INFORME Nº 4

CURVA DE CRECIMIENTO

INTEGRANTES
● Karen Julieth Gómez Ortiz (2171034)
● Susan Dayanna Sanabria Ardila (2171259)
● Jhonatan Javier Arciniegas Nieves (2171429)
● Lizbeth Paola Arizmendi Fajardo (2171263)
● Alejandra Portilla Martínez (2171621)
● Jhon Eduard Miranda Ortega (2171336)
● Yesenia Cristina Navarro Barajas (2171624)
● ana maria trujillo jaimes (2171268)
● Giovanny Andres Calvete Felizzola (2162327)
● Edwin Duvan Torres Amorocho (2152276)
● Samantha Janiot Rivera (2161511)
● Mateo Alexander Vanegas Rincon (2171044)
● Isabella Jaimes Villamizar (2171785)

1. INTRODUCCIÓN

Una población bacteriana presenta un crecimiento que se ha dividido en 4 partes, es

importante resaltar que es por poblaciones esta división y no hace referencia a una sola
bacteria:

a. Latencia: Se ha descrito que esta etapa es el periodo en el que las bacterias se adaptan
a su ambiente; se puede observar esta etapa en bacterias que estaban en un cultivo
viejo y se inoculan en otro nuevo (porque las bacterias carecen de varios
componentes necesarios para dividirse y toma tiempo su resíntesis), en bacterias que
han sido dañadas con calor, radiaciones o compuestos tóxicos (debido al tiempo que
le toma la bacteria recuperarse y reparar los daños) y en bacterias que se transfieren de
un medio rico en nutrientes a uno bajo en nutrientes. [1]

b. Fase exponencial: En esta etapa las bacterias se encuentran en su estado fisiológico

más sano y por lo tanto; cada célula se divide para formar dos células más y esas dos
más producen 4 células más; en esta etapa se puede hablar de conceptos como: El
número de células totales (N)​ que se puede medir a partir de la ecuación matemática
1, el ​tiempo de generación​ bacteriana (​g​); que se define como el tiempo que le toma
a una bacteria pasar de una generación a otra (ver ecuación 2), ​velocidad específica
de crecimiento (K) ​(ver ecuación 3) y ​velocidad de división (v) ​(ver ecuación 4) que
es el inverso de tiempo de generación. Mientras que ​g ​es una medida del tiempo que
tarda una población en duplicar su número de células ​v ​es una medida del número de
 generaciones que ocurren por unidad de tiempo. [1] La pendiente de la fase
exponencial depende de las características genéticas de los microorganismos y de las
condiciones del cultivo. En general, los procariotas crecen más rápidamente que los
eucariotas y los eucariotas pequeños lo hacen más rápidamente que los grandes. [2]

Ecuación matemática 1: N = No*2​n

Donde N: Es el número de células finales.
No: Número de células iniciales.
​ : Número de generaciones ocurrido durante el periodo de crecimiento exponencial.
n​

t
Ecuación matemática 2: g = n
Donde g: Tiempo de generación.
t: Tiempo que le toma a una población microbiana en fase logarítmica duplicarse.
​ : Una generación.
n​

Log (#)
Ecuación matemática 3: K = g
Donde K: Velocidad específica de crecimiento.
#: Tiempo que le toma a una población microbiana en fase logarítmica duplicarse.
g: Tiempo de generación.

1
Ecuación matemática 4: v = g
Donde v: Velocidad de división.
g: Tiempo de generación.

c. Estacionaria: Para beneficio de unos o para tristeza de otros, la etapa de crecimiento

logarítmico no es para siempre (de hecho si las bacterias crecieran así constantemente, se
alcanzaría en 48 horas 4000 veces más el peso de la tierra); lo que evita esto se da por dos
situaciones que la mayoría de veces se presentan a la vez:

1. Se agota un nutriente esencial del cultivo y llega ha ser un factor limitante del
crecimiento.
2. Se acumulan demasiados productos de desecho hasta niveles inhibitorios lo que cesa
el crecimiento exponencial.

Lo que sí es cierto es que no hay crecimiento en la fase estacionaria (puede que sí lo haya,
pero como las células mueren los procesos se equilibran), pero si continúan muchas
funciones celulares (metabolismo energético y muchos procesos biosintéticos). [1]
 d. Fase de muerte: Cuando se desestabiliza el balance entre muerte y duplicación y se
producen más muertes que divisiones, comienza la fase de muerte del cultivo. Esta fase
tiene una pendiente exponencial negativa, que puede ser de la misma magnitud que la fase
de crecimiento exponencial. [2]

Para realizar la curva de crecimiento se utilizó una cepa de ​E.coli​. Este tipo de bacteria se
caracteriza por ser bacilos Gram negativos, con producción de indol a partir de triptófano,
no utilización de citrato como fuente de carbono y no producción de acetoína. Además,
fermenta la glucosa y la lactosa con producción de gas. No es productor de esporas. Crece
en un rango de temperatura de 7-8 °C como mínimo y de 46-50 °C Como rango
máximo,aunque su temperatura óptima de crecimiento son los 37° C ya que esta bacteria
se encuentra frecuentemente alojada en el intestino humano. ​El pH óptimo para su
crecimiento es de 6-7 aunque puede crecer en un rango de 4-10.[3] Todos estos factores
hay que tenerlos en cuenta a la hora de realizar una curva de crecimiento ya que la
modificación de los factores fisicoquímicos y nutricionales de la bacteria puede alterar el
crecimiento de la misma.

2.METODOLOGÍA
PROCEDIMIENTO 1
1. Cada mesón tomó dos colonias de E.Coli crecida en Agar Mc conkey e inocularon en un tubo con
caldo BHI a 37°C durante:
● Mesón 1: 30 mns
● Mesón 2: 1 hora
● Mesón 3: 1 horas y 30 mns
● Mesón 4: 2 horas

2. Después de este tiempo, se midió la absorbancia a 600nm tomando una alícuota del tubo incubado y
haciendo la lectura en el espectrofotómetro.

3. Posterior a esto, se hicieron diferentes diluciones por mesón:

● Mesón 1: 10​-1​, 10​-2​, 10​-3​ y 10​-4​.
● Mesón 2: 10​-1​, 10​-2​, 10​-3​, 10​-4​ y 10​-5​.
● Mesón 3: 10​-1​, 10​-2​, 10​-3​, 10​-4​ y 10​-5​.
● Mesón 4: 10​-1​, 10​-2​, 10​-3​, 10​-4​, 10​-5 ​ y 10​-6​.

4. Se tomaron las 3 últimas diluciones en cada mesón excepto el mesón 4, que tomó las diluciones de
10​-3​, 10​-4​ y 10​-5​ debido a que la dilución de 10​-6 ​ no daría los resultados esperados y se hizo la siembra
por duplicado en agar recuento con estos valores.
 PROCEDIMIENTO 2
1. En un matraz de 70 ml de medio de cultivo, se puso un pre inóculo el cual fue termostatizado a
temperatura ambiente.

2. Se homogeneizó la muestra y se agitó el matraz, se tomó una muestra de 1 ml.

3. Se colocó en una celda de espectrofotómetro y se leyó la absorbancia a 600nm.

4. Se puso el matraz en agitación y se tomó la absorbancia cada hora.

5. Se registraron los datos obtenidos y se realizó la gráfica de abs vs tiempo en min y log A​600​ vs
tiempo min.

3.RESULTADOS

Mesón Tiempo Absorbancia UFC/mL

1 ½ hora 0,045 nm 5,6X10​6​ UFC/mL

2 1 hora 0,067 nm 9,4X10​5​ UFC/mL

3 hora y media 0,199 nm 1,0X10​8​ UFC/mL

4 2 horas 0.562 nm 1,4X10​8​ UFC/mL

Tabla 1. ​Se puede observar los tiempos de incubación de la cepa de E.coli a 37 °C en
diferentes periodos de tiempo; con sus respectivas UFC/mL y su absorbancia.
Gráfica 1. ​Fase logarítmica de E. coli: En el eje X o eje de las abscisas se observa las
UFC/mL en logaritmo base 10 y en eje Y o eje de las ordenadas se observa el tiempo de
incubación en horas de la E. coli a 37°C.

Gráfica 2. ​Crecimiento bacteriano: podemos observar 3 de 4 etapas del crecimiento de una

población bacteriana: Latencia, crecimiento exponencial y fase estacionaria.
4.DISCUSIÓN
MESÓN 1.
Una vez realizadas las diluciones desde 1*10-1 , 1*10-2 , 1*10-3 y 1*10-4 en 4 tubos
eppendorf con solución peptonada , se tomó 1 ml de cada tubo y se sembró en superficie en
agar recuento con un asa de drigalski de la dilución 1*10-2 a la dilución 1*10-4 . Después de
haber incubado las cajas, se observó que el crecimiento no fue el esperado puesto que la
cantidad de colonias que crecieron en las siembras principales fue mucho menor o mucho
mayor que la que debía generarse; en la réplica, por el contrario, se observó un crecimiento
adecuado dependiendo de la dilución en que había sido sembrado cada agar. Se llegó a la
conclusión de que probablemente en las primeras siembras no se realizó el vórtex adecuado
(es decir, se dejó más tiempo del que correspondía), y por lo tanto la muestra había seguido
sedimentada. Por otro lado , en el momento de hacer la réplica se volvió a hacer vórtex , esta
vez de manera correcta y no dejando mucho tiempo entre el momento luego del vórtex y la
toma de la muestra para sembrarla. Posteriormente, se realizó el recuento de las diluciones
1*10-3 y 1*10-4 de las réplicas, debido a que las siembras iniciales no presentaron el
crecimiento apropiado. De la dilución 1*10-2 no se realizó recuento ya que habían muchas
colonias, a simple vista más de 300; de la dilución 10-3 se obtuvieron 132 colonias, es decir,
1,32*10 a la 6 UFC/mL; y de la dilución 10-4 se obtuvieron 56 colonias , o sea, 5,6*10 a la
6 UFC/mL .

MESÓN 2.
Luego de tomar una colonia de E. Coli e inocular en un Tubo con 20 ml de BHI durante 1
hora a 37°C e incubar, se tomó una alícuota del cultivo líquido y se llevó a medir la
absorbancia a 600nm en el espectrofotómetro, este valor fue de 0.067 correspondiendo a la
concentración de la muestra inicial.
Luego se hicieron diluciones del cultivo desde 1*10-3 a 1*10-5 en diluciones 1 en 10, sobre
agua peptonada. Luego de realizar estas diluciones se tomó 1ml de la dilución y se sembró
por duplicado en agar recuento.
Los duplicados quedaron así:
Duplicados 1*10-3
1. 18 UFC
2. 94 UFC
Duplicado de 1*10-4
1. 22 UFC
2. 2 UFC
Duplicado de 1*10-5
1. 2 UFC
2. 10 UFC
Para poder seleccionar la dilución (y su réplica) más adecuada se tuvieron en cuenta las
siguientes condiciones:
● Concordancia entre diluciones y duplicados
● La dilución elegida no debe tener más de 300 ni menos de 25 UFC
● Las cajas del duplicado elegido para el recuento no deben tener una diferencia mayor
de 25 UFC entre ellas.
Al momento de analizar las diluciones y sus réplicas teniendo en cuenta las condiciones
mencionadas anteriormente se llegó a la conclusión de que ninguna de ellas podría ser
seleccionada. No hubo concordancia alguna y se cree que esto fue debido a que después de
realizar vórtex a la muestra, ésta no se sembró inmediatamente, lo cual dió espacio a que la
muestra se sedimentara, y al momento de sembrar, no se sembró la cantidad óptima para que
el proceso fuera válido. Esto mismo ocurrió con 3 de las 6 diluciones.
Con el fin de realizar el ejercicio se eligió la dilución 1*10-3 con un total de 94 UFC,
realizando los cálculos para saber cuántas UFC se obtuvieron por mililitro se obtuvo un total
de 9.4*15 UFC/ml.

Usando la fórmula = (#UFC * Factor de dilución)/ ml de la muestra sembrada

ufc/ml= (94*(1*10-3))/0.1
UFC/ml= 940000 = 9.4*10^ 5

Se obtuvo que la cepa incubada durante 1 hora tuvo una concentración espectrofotométrica de
0.067 en una disolución de 1*10-3 y al sembrarlo en agar recuento se obtuvo 9.4*10^ 5
ufc/ml.

MESÓN 3.
El tubo con el que se realizaron las diluciones del mesón 3 se incubó previamente durante 2
horas a 37°C. Tras la toma de una alícuota que fue llevada al espectrofotómetro y arrojó una
absorbancia de 0.199. Las diluciones de 10*-3, 10*-4 y de 10*-5 se hicieron duplicado en
agar recuento. Las cajas con las diluciones de 10*-3 y 10*-4 presentaban contaminantes,
además de que superaban a simple vista 300 UFC, por motivos como estos se descartó la
posibilidad de tenerlos en cuenta para el recuento de colonias. Como mejor opción se tuvo las
cajas de 10*-5, que si bien superaba por mas de 25 UFC con el duplicado, se tuvo en cuenta
que eran las mas axenicas posibles. Una de las cajas de la dilución de 10*-5 tubo 100 UFC y
la otra 37 UFC. Comparando entre ambas se tuvo que tenían una diferencia de mas de 25
UFC, aunque eran las menos contaminadas, la caja de 37 UFC estaba mas contaminada que
la de 100 por lo que se decidió solo tener en cuenta la caja con 100 UFC en vez de
promediarlas, esto con el fin de evitar interferentes en el resultado.

Usando la fórmula = (#UFC * Factor de dilución)/ ml de la muestra sembrada.

ufc/ml= (100*(1*10-5))/0.1
UFC/ml= 1*10^8

Se obtuvo que la cepa de E. Coli incubada por 2 horas a una temperatura de 37ºC obtuvo una
absorbancia de 0.199 y una concentracion de 1*10^8 UFC.

MESON 4.
Se siguió el mismo procedimiento de los mesones anteriores, pero con la diferencia de que se
cultivaron diluciones de 1*10-4 hasta 1*10-6. A la hora de seleccionar el duplicado sobre el
cual se iba a hacer recuento, se debían tener en cuenta ciertos aspectos. 1) Debía haber
concordancia entre diluciones y duplicados. 2)El duplicado elegido debía dejarse contar, es
decir, si tenía demasiadas colonias, el recuento se volvería bastante tedioso y por
consiguiente dicho recuento podría salir con errores; por esta razón se dió un rango de menos
de 300 y más de 30 UFC por caja. 3) Las cajas del duplicado elegido para el recuento no
debían tener una diferencia mayor de 25 UFC entre ellas.

Siendo esto así se decidió tomar para el recuento las cajas de duplicado de dilución 1*10-5.
Sin embargo, este duplicado no cumplía con todos los requisitos ya que la diferencia de UFC
entre las cajas era mucho mayor a 25 UFC; por un lado había 90 UFC y por otro 196 UFC. A
pesar de esto, el duplicado más acertado era esté, dado que en el duplicado de dilución
1*10-4 la cantidad de UFC en cada caja difería mucho más, finalmente el duplicado con
dilución 1*10-6 contenía menos de 30 colonias.

Para calcular la cantidad de UFC de colonias en la dilución se debió tomar el promedio entre
las dos cajas de duplicado aunque esto no era lo correcto pero se realizo con el fin de
completar la practica ya que estos con un resultado no puede ser reportado minimo debe
haber concordancia entre el duplicado de una dilucion. El posible error en estos cultivos fue
el vortex, dado que se vió una diferencia bastante significativa en el número de UFC de cada
caja, hay que recordar que como se explicó anteriormente había concordancia entre
diluciones más no entre duplicados. Finalmente, usando la misma fórmula de los anteriores
mesones para calcular UFC/mL se obtuvo que la cepa incubada a 37°C x 2h tuvo una
concentración de 1,4*10^8 UFC con una absorbancia​ 0.562.

Fase logarítmica de E. coli: En esta gráfica no se logra apreciar el crecimiento de la E. coli

porque hay un dato que no concuerda con lo esperado, se cree que el error está entre el mesón
1 y 2 con respecto a los resultados obtenidos para las UFC/mL, de cualquier modo no se
puede saber quién cometió el error porque los duplicados no salieron de la manera correcta y
no se pudo hacer la corrección esperada.

Para sacar g, n, v y k la gráfica se debe realizar una gráfica en el eje X el número de células
en logaritmo base 10 (en este caso un indicador directo que es las UFC/mL que parte de la
idea que de una 1 célula produce 1 UFC) y en el eje Y el tiempo en horas).

Gráfica de crecimiento bacteriano: ​Algo importante a resaltar en la gráfica de crecimiento

bacteriano obtenida por el grupo, es que; se observa un patrón irregular entre las 8 y 10 a.m.,
como las mediciones se realizaron cada hora, pudo haber sido por un error de lectura (ya que
no hay más datos que confirmen realmente esta alza de crecimiento bacteriano).

Pero lo que sí es cierto, es que a la población bacteriana le tomó 1 hora a partir de ese
momento (9 a.m. y 10 a.m.) pasar a la etapa logarítmica o exponencial, lo que concuerda con
el mismo tiempo que le tomó para que se observará el crecimiento inesperado; así que
también se podría plantear que la población bacteriana comenzó un crecimiento logarítmico a
las 8 horas pero algún factor químico o físico interfirió en el periodo comprendido entre las 8
y 9 a.m, luego la bacteria logró adaptarse una vez más en 1 hora (que según ​esta hipótesis es
el tiempo que esta población bacteriana toma en su etapa de latencia en esta prueba).

5.CONCLUSIONES
Por parte del crecimiento logarítmico de la E. coli, no se puede realizar un mayor análisis
porque uno de los resultados no concuerda pero se puede concluir de la gráfica que del
tiempo de hora y media a dos horas la fase de crecimiento tuvo un cambio brusco,
probablemente porque la fase cambio de logaritmica a fase estacionaria pero no se puede
asegurar nada debido a que el procedimiento no se realizó de manera correcta lo cual afectó
los resultados.

En la gráfica de crecimiento bacteriano se pudieron comprobar las 4 etapas de crecimiento de

una población bacteriana, aunque se observó un comportamiento extraño en la fase lag o de
latencia.

El vortex se debe hacer de una manera correcta ya que esto puede afectar mucho los
resultados en un recuento de bacterias como se vio en la mayoría de resultados de los
mesones por esto el caldo con el inóculo se debe dejar en vortex el tiempo óptimo, no se le
puede aplicar ni muy poco ni mucho ya que puede que no se atrape el inóculo o dependiendo
de la bacteria la elimine.

6.BIBLIOGRAFÍA

[1] Michael T. Madigan; John M. Martinko; Paul V. Dunlap y David P. Clark; Brock
Biología de los microorganismos.12​a edición. España. Pearson Educación: 2009. Página 161 -
página 165.
[2] “Unidad III- Taxonomía y crecimiento bacteriano”. Universidad Nacional de Córdoba.
http://agro.unc.edu.ar/~microbiologia/wp-content/uploads/2014/04/unidad-3-taxonomia-
y-crecimiento-bacteriano.pdf​ <21/04/2018>

[3] EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY. Elika.eus. (2018). Escherichia coli - Ficha
técnica. [online] Conslultado el 21-04-2018 Disponible en :
http://www.elika.eus/datos/pdfs_agrupados/Documento84/3.Ecoli.pdf