Daryusman

Tahukah anda ???

Kromatografi itu ???

SEJARAH
 Pertamakali digunakan untuk
memisahkan zat warna (chroma)
tanaman
Pengertian Kromatografi
Kromatografi secara umum.

menjadi
Teknik Suatu
pemisahan campuran Komponen

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi

komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-
masing komponen.
Teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi
dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase,
yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak.
DEFINISI
 Teknik pemisahan yang dilakukan dengan
memanipulasi sifat fisik dari zat-zat penyusun
suatu campuran

 Tidak ada dua zat yang mempunyai sifat fisik

yang sama sehingga pemisahan untuk zat yang
serupa masih mungkin untuk dilakukan
SIFAT FISIK YANG DIMANIPULASI

 Kecenderungan zat untuk larut dalam

suatu cairan
 Kecenderungan zat untuk teradsorpsi
pada butir zat padat yang halus dengan
permukaan luas (adsorben)
 Kecenderungan zat untuk menguap
ISTILAH PENTING

1. Polaritas
2. Partisi
3. Adsorpsi
4. Jenis fase: fase stasioner dan
fase mobil
1. POLARITAS
 Penting untuk kromatografi
 Menunjukkan adanya pemisahan kutub muatan
positif dan negatif dari suatu molekul sebagai
akibat terbentuk konfigurasi tertentu dari atom-
atom penyusunnya
 Molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul lain
yang mempunyai polaritas
 Tingkat pemisahan dari molekul-molekul tersebut
menentukan polaritas dan daya tariknya
dalam kromatografi
Polaritas digunakan sebagai petunjuk sifat:
 Pelarut/solven
 Adsorben
 Zat yang dipisahkan/solut

PRINSIP LIKE DISSOLVES LIKE

 Pelarut polar cenderung melarutkan solut polar
 Adsorben polar cenderung mengadsorbsi solut
polar
POLARITAS RELATIF BERBAGAI JENIS PELARUT

KONSTANTA DIELEKTRIK JENIS PELARUT

1,89 Petroleum ringan (petroleum eter,
heksana, heptana)
2,023 Sikloheksana
2,238 Karbon tetraklorida, trikloroetilen, toluena
2,284 Benzena, diklorometana
4,34 Etil eter
4,806 Kloroform
6,02 Etil asetat
20,70 Aseton, n-propanol
24,30 Etanol
33,62 Metanol
80,37 Air
Polaritas pelarut
 Sebanding dengan konstanta dielektrik zat pelarut

PARTISI DAN ADSORBSI

 Pemisahan dengan proses partisi dan adsorbsi
dipengaruhi oleh perbedaan polaritas solut yang
dipisahkan
 Polaritas merupakan faktor yang menentukan daya
larut (kemampuan partisi) dan adsorbsi solut
PARTISI
 Proses partisi tergantung dari daya larut solut dalam
dua macam cairan
 Peka terhadap perbedaan BM solut
 Zat yang terdiri dari satu seri deret homolog paling
baik dipisahkan dengan kromatografi partisi
 Misal: pemisahan berbagai jenis asam amino, asam
lemak, gula
ADSORBSI
 Peka terhadap bentuk stereometri dari solut yang
dipisahkan
 Banyaknya solut yang dapat diadsorbsi pada
permukaan adosrben tergantung dari konfigurasi
solut
 Kemampuan untuk diadsorbsi menentukan
kemudahan solut untuk dipisahkan dengan
kromatografi adsorbsi
 Cocok untuk memisahkan campuran solut yang
serupa tetapi mempunyai perbedaan bentuk
sterometrik
 Kromatografi

Padat Pertukaran Ion Fasa Diam Gel

Gas Cair Cair Fasa Gerak Cair

Anion Kation GPC

Plat Kolom
JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
 Berdasarkan prinsip kerja : adsorpsi dan partisi
 Berdasarkan fase gerak : gas chromatography dan
liquid chromatography.

JENIS
 Kromatografi Kertas
 Kromatografi lapis tipis (TLC)
 Kromatografi kolom: HPLC, GC, penukar ion, gel
filtrasi
Kromatografi di dalam bentuk tempat

 Komatografi Kolom : Kromatografi kolom

merupakan teknik pemisahan di mana tempat
stasioner dalam tabung.

 Kromatografi Planar
 Kromatografi Kertas
 Kromatografi Lapisan Tipis
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi pigmen
tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas
kaca untuk memisahkan komponen
kimia dan bahan lainnya

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia Paper Chromatography
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa Dapat digunakan untuk memisahkan
berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh tiap- komponen-komponen tinta,
tiap puncak dalam grafik di bawah ini. pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat
lain
Kromatografi Gas-Cair
 A. Kromatografi Kertas
 Kromatografi kertas adalah kromatografi yang
menggunakan kertas selulosa murni yang
mempunyai afinitas besar terhadap air atau
pelarut polar lainnya.

 Kromatografi kertas digunakan untuk memisahkan

campuran dari substansinya menjadi komponen-
komponennya.
Kromatografi Kertas
fase diam → kertas serap

Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang

sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf.

Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:

Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi Kertas (lanjutan)
Kromatografi Kertas Dua Arah
 Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.

 Menggunakan dua pelarut yang berbeda

Prinsip Kerja Kromatografi
Kertas

Pelarut bergerak lambat pada

kertas, komponen-komponen
bergerak pada laju yang berbeda
dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada perbedaan
bercak warna.
Cara penggunaan
Kromatogarfi kertas
1. Kertas yang digunakan adalah Kertas Whatman
No.1.
2. Sampel diteteskan pada garis dasar kromatografi
kertas.
3. Kertas digantungkan pada wadah yang berisi
pelarut dan terjenuhkan oleh uap pelarut.
4. Penjenuhan udara dengan uap, menghentikan
penguapan pelarut sama halnya dengan
pergerakan pelarut pada kertas.
Gambar Kromatografi
Kertas
B. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah
kromatografi yang menggunakan
kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen
dalam campuran.
Prinsip Kerja Kromatografi
Kolom
 Didasarkan pada absorbsi komponen2
campuran dengan afinitas berbeda terhadap
permukaan fase diam.
 Absorben bertindak sebagai fase diam dan
fase geraknya adalah cairan yang mengalir
membawa komponen campuran sepanjang
kolom.
 Sampel yang mempunyai afinitas besar
terhadap absorben akan secara selektif
tertahan dan afinitasnya paling kecil akan
mengikuti aliran pelarut.
 Cara Penggunaan
Kromatografi Kolom
1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan
melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben
(bahan penyerap).
2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara
kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
permukaan atas kolom.
3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-
masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan
terbentuk pita yang setiap zona berisi satu macam komponen.
4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan
sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.
Gambar kromatogafi kolom
C. Kromatografi Lapis Tipis

 Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara

pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa
murninya dan mengetahui kuantitasnya yang
digunakan.

 Kromatografi lapis tipis dapat digunakan

untuk memisahkan senyawa – senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan
kromatografi kertas.
Gambaran Umum Kromatografi
Lapis Tipis

 Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan

oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938.
 KLT merupakan bentuk kromatografi planar,
selain kromatografi kertas dan elektroforesis.
 Fase diamnya berupa lapisan yang seragam
(uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium
atau pelat plastik.
 Kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai
bentuk terbuka dari kromatografi kolom.
Beberapa Keuntungan
Kromatografi Lapis Tipis

 Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk

tujuan analisis.
 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan
dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan
radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
 Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending),
menurun (descending), atau dengan cara elusi 2
dimensi.
 Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena
komponen yang akan ditentukan merupakan bercak
yang tidak bergerak.
KLT cepat populair karena memberikan banyak
keuntungan :
-Peralatan sederhana
-Murah
-Waktu analisis cepat
-Daya pisah cukup baik

Sebagian besar teori kolom dapat diterapkan

pada KLT.
Pemisahan dilakukan oleh keseimbangan
berturutan cuplikan terhadap dua fasa, satu
diantaranya bergerak terhadap yang lain.
Prinsip kerja Kromatografi Lapis
Tipis

 KLT Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina

yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam
atau plastik yang keras.

 Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau substansi

yang dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet.

 Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang

sesuai.
 Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang
merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna.
Fase Diam
 Merupakan penjerap berukuran
kecil dengan diameter partikel
antara 10-30 μm.
 Penjerap yang paling sering
digunakan adalah silica dan
serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama
pada KLT adalah adsorpsi dan
partisi.
Beberapa penjerap (fase diam) pada KLT
Penjerap Mekanisme Sorpsi Penggunaan
Silica Gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon,
vitamin, alkaloid
Silica Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa dengan
modifikasi hidrokarbon non polar
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,
karbohidrat
Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam, pewarna
makanan, alkaloid
Kieselgur Partisi Gula, asam-asam lemak
Selulosa Pertukaran Ion Asam nukleat, nukleotida, halida
Penukar ion dan ion-ion logam
Gel Sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam
β-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran stereospesifik
enansiomer
Fase Gerak
 Sistem yang
paling sederhana
ialah campuran 2
pelarut organik
karena daya elusi
campuran kedua
pelarut ini dapat
mudah diatur
Cara memilih dan mengoptimasi fase gerak
 Fase gerak mempunyai kemurnian yang sangat tinggi
 Daya elusi fase gerak diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8
 Pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica
gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi
solute yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan
pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam
pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan
harga Rf secara signifikan.
 Solute-solute ionik dan solute-solute polar lebih baik digunakan
campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air
dan methanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan
sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan
meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.
PENOTOLAN CUPLIKAN
 Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20,
20 x 10, 20 x 5) ,dengan tebal 0,2 mm.
. Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat dg diameter 3 – 6
mm, atau berupa garis 1,5 – 2 cm dari tepi bawah.

Tepi bawah

Lempeng
KLT
Berupa
 3 – 6 mm
garis
1,5 – 2 cm
 Penotolan dengan mikro pipet atau
microsyringe diperlukan 1 – 20 μL.
Kelebihan bahan totolan menyebabkan
bercak asimetri dan perubahan harga
Rƒ.

 HETP pada KLT biasanya 10 x 10, 10 x

20 cm. diperlukan cuplikan dalam nano
 pikogram setiap bercak. Diameter
bercak harus tidak lebih 1,0 – 1,5 mm
dan vol cuplikan ± 0,2 μL.
Aplikasi (Penotolan) Sampel

 Untuk memperoleh roprodusibilitas,

volume sampel yang ditotolkan paling
sedikit 0,5 μl.
 Jika volume sampel yang ditotolkan
lebih besar dari 2- 10 μl, maka
penotolan harus dilakukan secara
bertahap dengan dilakukan
pengeringan antar totolan.
Pengembangan
 Tepi bagian bawah
lempeng tipis yang telah
ditotoli sampel
dicelupkan kedalam fase
gerak kurang lebih 0,5-1
cm.
 Tinggi fase gerak dalam
bejana harus dibawah
lempeng yang telah
berisi totolan sampel.
 Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan
sedapat mungkin volume fase gerak sedikit
mungkin tetapi harus mampu mengelusi lempeng
sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan.

 Untuk melakukan penjenuhan fase gerak,

biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring . Jika
fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring,
maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah
jenuh
Deteksi Bercak
 Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan
mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi
melalui cara penyemprotan sehingga bercak
menjadi jelas.
 Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan denagan
cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar
ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama
untuk senyawa yang dapat berfluorosensi,
membuat bercak akan terlihat jelas.
Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk
mendeteksi bercak :
 Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik
yang akan bereaksi secara kimia dengan solute yang
mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak
menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih
dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna
dan intensitas warna bercak.
 Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang
dipasang panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk
menampakkan solute sebagai bercak yang gelap atau
bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang
berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan
dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi
dengan senyawa fluorosen yang tidak larut.
 Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau
asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi
solute-solut organic yang akan Nampak sebagai bercak
hitam sampai kecoklat-coklatan.
 Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam
chamber tertutup.
 Melakukan scanning pada permukaan lempeng
dengan densitometer, suatu instrument yang dapat
mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari
permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV
atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu
menyera[p sinar akan dicatat sebagai puncak (peak)
dalam pencatatan (recorder)
Faktor yg mempengaruhi gerakan noda dlm KLT yang
juga berpengaruh terhadap Rƒ

1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan.

2. Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya.
Aktivitas di  kan dg pemanasan dlm oven.
3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap.

4. Pelarut & [o kemurnian] f gerak.

- Kemurnian pelarut sangat penting
- Perbandingan campuran pelarut perlu diperhatikan.

5. Derajat kejenuhan uap dalam bejana pengembangan.

6. ∑ cuplikan yang digunakan

Tetesan cuplikan   Tendensi penyebaran noda
Kesalahan harga Rƒ  Terbentuknya ekor
 Efek kesetimbangan lain
7. Suhu, pemisahan sebaiknya pada suhu tetap
Hal ini terutama untuk mencegah perubahan-
perubahan dalam komposisi pelarut karena
penguapan,( perubahan fasa).

8. Kesetimbangan
Kesetimbangan dalam KLT lebih penting dalam krom.
kertas  perlu diupayakan atmosfer dalam bejana
jenuh dengan uap pelarut.
Gejala atm. bejana ≠ jenuh  pengembangan dengan
permukaan pelarut cekung, fasa gerak bergerak lebih
berat di bagian tepi  .. harus dihindarkan.
Perhitungan Nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus
sebagai berikut:

Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa

pustaka menyatakan nilai Rf yang baik yang
menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah
berkisar antara 0,2-0,8.

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah

bergerak dari 1.7 cm dari garis awal, sementara
pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk
komponen berwarna merah menjadi:
PENGGUNAAN KLT
 Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan untuk uji
identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang
digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf.
 Analisis kuantitatif dilakukan dengan 2 cara, yaitu
mengukur bercak langsung pada lengpeng dengan
menggunakan ukuran luas atau dengan teknik
densitometry dan cara berikutnya adalah dengan
mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang
terdapat dalam bercak dengan metode analisis yang lain,
misalnya dengan metode spektrofotometri.
 Analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam lempeng
dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan
dideteksi dengan cara yang non- dekstruktif. Bercak yang
mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerok dan
dilakukan analisis lanjutan.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar
dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan
pada garis itu.

Ketika bercak dari campuran itu mengering,

lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang
tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa
batas pelarut berada di bawah garis dimana
posisi bercak berada.
Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah
kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap
dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini,
dalam gelas kimia biasanya ditempatkan
beberapa kertas saring yang terbasahi oleh
pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan
uap mencegah penguapan pelarut.
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis

seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika
diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana

bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika
dilihat dengan mata. Ketika sinar UV
diberikan pada lempengan, akan timbul
pendaran dari posisi yang berbeda dengan
posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai
bidang kecil yang gelap.
Cara Penggunaan
Kromatografi Lapis Tipis

Pada cara penggunaan KLT hampir sama

dengan penggunaan Kromatografi
kertas, hanya saja pada KLT fase
diamnya menggunakan plat gelas/
logam/ Aluminium foil sedangkan pada
kromatografi kertas menggunakan
kertas saring.
Gambar Kromatografi Lapis
Tipis