Reporte de práctica: Análisis de Alimentos

ENSAYO COLORIMETRICO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE 6-O-Α-L-

RAMNOSIL-D-GLUCOSIDASA DE ACTINOPLANES MISSOURIENSIS

COLORIMETRIC ESSAY OF THE ENZYMATIC ACTIVITY OF 6-O-Α-L-

RAMNOSIL-D-GLUCOSIDASE OF ACTINOPLANES MISSOURIENSIS

Prado-Guzmán, G. A.1,*
1
Instituto Tecnológico de Tepic. Av. Tecnológico #2595, Col. Lagos del Country. C.P. 63195. Tepic,

Nayarit, México.

Fecha de envío: 18 de abril del 2018.

Resumen:

Se determinó la actividad enzimática de -O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, una enzima de

vital importancia en la industria alimentaria y de la salud, ya que juega un papel primordial

en la hidrólisis de enlaces glicosidicos, siendo este uno de los mecanismos más empleados

en la industria de alimentos en el procesamiento de jugos y demás bebidas, y en el área de

la salud generándose metabolitos secundarios como los flavonoides que poseen propiedades

antioxidantes con efectos positivos en el organismo, entre otras. La determinación se llevó

a cabo mediante un ensayo colorimétrico, el cual nos permitió determinar las condiciones

óptimas a partir de las variaciones de pH y temperatura. El ensayo se llevó a cabo en el

laboratorio virtual Biomodel y posteriormente los datos de absorbancias obtenidas fueron

sometidos al programa Statistica con la herramienta superficie de respuesta para encontrar

*
Autor para la correspondencia. E-mail: gladysprado94@gmail.com,
Tel. 695-109-9811,
los valores óptimos matemáticamente y comparara con los obtenidos experimentalmente y

de bibliografía.

Palabras clave: -O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, actividad enzimática, colorimetría,

flavonoides, hidrólisis.

Abstract:

The enzyme activity of -O-α-L-ramnosyl-D-glucosidase, an enzyme of vital importance in

the food and health industry, was determined, since it plays a key role in the hydrolysis of

glycosidic bonds, being one of the most used mechanisms in the food industry in the

processing of juices and other beverages, and in the area of health generating secondary

metabolites such as flavonoids that have antioxidant properties with positive effects in the

body, among others. The determination was carried out by means of a colorimetric assay,

which allowed us to determine the optimum conditions from the variations of pH and

temperature. The trial was carried out in the Biomodel virtual laboratory and subsequently

the absorbancies data obtained were submitted to the Statistica program with the response

surface tool to find the optimal values mathematically and compared with those obtained

experimentally and from bibliography.

Keywords: -O-α-L-ramnosyl-D-glucosidase, enzymatic activity, colorimetry, flavonoids,

hydrolysis.
1. Introducción

En la actualidad, las glicosil-hidrolasas son un grupo de enzimas que se han vuelto

popularmente empleadas en procesos de hidrólisis de enlaces glicosídicos, los cuales

forman parte de los enlaces de azúcares reductores. Una vez que se lleva a cabo la hidrólisis

de éstos enlaces en las plantas, se da lugar a la generación de metabolitos secundarios

denominados flavonoides. Estos compuestos, han captado la atención de diversos campos

de investigación debido a que poseen la cualidad de actuar como agentes antioxidantes en

las plantas, protegiéndolas de diversos daños ocasionados por rayos ultravioleta, patógenos,

algunos agentes contaminantes como metales, y en general de daños causados por agentes

oxidantes. En el área de la salud algunos de éstos compuestos han presentado una

participación activa como preventivos de enfermedades, antiinflamatorios, etc. Por otra

parte en el área de alimentos poseen una fuerte demanda en el procesamiento de derivados

de cítricos y uvas, específicamente en jugos ayudando a su clarificación y eliminación de

sabores amargos.

En alusión a lo anterior y sabiendo de las propiedades catalíticas que poseen las enzimas,

hoy en día se buscan métodos para determinar las condiciones óptimas que generen una

mayor actividad enzimática de éstas mismas, para poder así emplearlas en diversos

procesos tecnológicos de interés. Uno de los métodos más empleados es la determinación

de actividad enzimática empleando métodos colorimétricos, los cuáles nos permiten

determinar las condiciones óptimas de pH y temperatura (factores que limitan o determinan

la actividad enzimática) a las cuáles una enzima trabaja con mayor eficiencia a partir de sus

variaciones. Esto se determina en base a la velocidad de reacción o en su defecto lo que

podemos leer como la variación de la absorbancia a un determinado tiempo de haber

iniciado la reacción.

2. Marco teórico

2.1 Glicosil-hidrolasas

Las glicosil-hidrolasas constituyen un grupo amplio y variado de enzimas cuya

característica común es la capacidad de hidrolizar el enlace glicosídico que forma el

eslabón de enlace de los azúcares (Izzo et al., 2014).

Dentro de las glicosil-hidrolasas encontramos las diglicosidasas (glicosidasas disacárido

específicas) capaces de liberar residuos disacarídicos que se encuentran en la naturaleza

unido a diversas moléculas, e.j: flavonoides, terpenos, isoprenoides, etc. Algunos

flavonoides comunes incluyen naringina, narirutina, rutina, diosmina y hesperidina.

Hesperidina se encuentra en frutas cítricas, como limón, naranjas y pomelos, y su hidrólisis

mediante glicosidasas se emplea industrialmente para clarificación de jugos de fruta y

remoción del sabor amargo (Manzanares et al. 2001)

Rutina es un compuesto abundante en alimentos como trigo sarraceno, los cítricos, el té

negro, cáscaras de manzana, cebollas, uvas y avena (HERRMANN, 1976), su

desglicosilación enzimática se utiliza en la industria para la obtención de quercetina. La

quercetina tiene una mayor actividad antioxidante que su diglicósido rutina, exhibiendo

propiedades antialergénicas, antiproliferativa y antibacteriana (Gaberščik et al., 2002) (Fig.

2).
Fig.2. Estructura química de los flavonoides (a) hesperidina (hesperetina 7-O-(6-O-α-Lramnopiranosil-β-D-

glucopiranósido) y (b) rutina (quercetina 3-O-(6-O-α-L-ramnopiranosil-β- D-glucopiranósido).

2.2 Ensayo de actividad enzimática de la ramnosil glucosidasa

El ensayo emplea una reacción con el DNS (dinitrosalicilato). El DNS, de color amarillo en

medio básico, se reduce a 3-amino-5-nitrosalicilato, de color rojo ladrillo:

(El aldehído del azúcar reductor se oxida a ácido) Se mide el color rojo del producto a 540

nm. Los azúcares reductores se forman cuando la enzima, 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa

(EC 3.2.1.168), hidroliza el enlace glucosídico de un sustrato que añadimos, la hesperidina.

La hesperidina es un glicósido natural, formado por la unión de rutinosa con hesperetina.

La rutinosa es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa (Herráez, n.d.).

2.3 Desglicosilación de flavonoides

El mecanismo de desglicosilación de flavonoides habitualmente involucra dos enzimas que

actúan de forma secuencial (Sarry & Günata, 2004), primero una monosacaridasa cliva el

enlace glicosídico, luego una β-D-glucosidasa libera la aglicona (Günata et al., 1998). Las

endoglicosidasas tienen la habilidad de clivar (cortar) un enlace glicosídico en el medio de

una cadena de azúcares (modo “endo”) y por lo tanto la desglicosilación en un solo paso de

los flavonoides diglicosilados requiere la ruptura de la unión aglicona – diglicosido, lo que

resulta en la liberación de la aglicona y el disacárido correspondiente, es decir un

mecanismo endo de acción (Ogawa et al., 1997). Las diglicosidasas hidrolizan el mismo

enlace que las beta-glucosidasas, y en la actualidad se han descripto solo cuatro actividades

que reconocen los disacáridos, la primeverosa, acuminosa, rutinosa y vicianosa

(Mazzaferro & Breccia, 2011). Algunas glicosil-hidrolasas actúan mediante el mecanismo

de retención, el cual conserva la configuración anomérica del compuesto y le confiere la

capacidad de transglicosilación, aplicable en síntesis y modificación de fármacos.

2.4 Aplicación de desglicosilación de flavonoides en el área de alimentos.

Los glucósidos de flavona son metabolitos secundarios abundantes de plantas que están

involucradas en muchos aspectos de la fabricación de productos derivados de cítricos y

uvas. Algunas características, como el sabor amargo o la turbidez del jugo, se atribuyen en

cierta medida a estos compuestos (Manthey & Grohmann, 1996). La desglucosilación de

diferentes glucósidos de flavonas representa un desafío en la tecnología de los alimentos

para el débito y la clarificación de los jugos de frutas (Hemingway et al., 1999; Wang et al.,

2001). Los procesos de desglicosilación también encuentran aplicación en las bebidas de

origen vegetal, como el vino o té, para aumentar el sabor del producto final mediante la

liberación de terpenos volátiles (MA et al., 2001).

2.5 Factores que afectan la actividad enzimática

La velocidad a la que las reacciones enzimáticas proceden depende de varios factores,

dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración de

sustrato y de enzima y el agua disponible en el medio (Badui, 2006).

2.5.1 Efecto del pH

La actividad de las enzimas depende de la concentración de iones hidronio del medio, ya

que esto afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la proteína, incluidos los del

sitio activo, del sustrato (en caso de ser ionizable), o del complejo enzima-sustrato; de

hecho, el pH influye en la estructura tridimensional de la proteína y, a su vez, sobre la

afinidad que tenga la enzima por el sustrato (Badui, 2006).

La mayoría de las enzimas disponen de rango de pH relativamente estrecho en el que

presentan una actividad óptima y se desactivan en pH extremos (Badui, 2006).

2.5.2 Efecto de la temperatura

Peterson, Daniel, Danson y Eisenthal, 2007 aseguran que el efecto de la temperatura sobre

la actividad enzimática ha sido descrito por dos parámetros térmicos bien establecidos: la

energía de activación de Arrhenius, que describe el efecto de la temperatura sobre la

constante de velocidad catalítica y la estabilidad térmica, que describe el efecto de la

temperatura sobre la temperatura constante de velocidad de inactivación.

2.6 Métodos analíticos de determinación enzimática

En general, no se determina la concentración de enzimas en tejidos y/o fluidos orgánicos,

sino su actividad. El motivo es que la concentración de enzimas en suero es baja; sin

embargo, dada su elevada capacidad catalítica es posible determinar su actividad con

fiabilidad y se presupone que, por lo general, la actividad es proporcional a la

concentración. En estos métodos, no es importante un dato puntual de absorbancia sino la

variación de la absorbancia por unidad de tiempo ocasionada por la actividad de la enzima

que se pretende analizar su actividad (Muñoz, 2010).

La técnica analítica específica más empleada es la espectrofotometría ultravioleta – visible

(UV-V). En la fase de retardo, inmediatamente después de mezclar los reactivos con la

muestra biológica no se debe medir la absorbancia, ya que es una fase de encuentro y

acoplamiento de sustrato y enzima. Puede durar de unos segundos a varios minutos. En los

productos comerciales nos indican el tiempo que dura este período de retardo.

Al finalizar esta fase, comienza la fase lineal, donde la velocidad de formación del producto

permanece constante y es en esta etapa donde se determina la actividad enzimática.

A medida que va transcurriendo la reacción, llega un momento en que la velocidad

comienza a disminuir, debido a factores como el agotamiento de sustrato, el equilibrio entre

sustrato y producto y / o variaciones de pH que no han podido ser amortiguadas por el

tampón, a efectos de inhibición del enzima, etc.

La actividad enzimática se mide en Unidades Internacionales por unidad de volumen (UI /

mL, U / L). Se define como la cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato

en un minuto en condiciones estándar previamente establecidas. En cada técnica analítica

se define la unidad de actividad y sus unidades (Muñoz, 2010).

3. JUSTIFICACIÓN

Debido a las diversas propiedades que se le a tribuyen a los metabolitos secundarios

generados en la desglicosilación de flavonoides, existe una creciente demanda por estos

mismos en diversas áreas de salud y alimentos, principalmente. Es por ello, que la

agilización de su obtención se ve muy necesaria. Como es bien sabido las enzimas poseen

una interesante propiedad catalítica y como en la mayoría de los procesos industriales su

importancia radica en ello, pues el aprovechamiento máximo de la actividad enzimática

promete la optimización de diversos procesos industriales. Bajo éste esquema, el presente

trabajo buscó determinar las condiciones óptimas de actividad enzimática de la 6-O-α-L-

ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168); enzima implicada en el proceso de desglicosilación

de flavonoides; mediante el empleo de un método colorimétrico mientras se realizaron

variaciones en el pH y temperatura, factores que se sabe que afectan o se encuentran

estrechamente ligados al rendimiento de la actividad enzimática.

4. HIPÓTESIS

H0: De acuerdo a los datos consultados en bibliografía se espera que el valor óptimo de

actividad enzimática se encuentre a temperaturas entre 50 y 70°C a un pH de 7.

H1: Los valores óptimos de actividad enzimática no se encontrará dentro del rango de

temperatura establecido de la bibliografía.

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Determinar la actividad enzimática de 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168 por

colorimetría
5.2 Objetivos específicos

Identificar el valor de óptimo de pH para la de enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa de

Actinoplanes missouriensi EC 3.2.1.168

Identificar el valor óptimo de la temperatura para la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-

glucosidasa de Actinoplanes missouriensi EC 3.2.1.168

6. Metodología

La práctica se llevó a cabo en el laboratorio virtual Biomodel.

6.1 Materiales y Reactivos

Se empleó un espectrofotómetro UV-Vis para medir la actividad enzimática de la 6-O-α-L-

ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensi en una muestra.

Solución tampón, hesperidina (como sustrato), DNS (dinitrosalicilato) y una muestra no

especificada que contiene la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168,

de Actinoplanes missouriensi.

6.2 Determinación enzimática

En una celdilla para espectrofotómetro se agregaron la solución tampón con el sustrato y

posteriormente se le adicionó la muestra que contenía la enzima, se incubó por 1 hora para

formar el producto y transcurrido este tiempo se añadió el DNS. Se esperó por 10 min a

100°C. Se desplazaron los controles para elegir un pH (los seleccionados por conveniencia

fueron 4, 7 y 10) y una temperatura (se emplearon todas las temperaturas disponibles desde

30 a 80°C) para el ensayo, una vez que se desarrollado el color, se pulso el botón para
 medir la absorbancia para cada una de las condiciones seleccionados y los valores

generados por el espectrofotómetro UV-Vis fueron registrados.

7. Resultados y discusión

Tabla 1. Relación de absorbancias obtenidas con las diferentes combinaciones entre pH

Y temperatura.

pH Temperatura Absorbancia pH Temperatura Absorbancia pH Temperatura Absorbancia

7y 30 a 0.035 4x 30 a 0.03 10 x 30 a 0.002
7y 35 a 0.034 4x 35 a 0.03 10 x 35 a 0.002
7y 40 a 0.032 4x 40 a 0.03 10 x 40 a 0.001
7y 45 a 0.096 4x 45 a 0.009 10 x 45 a 0.004
7y 50 a 0.164 4x 50 a 0.015 10 x 50 a 0.007
7y 55 a 0.392 4x 55 a 0.036 10 x 55 a 0.018
7y 60 a 0.567 4x 60 a 0.052 10 x 60 a 0.026
7y 65 a 0.73 4x 65 a 0.067 10 x 65 a 0.033
7y 70 a 0.817 4x 70 a 0.075 10 x 70 a 0.037
7y 75 a 0.781 4x 75 a 0.072 10 x 75 a 0.036
7y 80 a 0.639 4x 80 a 0.059 10 x 80 a 0.029

Grafica 1. Representación de curvas de actividad enzimática a diferentes pH’s.

0.9
A 0.8
b
0.7
s
o 0.6
r 0.5 pH 7
b 0.4 pH 4
a pH 10
0.3
n
c 0.2
i 0.1
a
0
0 20 40 60 80 100

Temperatura °C
En la tabla 1 se presentan los valores obtenidos del ensayo colorimétrico, valores que

fueron sometidos al programa Statistica para determinar sus diferencias significativas.

Debido a que el ensayo determinado no permitía realizar pruebas por triplicado; o si se

realizaban no había diferencia entre replicas (siempre se obtenían valores idénticos al leer

una misma condición); la naturaleza del diseño no permitió analizar diferencias por efecto

combinado, ya que las repeticiones eran insuficientes para determinar ésta condición entre

tratamientos. Por ésta razón, se decidió analizar los efectos individuales de ambas variables

mediante el método Anova de Fisher, obteniendo así, que las diferentes temperaturas no

tienen efecto significativo sobre la actividad enzimática, mientras que la variación entre los

pH seleccionados si presenta diferencia significativa, siendo el pH de 7 aquel que ejerce un

efecto favorable en este caso sobre la actividad enzimáticas de 6-O-α-L-ramnosil-D-

glucosa.

Una vez sometidos, los valores se examinaron a la par mediante la herramienta de

superficie de respuesta para obtener la condición óptima a la cual 6-O-α-L-ramnosil-D-

glucosa ofrecía una actividad catalítica superior al resto de las condiciones empleadas,

obteniendo como resultado de optimización un nivel de pH de 7 a una temperatura de 80°C.

De acuerdo a la tabla 1 y la grafica 1, si se comparan directamente las absorbancias

obtenidas en un principio y los valores optimizados, es notorio que hay una diferencia de

10°C entre ambos, el valor óptimo obtenido mediante el simple registro de absorbancias se

presentó a los 70°C mientras que para los valores una vez optimizados la temperatura

óptima fue de 80°C, ambos tratamientos a un pH de 7. Por otra parte Neher y col., 2016

reportan una actividad óptima a los 55°C al mismo pH. Por lo que se puede observar que no

coinciden con los reportados, sin embargo, en la base de datos BRENDA, se reporta una
temperatura óptima de actividad enzimática a los 70°C, la cual coincide con los resultado

previos a la optimización, mientras que así mismo, se menciona que la enzima a los 80°C

presenta una actividad relativa de 50%.

Se pueden atribuir esa diferencia de 10°C a que para el método estadístico empleado, no se

contaban con las suficientes replicas en los tratamientos y pudo ser un factor importante,

sin embargo, los valores que difieren con los obtenidos se presentan dentro de una zona de

alta actividad en la gráfica de superficie de respuesta.

8. Referencias

Badui, S. (2006). Química de los alimentos. Ed. Pearson educación.

https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004

Gaberščik, A., Vončina, M., Trošt, T., Germ, M., & Olof Björn, L. (2002). Growth and

production of buckwheat (Fagopyrum esculentum) treated with reduced, ambient, and

enhanced UV-B radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology,

66(1), 30–36. https://doi.org/10.1016/S1011-1344(01)00272-X

Günata, Z., Blondeel, C., Vallier, M. J., Lepoutre, J. P., Sapis, J. C., & Watanabe, N.

(1998). An Endoglycosidase from Grape Berry Skin of Cv. M. Alexandria

Hydrolyzing Potentially Aromatic Disaccharide Glycosides. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 46(7), 2748–2753. https://doi.org/10.1021/jf980084j

Hemingway, K. M., Alston, M. J., Chappell, C. G., & Taylor, A. J. (1999). Carbohydrate-

flavour conjugates in wine. Carbohydrate Polymers, 38(3), 283–286.

https://doi.org/10.1016/S0144-8617(98)00103-9
Herráez, A. (n.d.). Ensayo de actividad enzimática. Retrieved April 18, 2018, from

http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm

HERRMANN, K. (1976). Flavonols and flavones in food plants: a review. International

Journal of Food Science & Technology, 11(5), 433–448.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1976.tb00743.x

Izzo, V., Tedesco, P., Notomista, E., Pagnotta, E., Di Donato, A., Trincone, A., & Tramice,

A. (2014). α-Rhamnosidase activity in the marine isolate Novosphingobium sp. PP1Y

and its use in the bioconversion of flavonoids. Journal of Molecular Catalysis B:

Enzymatic, 105, 95–103. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2014.04.002

MA, S.-J., MIZUTANI, M., HIRATAKE, J., HAYASHI, K., YAGI, K., WATANABE, N.,

& SAKATA, K. (2001). Substrate Specificity of β-Primeverosidase, A Key Enzyme in

Aroma Formation during Oolong Tea and Black Tea Manufacturing. Bioscience,

Biotechnology, and Biochemistry, 65(12), 2719–2729.

https://doi.org/10.1271/bbb.65.2719

Manthey, J. A., & Grohmann, K. (1996). Concentrations of hesperidin and other orange

peel flavonoids in citrus processing byproducts. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 44(3), 811–814. https://doi.org/10.1021/jf950572g

Manzanares, P., van den Broeck, H. C., de Graaff, L. H., & Visser, J. (2001). Purification

and characterization of two different alpha-L-rhamnosidases, RhaA and RhaB, from

Aspergillus aculeatus. Appl Environ Microbiol, 67(5), 2230–2234.

https://doi.org/10.1128/AEM.67.5.2230-2234.2001
Mazzaferro, L. S., & Breccia, J. D. (2011). Functional and biotechnological insights into

diglycosidases. Biocatalysis and Biotransformation.

https://doi.org/10.3109/10242422.2011.594882

Muñoz, A. C. (2010). DETERMINACION ANALITICA DE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA. Retrieved April 18, 2018, from mundo-

biologia.blogspot.mx/2010/10/3-determinacion-analitica-de-la.html

Neher, B. D., Mazzaferro, L. S., Kotik, M., Oyhenart, J., Halada, P., Vladimír, K., &

Breccia, J. D. (2016). Bacteria as source of diglycosidase activity : Actinoplanes

missouriensis produces 6- O - α - L -rhamnosyl- β - D -glucosidase active on

flavonoids, 3061–3070. https://doi.org/10.1007/s00253-015-7088-x

OGAWA, J. R., SROUFE, L. A., WEINFIELD, N. S., CARLSON, E. A., & EGELAND,

B. (1997). Development and the fragmented self: Longitudinal study of dissociative

symptomatology in a nonclinical sample. Development and Psychopathology, 9(4).

https://doi.org/10.1017/S0954579497001478

Peterson, M. E., Daniel, R. M., Danson, M. J., & Eisenthal, R. (2007). The dependence of

enzyme activity on temperature: determination and validation of parameters.

Biochemical Journal, 402(2), 331–337. https://doi.org/10.1042/BJ20061143

Sarry, J. E., & Günata, Z. (2004). Plant and microbial glycoside hydrolases: Volatile release

from glycosidic aroma precursors. Food Chemistry.

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2004.01.003

Wang, D., Kurasawa, E., Yamaguchi, Y., Kubota, K., & Kobayashi, A. (2001). Analysis of
 glycosidically bound aroma precursors in tea leaves. 2. Changes in glycoside contents

and glycosidase activities in tea leaves during the black tea manufacturing process.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(4), 1900–1903.

https://doi.org/10.1021/jf001077+

9. Anexos

Cuadro 1. Determinación de condiciones óptimas de actividad enzimática

Grafica 2. Superficie de respuesta pH y temperatura de actividad enzimática.

Cuadro 2. Determinación de diferencias significativas para pH mediante Anova de Fisher

Cuadro 3. Determinación de diferencias significativas para temperatura mediante Anova de Fisher