Metode Isolasi Plasmid

1. Metode Boiling

Isolasi DNA plasmid dengan metode boiling menggunakan prinsip bahwa suhu tinggi setelah proses
pelisisan sel akan mendenaturasi protein dan DNA, namun tidak dapat memisahkan kedua untai
DNA pada struktur dobel heliks sirkular plasmid (Sambrook & Russell, 2001). Teknik isolasi plasmid
tersebut disebabkan DNA sirkular plasmid memiliki topologi dua untai polinukleotida sirkular yang
saling berkaitan. Pada saat suhu diturunkan, plasmid akan mengalami renaturasi, sedangkan DNA
kromosomal yang menjadi linear setelah proses pelisisan sel dan tetap terikat pada membran sel
tidak dapat mengalami renaturasi akan mengendap dan terpisahkan dari DNA plasmid setelah
disentrifugasi (Boyer, 2000).

2. Metode Alkaline Lisis

Pada metode isalasi DNA plasmid ini, kondisi alkali yang disebabkan perlakuan dengan campuran
SDS dan NaOH menyebabkan DNA kromosomal dan plasmid mengalami denaturasi setelah sel
mengalami lisis (Turner et al., 1997). Penambahan natrium astetat setelah perlakuan alkali dapat
menetralkan pH dan menyebabkan DNA mengalami renaturasi (Reece, 2004). Pada kondisi tersebut,
DNA plasmid dapat mengalami renaturasi dengan segera, namun DNA kromosomal membentuk
agregat yang diakibatkan adanya asosiasi interstrand dan menyebabkan DNA kromosomal
terendapkan bersama komponen protein setelah disentrifugasi (Ausubelet al., 2003).

solasi DNA plasmid merupakan sesuatu yang penting dalam rekayasa genetika, sebelum bakteri
disisipi oleh plasmid rekombinan yang telah tersisipi (inserted) oleh gene of intereste (goi), maka
perlu disiapkan terlebih dahulu plasmid sebagai vector, baik sebagai cloning vector-untuk tujuan
perbanyakan copy dari goi-maupun sebagai expression vector-untuk tujuan ekspresi goi pada sel
host. keberhasilan dalam mempersiapkan plasmid dengan kualitas yang baik sangat diperlukan,
terlebih lagi tingkat kemurnian plasmid apabila akan digunakan untuk sequencing, PCR, cloning, dan
restriction digestion.

Isolasi plasmid dapat dilakukan secara manual atau menggunakan KIT yang tersedia dari berbagai
perusahaan biotechnology (eg. Thermo Scientific, Invitrogen, Qiagen, Macherey-Nagel, Integrated
DNA Technology). sebenarnya keduanya menggunakan prinsip yang sama, yaitu lisis DNA
kromosomal pada kondisi basa (Alkaline Lysis), namun menggunakan KIT lebih efisien waktu dan
biasanya lebih murni plasmid yang diperoleh, tetapi metode manual juga tidak kalah dan jauh lebih
ekonomis. Metode isolasi plasmid secara manual ataupun kit dengan prinsip alkaline lysis dijelaskan
di dalam buku Molecular Cloning Sambrook et al (2001).