Anda di halaman 1dari 4

Apa syarat kloning terjadi ?

Kloning bertujuan memperbanyak dan mengisolasi DNA yang disisipkan pada DNA vektor.
DNA disambungkan pada DNA plasmid dan molekul kimeriknya ditransformasikan ke dalam
inang, seperti E.coli. Plasmid melakukan replikasi dalam inang sewaktu inang tumbuh dan
membelah, dan potongan DNA yang diinginkan terklonkan (Russel 1980, diacu dalam
Sardjoko 1991). Kloning gen untuk mendapatkan klon tertentu dalam jumlah banyak pada
prinsipnya berguna untuk mempermudah pengujian, modifikasi dan pemanfaatan gen
tersebut.
Tahapan kloning diawali dengan cara mempersiapkan DNA target melalui proses
pemotongan dengan enzim endonuklease restriksi. Fragmen untai tunggal yang pendek
pada ujung yang dihasilkan dari pemotongan enzim restriksi diligasi ke dalam vektor yang
mengandung situs ORI (origin of replication). DNA rekombinan kemudian ditransfer ke
dalam sel inang (bakteri atau khamir). DNA ini mampu bereplikasi tanpa bergantung pada
DNA genom bakteri atau khamir. Sel inang yang berhasil ditransformasi kemudian
ditumbuhkan ke dalam media selektif (Passarge 2007).

Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil
yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono
& Widyastuti 2006). Plasmid berukuran hingga lebih dari 500 pb. Plasmid mempunyai
kemampuan untuk melakukan transfer plasmid dengan cara konjugasi (plasmid F), menyandi
ketahanan terhadap antibiotik (plasmid R), atau membawa satu set gen yang menyandikan
metabolit sekunder yang tidak biasa (plasmid degradatif) (Glick & Pasternak 2003).
Plasmid yang berupa DNA berutas ganda dan berbentuk sirkular merupakan DNA
ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri. Plasmid memiliki dua sifat istimewa yang
bermanfaat dalam manipulasi genetik. Plasmid pada umumnya tidak diperlukan dalam
pertumbuhan sel sehingga pada keadaan tertentu dapat keluar masuk tanpa membahayakan
sel tersebut. Gen asing dapat bersatu dengan plasmid secara mudah dan diangkut ke dalam
E.coli dan menjadi bagian genom sel inang (Lehninger 1994).
Semua plasmid memiliki paling sedikit satu urutan (rangkaian) DNA yang dapat bertindak
sebagai asal replikasi sehingga plasmid itu dapat memperbanyak diri di dalam sel tanpa
bergantung pada kromosom bakteri (Brown 1991). Secara umum plasmid yang baik untuk
digunakan dalam teknologi DNA rekombinan yaitu mempunyai berat molekul rendah,
mempunyai kemampuan mengekspresikan gen yang dibawanya dari inang, hanya
mempunyai sisi pemotong tunggal untuk kebanyakan endonuklease restriksi dan mempunyai
dua atau lebih penanda (marker) (Primose & Old 1989).

Marka seleki yang umum digunakan adalah gen resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin.
Gen resistensi ampisilin menyandi enzim beta laktamase yang dapat memecah molekul
ampisilin sehingga sel inang yang membawa plasmid dapat tumbuh dalam media yang
mengandung ampisilin. Gen resistensi tetrasiklin menyandi protein yang memompa molekul
tetrasiklin sehingga meniadakan efek toksik tetrasiklin (Brown 1991).

Plasmid pGEM-T easy merupakan vektor yang biasa dimanfaatkan untuk kloning produk
PCR. Plasmid pGEM-T easy mengandung gen resistensi terhadap antibiotika ampisilin.
Vektor pGEM-T easy mengandung gen lacZ yang menyandi β-galaktosidase yang akan
mengubah X-Gal (5-bromo-4- kloro-3- indolil-β- D-galaktosidase) dari tidak berwarna
menjadi biru. Gen lacZ yang diinduksi oleh molekul DNA lain maka lacZ ini tidak dapat
mengubah X-Gal menjadi berwarna biru. Plasmid pGEM-T easy berukuran 3015 pb dan
mengandung MCS (multiple cloning sites). Daerah restriksi ini memungkinkan lepasnya
insert/sisipan DNA melalui digesti dengan enzim restriksi tunggal, misalnya EcoRI, BstZI,
dan NotI.

Polymerase Chain Reaction (PCR)


Reaksi rantai polimerase merupakan metode untuk memperbanyak fragmen DNA yang
menjadi sasaran secara in vitro menggunakan instrumen PCR. Teknik PCR merupakan sarana
yang sensitif, selektif, dan sangat cepat untuk memperbanyak fragmen DNA yang diinginkan.
Spesifisitas reaksi ini berdasarkan pada penggunaan dua primer oligonukleotida yang
berhibridisasi menjadi rangkaian komplementer pada untai DNA yang berlawanan dan
mengapit rangkaian sasaran (Murray et al. 2003).
Komponen yang diperlukan dalam proses PCR yaitu DNA cetakan (template), primer,
enzim Taq polimerase, dan deoksinukleotida trifosfat (dNTPs). Sampel target yang
digunakan adalah DNA cetakan dari suatu organisme yang akan diamplifikasi melalui teknik
PCR. Molekul DNA cetakan yang akan diamplifikasi tidak harus mempunyai konsentrasi
tinggi karena jumlah yang dibutuhkan dalam proses PCR sangat sedikit, antara 10-100 ng
untuk setiap reaksinya (Innis & Gelfand 1990). DNA cetakan tersebut harus mengandung
daerah dan fragmen DNA yang akan diamplifikasi.
Primer adalah untai DNA pendek yang terdiri atas beberapa nukleotida, umumnya 10-
25 nukleotida (oligonukleotida). Primer berperan sebagai pemula pada proses sintesis
menggunakan PCR. Primer akan menempel pada DNA target dan membentuk rangkaian
komplementer pada untai DNA yang berlawanan serta mengapit rangkaian sasaran (DNA
cetakan). Konsentrasi primer untuk proses PCR menurut William et al. (1990) berkisar antara
0.1-0.5 μM.
Deoksinukleotida trifosfat (dNTPs) merupakan suatu nukleotida yang diperlukan
dalam proses PCR agar enzim Taq polimerase dapat membentuk kompleks rantai baru (Innis
& Gellfand 1990). Kandungan dNTPs adalah deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksisistidin
trifosfat (dCTP), deoksiguanin trifosfat (dGTP), dan deoksitimidin trifosfat (dTTP).
Deoksinukleotida trifosfat (dNTPs) akan dihubungkan terhadap primer melalui ikatan
kovalen, yaitu gugus hidroksil bebas (OH) dari primer berikatan dengan gugus fosfat dari
dNTPs.
Enzim Taq polimerase berperan dalam proses polimerisasi atau pemanjangan utas
DNA baru. Enzim ini bersifat termostabil dan diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.
Aktivitas polimerisasi DNAnya dimulai dari ujung 5’ hingga ujung 3’ dan aktivitas
enzimatiknya memiliki waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95ºC. Konsentrasi Taq DNA
polimerase yang digunakan biasanya berkisar antara 0.5-2.5 unit untuk setiap reaksinya (Innis
& Gelfand 1990).
Aktivitas enzim Taq polimerase dipengaruhi oleh nilai pH. Nilai pH optimum dari
enzim ini adalah 8.3. Kondisi optimum Taq polimerase dapat dicapai dengan menggunakan
bufer yang sesuai. Aktivitas enzim Taq polimerase juga ditentukan oleh konsentrasi ion
Mg2+ karena ion ini merupakan kofaktor bagi Taq polimerase dan biasanya terdapat dalam
larutan bufer pada beberapa jenis kit. Ion Mg2+ yang optimum untuk PCR adalah 1.5 mM.
Konsentrasi Mg2+ yang lebih tinggi dari 2.0 mM akan menjadi inhibitor dan menyebabkan
penempelan primer terganggu serta akan menghasilkan pita-pita yang kompleks dalam
elektroforesis (William et al. 2003).
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi
DNA template (cetakan) sehingga DNA yang beruntai ganda akan terpisah menjadi rantai
tunggal. Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (95ºC) selama 1-2 menit,
kemudian suhu diturunkan menjadi 55ºC sehingga primer akan menempel (annealing) pada
cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk ikatan hidrogen
dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Setelah
dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan
menjadi 72ºC selama 1.5 menit. Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan proses
polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan.
Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan
DNA cetakan. DNA yang terbentuk akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi
menjadi 95ºC. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan
bagi reaksi polimerasi berikutnya (Yuwono 2006).
Faktor apa saja yang menyebabkan proses kloning gagal?

Edwars, et. all. (2003) mengemukakan bahwa sedikitnya ada lima periode kegagalan
kloning hewan, yaitu: (1) masa praimplantasi yang ditandai dengan 16 > 65% dari sel
embrio gagal berkembang menjadi morula atau blastokista; (2) usia fetus 30 – 60 hari dapat
terjadi kematian 50-100% embrio yang ditandai dengan tidak adanya detak jantung embrio,
plasenta hypoplastik, dan sebagian berkembang dengan kotiledon rudimenter; (3) keguguran
spontan pada trisemester kedua kehamilan yang disebabkan oleh janin abnormal dan
membran janin menebal dan mengalami edema; (4) trisemester ketiga (usia janin 200-265
hari) yang ditandai dengan kematian janin hydrallantois, dan pada beberapa kasus terjadi
edema parah; (5) tingkat keberlangsungan hidup yang rendah setelah kelahiran akibat
komplikasi. Embrio yang dihasilkan setelah kelahiran seringkali mengalami kelainan, seperti
obesitas dan kematian pada usia dini.

Ada beberapa variabel yang mempengaruhi tingkat keberhasilan kloning diantaranya


adalah spesies, tipe sel donor inti, modifikasi genetik, ovum resipien, perlakuan terhadap sel
donor sebelum transfer inti, dan teknik transfer inti. Menurut Setiawan (2008), penyebab
timbulnya berbagai masalah dalam kloning hewan adalah adanya kesalahan saat
pemrograman material genetik (reprogramming) dari sel donor. Sedangkan menurut
HangBao (2004) faktor penyebab ketidakefisiensian kloning, yaitu tahapan siklus sel donor,
ketidaklengkapan pemprograman ulang nukleus, dan tipe sel donor yang digunakan. Banyak
tipe sel yang telah digunakan untuk transfer inti, diantaranya adalah sel-sel cumulus dan
mural granulose. Walaupun demikian, ada suatu indikasi bahwa tipe sel dan stadium siklus
sel saat transfer inti dapat mempengaruhi efisiensi kloning. Stadium G0/G1 (gambar 2)
menjadi stadium terbaik (Hine, 2004). Selain itu, apabila salah satu tahap kloning kurang
optimal, maka akan berpengaruh pada produksi embrio atau transfer embrio.

Edwars, et. all. (2003) mengemukakan bahwa prosedur kloning juga memberikan kontribusi
terhadap kematian embrio dan janin. Hal ini disebabkan karena enukleasi oosit mengurangi
5-15% atau lebih ooplasma; penggunaan sinar ultraviolet dalam prosedur mengakibatkan
perubahan integritas membran, meningkatkan serapan metionin, mengubah aktivitas sintesis
protein dan aktivitas mitokondria; penggunaan listrik untuk menginjeksi sel telur
mengakibatkan perubahan integritas membran sel telur; dan penggunaan bahan kimia untuk
pengaktifan embrio. Hal lain yang mungkin menjadi penyebab kegagalan kloning adalah
adanya penolakan immunologis uterus induk terhadap janin transfer dan perubahan halus
dalam struktur kromatin dan/atau ekspresi gen.