36

Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

A. Pembuatan Larutan Stok
 Tris HCL 1 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g.
Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades.
Aduk campuran larutan sampai homogen, selanjutnya ditambah 4,2 ml
HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8, kemudian volume
ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan
autoklaf.
 EDTA 0,5 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang EDTA sebanyak 18,612 g dan
NaOH 2.0 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambah 80 ml aquades.
Selanjutnya, ditambahkan HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH 8,
kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan
disterilkan dengan autoklaf.
 NaCl 5 M (100 ml) : Timbang NaCl sebanyak 29,22 g. Masukkan
kedalam Erlenmeyer dan ditambahkan aquades hingga larutan mendekati
100 ml dan diaduk. Kemudian volume ditepatkan dengan dengan aquades
hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.

B. Pembuatan Larutan Bufer

 CTAB 2 % (100 ml)
CTAB 2 % = 2 g CTAB
20 mM EDTA = 8 ml EDTA 0,5 M pH 8.0
100 mM Tris-HCl = 10 ml Tris-HCl 1 m pH 8.0
1,4 M NaCl = 56 ml NaCl 5 M
0,2 % PVP = 2 g PVP
0,2 % β-merkaptotanol
 Buffer TAE 50 X (100 ml)
Tris = 24,2 g
Asam Asetat Glacial = 5,7 ml
EDTA 0,5 M pH 8.0 = 10 ml
Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml

Universitas Sumatera Utara

 37

 Buffer TAE 1 X (1000 ml)

Buffer TAE 50 X = 20 ml
Aquades = 980 ml
 Kloroform Isoamilalkohol 24:1 (50 ml)
Kloroform = 48 ml
Isoamilalkohol = 2 ml

Universitas Sumatera Utara

 38

Lampiran 2. Komposisi Medium Y3 yang Digunakan

Bahan Unsur Kimia Konsentrasi (mg/L)
Makro Elemen
NH4Cl 535,000
KNO3 2020,000
MgSO4.7H2O 247,000
CaCl2. 2H2O 294,000
KCL 1492,000
NaH2PO4 312,000
Mikro Elemen
KI 8,300
H3BO3 3,100
MnSO4. 4H2O 11,200
ZnSO4. 7H2O 7,200
CuSO4. 5H2O 0,160
CoCl2. 6H2O 0,240
NaMoO4. H2O 0,240
NiCl2 0,024
Fe2SO4. 7H2O 27,800
NaEDTA 37,300
Vitamin
Myoinositol 100.000
Piridixin HCl 0,050
Tiamin HCl 0,500
Glisin 2,000
Asam Amino
Glutamin 100,000
Gula 45000,000
Agar 8000
pH 6,0

Universitas Sumatera Utara

 39

Lampiran 3. Data Pengamatan Waktu Terbentuknya Organ (HST)

Ulangan
Konsentrasi 2,4-D
1 2 3 4 5
0 mg/L - - - - -
100 mg/L 105 - - - -
115 mg/L - - 153 - -
120 mg/L - - 120 - -
135 mg/L - - 134 - -
140 mg/L 114 - - - -

Universitas Sumatera Utara

 40

Lampiran 4. Matriks kemiripan genetik berdasarkan coefficient dice

Sampel P0 P1 P2 P3 P4 P5
P0 1.00
P1 0.55 1.00
P2 0.58 0.73 1.00
P3 0.32 0.64 0.61 1.00
P4 0.58 0.82 0.79 0.70 1.00
P5 0.50 0.64 0.73 0.58 0.70 1.00

Universitas Sumatera Utara

 41

Lampiran 5. Proses Isolasi DNA

Eksplan 0,4 g digerus dalam lumpang porselin dengan

bantuan nitrogen cair

Eksplan ditambah kedalam tabung yang berisi 1 ml buffer

ekstrasi, 2% β-merkaptoetanol dan 1% PVP

Eksplan ditambah KIAA (24:1) dan disentrifus

dengankecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit

Supernatan ditambah 1ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu

-20oC selama 1 malam

DNA diendapkan dengan penambahan 1/10 kali volume sodium

asetat dan dihomogenkan.

Supernatan dibuang sedangkan pelet diambil dan dibersihkan

dengan alkohol 70% sebanyak 2 kali

DNA divakum pada suhu 37oC selama 10 menit. DNA yang telah
kering dilarutkan dengan aquabides (ddH2O) steril

Untuk menghilangkan kontaminan RNA dari DNA dengan

menambahkan µL RNase (20 mg/ml) pada suhu 37oC selama 90 menit

RNase dinonaktifkan pada suhu 70oC selama 3 menit dan disimpan

pada suhu -20oC untuk digunakan selanjutnya

Universitas Sumatera Utara

 42

Lampiran 6. Uji Kualitas DNA

Agarose 1% ditambahkan dengan 100 ml buffer

TAE 1x

Campuran dipanaskan dengan hot plate

Campuran ditambahkan 5 µl EtBr

Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah

dipasang sisir

Gel yang telah mengeras dipindahkan kedalam chamber berisi

buffer TAE 1x

Sample dan loading dye dimasukkan kedalam sumur gel dengan

perbandingan (5:1)

Alat elektroforesis dihubungkan dengan power

supply 80 volt

Proses running dimulai selama 45 menit

Universitas Sumatera Utara

 43

Lampiran 7. Proses PCR – SSR

Komposisi Master Mix Volume 10 µl :

Go Taq® Green 5 µl

DNA template 1 µl

Primer R (10 pmol/ µl) 1 µl

Primer F (10 pmol/ µl) 1 µl

Nuclease free water 2 µl

Running PCR sebanyak 35 siklus :

Denaturasi awal 95oC 30 detik

Denaturasi 95oC 1 menit

Annealing (Suhu optimum primer) 55oC dan 58oC 30 detik

Extension 72oC 1 menit

Post Extension 72oC 5 menit

Kondisi akhir PCR 4oC Tak terbatas (∞)

Proses running dimulai selama ± 3 jam

Universitas Sumatera Utara

 44

Lampiran 8. Proses Hasil PCR – SSR

Agarose 2 gram ditambahkan dengan 100 ml buffer

TAE 1x

Campuran dipanaskan dengan hot plate

Campuran ditambahkan 5 µl EtBr

Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang

sisir

Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber

berisi buffer TAE 1x

Sampel hasil PCR dan marker dimasukkan ke dalam

sumur gel dengan perbandingan (10:5)

Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supplay

pada tegangan 70 V, 100 mA pada suhu ruang.

Proses running dimulai selama 90 menit

Universitas Sumatera Utara