotiter yang sesuai dengan antibodi spesifik untuk
estrogen terkonjugasi estrogen dan Horseradish Peroxidase (HRP). Reaksi inhibisi kompetitif
diluncurkan antara dengan estrogen berlabel HRP dan estrogen tanpa label dengan antibodi.
Larutan substrat ditambahkan ke sumur dan warna berkembang berlawanan dengan jumlah
estrogen dalam sampel. Pengembangan warna dihentikan dan intensitas warna diukur.

DETEKSI RANGE
12,5 pg / ml-1000 pg / ml.

KEPEKAAN
Dosis estrogen tikus yang terdeteksi minimum biasanya kurang dari 15,6 pg / ml. Sensitivitas
dari pengujian ini, atau Batas Deteksi Bawah (LLD) didefinisikan sebagai konsentrasi estrogen
tikus terendah yang dapat dibedakan dari nol. Itu ditentukan nilai rata-rata O.D dari 20 ulangan
dari standar nol ditambahkan oleh tiga standar deviasi mereka.

KEKHUSUSAN
Uji ini memiliki sensitivitas tinggi dan spesifisitas yang sangat baik untuk mendeteksi estrogen
tikus. Tidak ada reaktivitas silang yang signifikan atau interferensi antara estrogen tikus dan
analog yang diamati.

Catatan: Dibatasi oleh keterampilan dan pengetahuan saat ini, tidak mungkin bagi kita untuk
menyelesaikan deteksi lintas-reaktivitas antara estrogen tikus dan semua analog, oleh karena itu,
reaksi silang mungkin masih ada.

PRESISI

Intra-assay Precision (Presisi dalam pengujian): CV% <15%


Tiga sampel konsentrasi diketahui diuji dua puluh kali pada satu piring untuk menilai.
Inter-assay Precision (Precision between assays): CV% <15%
Tiga sampel konsentrasi diketahui diuji dalam dua puluh tes untuk menilai.
BATASAN PROSEDUR
 UNTUK PENGGUNAAN PENELITIAN SAJA. BUKAN UNTUK DIGUNAKAN DALAM
PROSEDUR DIAGNOSA.
 Perangkat tidak boleh digunakan di luar tanggal kedaluwarsa pada label kit.
 Jangan mencampur atau mengganti reagen dengan yang berasal dari lot atau sumber lain.
 Jika sampel menghasilkan nilai lebih tinggi dari standar tertinggi, encerkan sampel dan ulangi
pengujian.
 Setiap variasi dalam operator, teknik pipetting, teknik mencuci, waktu atau suhu inkubasi, dan
umur kit dapat menyebabkan variasi pengikatan.
 Uji ini dirancang untuk menghilangkan gangguan oleh reseptor terlarut, protein pengikat, dan
faktor lain yang ada dalam sampel biologis. Sampai semua faktor telah diuji di Immunoassay,
kemungkinan gangguan tidak dapat dikesampingkan.
MATERIAL YANG DISEDIAKAN

Reagen Kuantitas
Pelat Assay 1 (96 wells)
Standar 6 x 0.5 ml
Antibodi 1 x 6 ml
HRP-conjugate 1 x 6 ml
Cuci Buffer (20x konsentrat) 1 x 15 ml
Substrat A 1 x 7 ml
Substrat B 1 x 7 ml
Hentikan Solusi 1 x 7 ml
Adhesive Strip (Untuk 96 sumur) 4
Instruksi manual 1

KONSENTRASI STANDAR
Standart S0 S1 S2 S3 S4 S5
Konsentrasi (pg/ml) 0 12.5 62.5 187.5 375 1000

PENYIMPANAN
Kit yang belum dibuka Disimpan pada temperatur 2 – 80C. Jangan
digunakan kit yang telah kadarluasa
Kit yang telah dibuka Dapan disimpan hingga satu bulan disimpan
pada temperatur 2-80C

Asalkan ini adalah tanggal kedaluwarsa dari kit.

SUPPLIES LAINNYA DIPERLUKAN


 Microplate reader mampu mengukur absorbansi pada 450 nm, dengan panjang gelombang
koreksi ditetapkan pada 600 nm - 630 nm.
 Inkubator yang dapat memberikan kondisi inkubasi stabil hingga 37 ° C ± 0,5 ° C.
 Botol muncrat, manifold dispenser, atau pencuci piring microplate otomatis.
 Kertas penyerap untuk menyeka pelat mikrotiter.
 100 mL dan 500 mL silinder yang lulus.
 Air deionisasi atau suling.
 Pipet dan tip pipet.
 Tabung reaksi untuk pengenceran.

PENCEGAHAN
Solusi Stop yang diberikan bersama kit ini adalah larutan asam. Kenakan pelindung mata,
tangan, wajah, dan pakaian saat menggunakan bahan ini.

SAMPEL KOLEKSI DAN PENYIMPANAN


 Serum Gunakan tabung pemisah serum (SST) dan biarkan sampel membeku selama dua jam
pada suhu kamar atau semalaman pada 4 ° C sebelum sentrifugasi selama 15 menit pada 1000
x g. Hapus serum dan uji segera atau aliquot dan simpan sampel pada -20 ° C atau -80 ° C.
Hindari siklus freeze-thaw berulang.
 Plasma Kumpulkan plasma menggunakan EDTA, atau heparin sebagai
antikoagulan.Centrifuge selama 15 menit pada 1000 × g pada 2-8 ° C dalam 30 menit
pengumpulan. Uji segera atau aliquot dan simpan sampel pada -20 ° C atau -80 ° C. Hindari
siklus freeze-thaw berulang.
 Supernasi Kultur Sel Keluarkan partikulat dengan sentrifugasi selama 15 menit pada 1000 x
g, 2 - 8 ° C dan uji segera atau alikuot dan simpan sampel pada -20 ° C atau -80 ° C. Hindari
siklus freeze-thaw berulang.
 Jaringan Homogenat Jaringan 100mg dibilas dengan 1X PBS, dihomogenisasi dalam 1 ml
PBS 1X dan disimpan semalam pada -20 ° C. Setelah dua siklus pembekuan-beku dilakukan
untuk memecah membran sel, homogenat disentrifugasi selama 5 menit pada 5000 x g, 2 - 8 °
C. Supernate dihapus dan segera diuji. Sebagai alternatif, aliquot dan simpan sampel pada -20
° C atau -80 ° C. Centrifuge sampel lagi setelah dicairkan sebelum pengujian. Hindari siklus
freeze-thaw berulang.

Catatan:
1. Pemasok hanya bertanggung jawab untuk kit itu sendiri, tetapi tidak untuk sampel yang
dikonsumsi selama pengujian. Pengguna harus menghitung jumlah sampel yang mungkin
digunakan dalam seluruh pengujian. Harap simpan sampel yang memadai terlebih dahulu.
2. Sampel yang akan digunakan dalam 5 hari dapat disimpan pada 2-8 ° C, sebaliknya sampel
harus disimpan pada -20 ° C (≤1month) atau -80 ° C (≤2month) untuk menghindari hilangnya
bioaktivitas dan kontaminasi.
3. Sampel yang dikenai hemolisis secara kasar tidak cocok untuk digunakan dalam pengujian
ini.
4. Jika sampel tidak ditunjukkan dalam manual, percobaan awal untuk menentukan validitas kit
diperlukan.
5. Silakan memprediksi konsentrasi sebelum pengujian. Jika nilai untuk ini tidak dalam kisaran
kurva standar, pengguna harus menentukan pengenceran sampel yang optimal untuk
percobaan khusus mereka.
6. Sampel ekstraksi sel atau sel yang dibuat oleh buffer kimia lisis dapat menyebabkan hasil
ELISA yang tidak diharapkan karena dampak bahan kimia tertentu.
7. Karena kemungkinan ketidaksesuaian antara antigen dari sumber daya dan antibodi lain yang
digunakan dalam kit kami (misalnya, target antibodi epitop konformasi daripada epitop
linear), beberapa protein asli atau rekombinan dari produsen lain mungkin tidak diakui oleh
produk kami.
8. Dipengaruhi oleh faktor-faktor termasuk kelangsungan hidup sel, jumlah sel dan juga waktu
sampling, sampel dari supernatan sel budaya mungkin tidak terdeteksi oleh kit.
9. Sampel segar tanpa penyimpanan lama direkomendasikan untuk pengujian.
Jika tidak, degradasi protein dan denaturisasi dapat terjadi pada sampel tersebut dan akhirnya
mengarah pada hasil yang salah.

PERSIAPAN REAGEN
Catatan:
 Mohon gunakan wadah yang sudah dilewati untuk menyiapkan reagen.
 Bawa semua reagen ke suhu kamar (18-25 ° C) sebelum digunakan selama 30 menit.
 Air suling dianjurkan untuk digunakan untuk membuat persiapan reagen. Air atau wadah yang
terkontaminasi untuk persiapan reagen akan mempengaruhi hasil deteksi.

Cuci Buffer (1x) - Jika kristal terbentuk dalam konsentrat, hangatkan hingga suhu kamar dan
aduk dengan lembut sampai kristal benar-benar larut. Encerkan 15 ml Konsentrat Buffer Cuci
(20 x) ke dalam deionisasi atau air suling untuk menyiapkan 300 ml Buffer Cuci (1 x).

PROSEDUR PENGUJIAN

Bawalah semua reagen dan sampel ke suhu kamar sebelum digunakan. Centrifuge sampel lagi
setelah dicairkan sebelum pengujian. Dianjurkan agar semua sampel dan standar diuji dalam
rangkap dua.
1. Siapkan semua reagen dan sampel seperti yang diarahkan pada bagian sebelumnya.
2. Tentukan jumlah sumur yang akan digunakan dan masukkan sisa sumur dan desikan kembali
ke kantong dan tutup ziploc, simpan sumur yang tidak terpakai pada suhu 4 ° C.
3. Tetapkan Kosong dengan baik tanpa solusi apa pun.
4. Tambahkan 50μl Standar atau Sampel per sumur. Uji kebutuhan standar dalam rangkap dua.
5. Tambahkan 50μl HRP-konjugasi ke setiap sumur (jangan sampai kosong dengan baik),
kemudian 50μl Antibodi untuk masing-masing dengan baik. Aduk rata dan kemudian inkubasi
selama satu jam pada 37 ° C.
6. Aspirasi masing-masing dengan baik dan cuci, ulangi proses dua kali dengan total tiga kali
mencuci. Cuci dengan mengisi setiap sumur dengan Wash Buffer (200μl) menggunakan botol
muncrat, pipet multi-saluran, manifold dispenser, atau autowasher, dan biarkan selama 10
detik, keluarkan cairan lengkap pada setiap langkah sangat penting untuk kinerja yang baik.
Setelah pencucian terakhir, bersihkan sisa Buffer yang tersisa dengan aspirasi atau decanting.
Balikkan piring dan bersihkan dengan serbet kertas yang bersih.
7. Tambahkan 50μl Substrat A dan 50μl dari Substrat B ke setiap lubang, aduk rata.
Inkubasi selama 15 menit pada 37 ° C. Jauhkan piring dari draf dan fluktuasi suhu lainnya
dalam gelap.
8. Tambahkan 50μl Stop Solution ke setiap sumur, tekan dengan lembut pelat untuk memastikan
pencampuran menyeluruh.
9. Tentukan kerapatan optik setiap sumur selama 10 menit, dengan menggunakan pembaca
lempeng mikro set ke 450 nm.
catatan:
1. Hasil eksperimen akhir akan terkait erat dengan validitas produk, keterampilan operasi
pengguna akhir dan lingkungan eksperimental.
2. Sampel atau reagen tambahan: Harap hati-hati menambahkan sampel ke sumur dan aduk
dengan lembut untuk menghindari berbusa. Jangan menyentuh dinding sumur sebaik
mungkin. Untuk setiap langkah dalam prosedur, total waktu pengeluaran untuk penambahan
reagen atau sampel ke pelat uji sebaiknya tidak melebihi 10 menit. Ini akan memastikan
waktu berlalu yang sama untuk setiap langkah pemipaan, tanpa interupsi. Duplikasi semua
standar dan spesimen, meskipun tidak diperlukan, direkomendasikan. Untuk menghindari
kontaminasi silang, ubah tip pipet antara penambahan setiap tingkat standar, antara
penambahan sampel, dan antara penambahan reagen. Juga, gunakan reservoir terpisah untuk
setiap reagen.
3. Inkubasi: Untuk memastikan hasil yang akurat, adhesi sealer pelat yang tepat selama langkah
inkubasi diperlukan. Jangan biarkan sumur duduk tanpa penutup untuk waktu yang lama di
antara langkah-langkah inkubasi. Setelah reagen ditambahkan ke dalam strip sumur,
JANGAN mengoyakkan strip KERING kapan saja selama pengujian. Waktu inkubasi dan
suhu harus diperhatikan.
4. Mencuci: Prosedur pencucian sangat penting. Pengangkatan cairan lengkap pada setiap
langkah sangat penting untuk kinerja yang baik. Setelah pencucian terakhir, bersihkan sisa
Pencucian Solusi dengan aspirasi atau decanting dan keluarkan setetes air dan sidik jari di
bagian bawah piring. Pencucian yang tidak mencukupi akan menghasilkan ketepatan yang
buruk dan pembacaan absorbansi yang salah. Saat menggunakan pencuci piring otomatis,
tambahkan periode rendam 10 detik setelah penambahan buffer pencuci, dan / atau memutar
pelat 180 derajat di antara langkah pencucian dapat meningkatkan ketepatan pemeriksaan.
5. Pengendalian waktu reaksi: Amati perubahan warna setelah menambahkan Substrat (misalnya
pengamatan sekali setiap 10 menit). Substrat harus berubah dari tidak berwarna atau biru
muda menjadi gradasi warna biru. Jika warnanya terlalu dalam, tambahkan Stop Solution
terlebih dahulu untuk menghindari reaksi yang terlalu kuat yang akan mengakibatkan
pembacaan absorbansi yang tidak akurat.
6. Substrat mudah terkontaminasi. Substrat harus tetap berwarna atau biru muda sampai
ditambahkan ke piring. Harap lindungi dari cahaya.
7. Stop Solution harus ditambahkan ke piring dalam urutan yang sama dengan Substrat. Warna
yang dikembangkan di dalam sumur akan berubah dari biru ke kuning setelah penambahan
Stop Solution. Sumur yang berwarna hijau menunjukkan bahwa Solusi Stop belum dicampur
secara menyeluruh dengan Substrat.
RINGKASAN PROSEDUR PENGUJIAN
1 Siapkan reagen, sampel sebagai instruksi

2. mengatur dinding kosong tanpa solusi

3. tambah 50  standart atau sampel ke setiap sumur

4. tambah 50  HRP- konjugasi ke setiap sumur (jangan sampai kosong)

5. tambah 50  antibodi untuk masing-masing dengan baik

6. Inkubasi selama 60 menit pada suhu 370C

7. Aspirasi dan cuci 3 kali

8. tambahkan 50  Subtrat A dan 50  Subtrat B untuk masing-masing well

9. Inkubasi selama 15 menit pada suhu 370C.. lindungi dari cahaya

10. tambahkan 50  stop solution untuk setiap well. Baca pada panjang gelombang
450 nm dalam waktu 10 menit.

PERHITUNGAN HASIL
Menggunakan "Kurve Expert" profesional yang lembut untuk membuat kurva standar
direkomendasikan, yang dapat diunduh dari web kami.

Rata-rata pembacaan duplikat untuk setiap standar dan sampel dan kurangi kerapatan optik rata-
rata Kosong.
Buat kurva standar dengan mengurangi data menggunakan perangkat lunak komputer yang
mampu menghasilkan empat parameter logistic (4-PL) kurva-fit. Sebagai alternatif, buat kurva
standar dengan memplot absorbansi rata-rata untuk setiap standar pada sumbu x terhadap
konsentrasi pada sumbu y dan menggambar kurva yang paling sesuai melalui titik-titik pada
grafik. Data dapat dilinierisasi dengan memplot log dari konsentrasi estrogen versus log dari
O.D. dan garis yang paling sesuai dapat ditentukan dengan analisis regresi. Prosedur ini akan
menghasilkan kecocokan data yang memadai tetapi kurang tepat.
Jika sampel telah diencerkan, konsentrasinya dibaca dari kurva standar harus dikalikan dengan
faktor pengenceran.

Beri Nilai