INTRODUCCIÓN.

La cromatografía en fase reversa permite separar moléculas en base a su polaridad y

básicamente consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada.
El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa
fina, sin embargo, aquí la fase estacionaria es de partículas de sílice químicamente
modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos, lo
cual convierte a la fase estacionaria en una matriz apolar, esta columna suele estar
acompañada con C8 o C18 según el analito a separar. Por lo tanto, para este tipo de
cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, la fase móvil es agua con un
componente menos polar como puede ser: agua-metanol o agua-acetonitrilo.
Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la
retención, ya que el tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar,
mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.
En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y desgasifique todas
las sustancias que entrara al equipo antes de ser introducido a un sistema de HPLC, esto
con el propósito de evitar daños futuros en el equipo, así como evitar errores en las
determinaciones. Todos los solventes, el agua de grado HPLC, junto con la fase móvil
deben ser pasados a través de un filtro y desgasificados (al vacío, con sonicador o con
burbujeo con un gas inerte de alta presión como el helio) antes de su uso.
Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria y
con la fase móvil, de este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas
velocidades y se van separando. Después de haber pasado los componentes por la fase
estacionaria y haberse separado, pasan por un detector que genera una señal que puede
depender de la concentración y del tipo del compuesto, proporcionando un cromatograma
donde se observan diferentes picos a los cuales se les asignan tiempos de retención con el
objetivo de realizar su identificación y cuantificación.
La identificación de compuestos se realiza mediante la comparación del tiempo de retención
del analito de una muestra con los tiempos de retención de una sustancia de referencia. Y
la cuantificación consiste en comparar el área bajo la curva del pico de interés en la muestra
con el área del pico de la sustancia de referencia.
OBJETIVOS

 Conocer los componentes y el funcionamiento del equipo de HPLC.

 Identificar la cafeína presente en bebidas gaseosas de cola por medio de la
comparación de sus tiempos de retención (tR) con el tR de un estándar de cafeína.
 Determinar la concentración de cafeína en bebidas de cola por HPLC, utilizando
cromatografía en fase reversa y detección por UV.
 Comparar la concentración de cafeína presente en bebidas gaseosas de cola con
los límites establecidos en la NOM-218-SSA1-2011.
 Poner en aprendizaje algunos conceptos de cromatografía.
RESULTADOS.
Se realizo una cromatografía de líquidos de alta resolución con el fin de identificar cafeína
en refrescos de cola, los cuales fueron Dr. Pepper®, Pepsi Kick® y Coca Cola® en donde se
empleó como fase móvil una mezcla de agua y metanol (35:65) y una columna en donde la
fase estacionaria fue modificada con una cadena hidrocarbonada de 18 carbonos, durante
el proceso se realizó una corrida analítica completa en donde cabe destacar que todas
muestras incluyendo el estándar fueron analizadas por duplicado, se utilizó un estándar de
cafeína conteniendo 10.7 mg/100 mL. Al término de la práctica se realizaron cálculos, se
discutió y concluyo con base en los criterios de la NOM-218-SSA1-2011.

Cálculos empleados

Para el factor de capacidad de la primer replica de estándar:

𝑇𝑟 − 𝑇𝑚 2.00 − 0.850
𝐾= = = 1.35
𝑇𝑚 0.850
Para el promedio del estándar:
470664 + 509533
𝑥̅ = = 490,099
2
Para la desviación estándar del estándar:
∑(𝑥 − 𝑥̅ )2
𝑠=√ = 27484.5
𝑁−1
Para él %DER:
%𝐷𝐸𝑅

Para determinar la concentración de Dr. Pepper®:

Estándar y la muestra se diluyeron 1:10
La concentración del estándar es conocida y es 10.7 mg/100 mL, lo cual nos indica que el
estándar contenía 0.0107 mg/mL
Estandar490,099---------------0.0107mL
Dr. Pepper 353697-------------x
353697(0.0107) 7.71𝑥10−3 𝑚𝑔
𝑥= = ∗ 10 ∗ 100 = 7.72𝑚𝑔/100𝑚𝐿
490,099 𝑚𝐿

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Para poder realizar una cromatografía de líquidos de alta resolución es preciso saber cuáles
son las partes del equipo y por supuesto el funcionamiento del equipo, un objetivo de esta
práctica debido a que nunca los alumnos realizaban este tipo de prácticas en esta unidad
de aprendizaje
Básicamente el equipo contiene un software en el cual nosotros podremos manipular el
equipo a modo de ajustarlo a nuestra necesidades, la importancia de estos equipos radica
en su alta resolución para poder identificar muestras, estos equipos utilizan sustancias de
alta pureza, generalmente se le conocen como sustancia grado HPLC en donde todas ellas
se encuentran libres de iones, macromoléculas y gases que pueden interferir con la
cromatografía, es importante recalcar los componentes y el funcionamiento del equipo para
HPLC utilizado, donde el primer componente de este equipo son los reservorios para fase
móvil, que son frascos de vidrio con paredes homogéneas que nos permitan observar el
interior de éstos, en los cuales colocamos las fases móvil, las fases móviles se encuentran
separadas, una en cada frasco de vidrio, en donde el equipo se encarga de tomar la
cantidad exacta de estas para poder realizar la mezcla y poder llevar acabo la
cromatografía. Por medio de una bomba binaria reciprocante, es decir que realiza el
bombeo mediante pistones, la fase móvil es impulsada a través de todo el sistema
cromatográfico en la proporción que se haya elegido (en nuestro caso 35:65) llegando a los
inyectores, los cuales nos permiten introducir la muestra al sistema, dicho inyector cuenta
con un “loop” que retiene una cantidad constante de muestra (20 µL) independientemente
del volumen que sea inyectado, sin embargo, es necesario inyectar como mínimo el triple
del volumen retenido.

Continuando con lo anterior la muestra pasa a la columna C18 (que es una columna con
baja polaridad) que tiene una longitud de 150 mm, la longitud de la columna dependerá de
lo que se busca separar, ya que a mayor longitud será mayor el paso de fase móvil y por
tanto se aumentará la capacidad para realizar la separación, pero también es importante
considerar el tamaño de partícula, pues al disminuir el tamaño se aumenta la superficie de
contacto y así mismo la eficiencia de separación, cabe destacar que generalmente el
soporte es generalmente un metal que es inoxidable, como el fierro y existen otro tipo e
columnas con C8 que harán otro tipo de separaciones. Finalmente, la muestra es detectada
por un detector de UV-Vis a una longitud de onda de 273 nm, ya que es a 273 nm donde
se observa el máximo de absorción de la cafeína.

Una vez que ya fue inyectada la muestra se comienza la lectura en el registrador y se

requiere de una línea base estable por al menos 10 minutos aproximadamente, si esta no
fuera estable sería indicio de que el sistema no se lavó de manera adecuada y tendrá que
comenzar de nuevo.
Cuando el sistema se encuentre en perfectas condiciones de uso se puede continuar con
la corrida analítica, en la cual utilizamos un estándar de cafeína con el objetivo de realizar
una comparación del tiempo de retención del estándar (que se define como el tiempo que
transcurre desde la inyección de la muestra (tiempo 0) hasta la aparición del máximo de un
pico) con las diferentes muestras que fueron analizadas por el equipo de HPLC, donde se
inyecto por duplicado dicho estándar y se obtuvo un tiempo de retención de 2.0 minutos
(ver tabla 1), después inyectamos la muestra de los refrescos Dr. Pepper®, Pepsi Kick® y
Coca Cola® una vez obtenido el tiempo de retención se pudo confirmar que las muestras
contenían el susodicho en donde los tiempos de retención oscilan en los 2 minutos, ver
tabla 1, lo cual hace referencia que dichas bebidas contienen el mismo analito, la cafeína,
pues los tiempos de retención son los mismos o con una pequeña diferencia.

Debido a que el estándar y las muestras se inyectaron por y duplicado respectivamente, fue
necesario determinar la desviación estándar relativa (%DER) para verificar que existiera
reproducibilidad en las determinaciones, dichos %DER fueron en su mayoría mayores al
1.5%, establecido por el manual, cabe destacar que este % toma muestra por triplicado,
este porcentaje varia dependiendo el analito que se desee analizar, este parámetro es muy
parecido al coeficiente de varianza lo cual indica que no hay reproducibilidad en la mayor
parte del trabajo, solo en Dr. Pepper®, esto ocurrió porque los analistas fueron todos y cada
uno de las sección sin mencionar que alguno de ellos en el estándar tardo en oprimir el
inyector por lo cual se puede observar una alta desviación estándar relativa en la mayoría
de los casos, pero esto es muy normal, ya que son poquitas reproducciones y además los
analistas cambiaron, además se trata de una práctica en donde por primera vez se
interacciona con este tipo de aparatos.

Por otro lado, para la cuantificación de la cafeína presente en los refrescos de cola es
necesario comparar el área bajo la curva de las muestras con la del estándar, cabe destacar
que las muestras se diluyeron 1:10 y cada una fue desgasificada, sometiéndola a un
sonicador por 5 minutos donde los resultados se pueden observar en la tabla 1.

Con base en las concentraciones de cafeína de los diferentes refrescos de cola y

comparando con lo establecido en la NOM-218-SSA1-2011 publicada en el diario oficial de
la federación en el apartado 6.3 “Las bebidas adicionadas con cafeína no deben contener
más de 33mg de cafeína/100mL de producto”, las muestras cumplen con lo establecido, a
excepción, primero Pepsi Kick®, seguido de Dr. Pepper®, y finalmente la Coca Cola®, lo cual
es lógico debido a que la primera es una bebida energizante, un efecto que provoca la
cafeína, la cual es un estimulante del sistema nervioso central y un diurético (sustancia que
le ayuda al cuerpo a eliminar líquidos), la cafeína se absorbe y pasa rápidamente hacia el
cerebro. No se acumula en el torrente sanguíneo ni se almacena en el organismo. Sale del
cuerpo en la orina horas después de haber sido consumida.
Algo que también es cierto es que la norma señala “toda bebida adicionada con cafeína
debe declararse en la lista de ingredientes, seguido del contenido exacto expresado en
mg/100mL”, sin embargo, dos de los 3 refrescos no lo mencionan en el apartado de
ingredientes, por lo cual no esta cumpliendo con la norma establecida.

PREGUNTAS DEL MANUAL

  ¿Cuál es la importancia de filtrar y desgasificar la fase móvil y la muestra?
Eliminar cualquier tipo de partículas que pudieran estar presentes y que puedan ser una
interferencia en la determinación, así como evitar daños futuros en el equipo.

 Mencionar los métodos de desgasificación más frecuentemente utilizados en HPLC.

- Sonicación.
- Burbujeo con gas inerte de alta pureza (como Helio).
- Desgasificación al vacío.

 ¿En que difiere la cromatografía en fase normal de la cromatografía de fase reversa

en cuanto a la fase estacionaria, fase móvil y orden de elución?
La cromatografía en fase normal emplea una fase estacionaria polar y una fase móvil no
polar, de manera que aquellos compuestos no polares eluirán rápidamente, mientras que
los polares serán retenidos por mayor tiempo y eluirán al final.
La cromatografía en fase reversa emplea una fase estacionaria no polar y una fase móvil
polar, por tanto, el tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar,
mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente.

 Si se cambiara la composición de la fase móvil agua metanol (35:65) a (25:75), ¿Qué

sucedería en cuanto al tiempo de retención? y ¿por qué?
El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y
disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos ya que se modifica el
coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.

BIBLIOGRAFÍA

 Diario Oficial, NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y

servicios. Bebidas saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos
concentrados para prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones
y disposiciones sanitarias. Métodos de prueba, (2012). Disponible en:
https://goo.gl/fpqYzj (Consulta: 05/2018).
 Rubiano A., Zuluaga-Domínguez C., (2012). Determinación y Estandarización de un
Método para Cafeína en el Proceso de Torrefacción por Cromatografía Líquida de
Alta Eficiencia (HPLC). Revista Especializada en Ingeniería de Procesos de
Alimentos y Biomateriales, Vol. 6. pp.: 40,41.
 Skoog-A. D, West-Donald M. (1985) Análisis instrumental. 2da edición. Nueva
editorial interamericana. Distrito Federal, México. Pp 709,720,728.
 UAM, Determinación de la concentración de cafeína en una bebida energética por
cromatografía de líquidos (HPLC) a partir de una curva de calibración, (2011).
Disponible en: https://goo.gl/xmFX7L (consulta 05:2018).
 Universidad Central de Venezuela, Guía de métodos de análisis por cromatografía
líquida de alta eficiencia, (2013). Disponible en: https://goo.gl/iHMBtb (Consulta:
05/2018).