I.

Objetivos

Extraer el ADN genómico de plantas con interés biotecnológico.

 Competencias a desarrollar:
o Específica: utilizar herramientas biotecnológicas, mediante la práctica
de extracción de ADN genómico.
o Genéricas: desarrollar y analizar los resultados obtenidos de la
extracción de ADN.

II. Marco teórico

 Introducción

El ADN es una molécula química cuyos componentes elementales se distribuyen

de manera lineal generando grandes secuencias lineales de información. La
información que define y codifica un carácter determinado se denomina gen (Lewin,
1995).
Las técnicas de extracción de ácidos nucleicos en eucariotas, está relacionada con
su ubicación en el núcleo celular y las propiedades físicas y químicas de todas las
biomoléculas celulares. Es preciso desorganizar la estructura de paredes y
membranas para liberar los ácidos nucleicos. Por mecanismos mecánicos y
posteriormente químicos a través de la solución de lisis, se actúa sobre las paredes
y las estructuras lipoproteícas de las membranas.
La extracción de ADN tiene como finalidad obtener la mayor cantidad posible del
ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores
de enzimas (Rocha, 2002). Diferentes métodos de extracción han sido descritos
para el aislamiento de DNA, en esta práctica se trabajará con la extracción de ADN
se realizará bajo dos metodologías: el método de CTAB y método convencional.
III. Pre-Reporte
Preparación de muestras, extracción y análisis de ácidos nucleicos
 Pre analítica: desde la obtención y preparación de la muestra inicial hasta
su transporte al laboratorio.
 Analítica: aplicación de procedimientos para la extracción de ácidos
nucleicos.
 Post analítica: validación técnica del informe analítico.

La muestra celular se obtiene y prepara a partir de órganos, tejidos o fluidos

biológicos: objetivo, tipo de célula, tipo de genoma y tipo de estudio. La biopsia es
un método invasivo de recogida, bajo condiciones quirúrgicas, de células o
porciones de tejido de un organismo vivo, con fines diagnósticos.

Disociación de muestra tisular

Contiene 3 estrategias las cuales son: la fragmentación mecánica, disgregación

química y digestión enzimática.

Separación de células

Gravedad unidad es la sedimentación por fuerza de gravedad (Velocidad de

sedimentación). Se tiene la centrifugación diferencial que se emplea con las células
de grandes diferencias de tamaño, al menos 10 veces. Y la centrifugación en
gradiente de densidad se divide en tres:

a) Métodos de barrera- a través de un medio de densidad constante.

b) Centrifugación zonal o velocidad de sedimentación.
c) Centrifugación isopicnica o equilibrio de sedimentación.
Caracterización celular y medidas de viabilidad

El concepto de viabilidad alude a la capacidad de una célula para realizar sus

procesos fisiológicos y bioquímicos, especialmente en lo que respecte a su
metabolismo y su capacidad de división.

Lisis de células

Comprende el fraccionamiento celular, la extracción directa o el fraccionamiento de

ácidos nucleicos y la fragmentación del DNA.

Preparación de fracciones subcelulares

Es la parte del sobrenadante que resulta de la disociación mecánica de un tejido por

homogeneización en un medio isotónico y posterior a lisis celular. Mediante la
centrifugación diferencial se separan sucesivamente núcleos, orgánulos y otras
estructuras celulares.

Tratamientos adicionales o complementarios

Aquí es el uso de las muestras frescas, mantenidas congeladas o añadir inhibidores

de nucleasas, esto para su solubilización se acude a la rotura celular por
homogeneización o resuspensión en presencia de detergentes y/o empleo de
disoluciones de alta fuerza iónica.

Extracción de ácidos nucleicos por solubilidad en fases inmiscibles

Los métodos drásticos alteran las estructuras y características de los ácidos

nucleicos, de ahí que son muchos los métodos suaves elaborados para eliminar las
impurezas de las preparaciones.
IV. Materiales y métodos
Material
 5 morteros
 5 Tubos de ensaye (de plástico, graduados, con tapa)
 5 pipetas
 2 vasos de precipitado
 2 micropipetas (10-20 microlitros y 20-200 microlitros)
 Tubos eppendorf (los necesarios)
 1 Licuadora
 Puntas de 10 y 200 microlitros (las necesarias)
 1 Autoclave
 Papel aluminio
 1 Balanza analítica
 1 Cámara de electroforesis
 1 Espectrofotómetro UV/VIS
 1 Centrifuga
 1 Picofuga
 1 Incubadora
 Sanitas o toallas de papel.

Reactivos
 Tris-HCl (150 mM, pH 8.0)
 EDTA (15 mM, pH 8.0)
 NaCl (1M)
 CTAB (2%)
 B-mercaptoetanol (0.1%)
 Etanol (96% y 70%)
 Agua libre de nucleasas
 Cloroformo, RNasa A, agarosa.
 Detergente casero (Axion Limón)
  Sal de mesa
 Jugo de piña natural

V. Procedimiento (Metodología). Tiempo estimado 2 horas.

Extracción de ADN por el método de CTAB
1. Primeramente lavar el material y secar perfectamente, para envolver
con papel aluminio.
2. Colocar el material listo dentro de la autoclave para esterilizar a una
temperatura de 121 °C.
3. Limpiar la planta con etanol y colectar del material biológico, 1 gramo
de tejido vegetal; a continuación triturar mecánicamente, en un
mortero, una licuadora o en nitrógeno líquido.
4. Colocar la muestra en un tubo de ensaye y adicionar 1 ml de buffer
CTAB (Tris HCl pH 8.0, EDTA 15 mM pH 8.0, NaCl 1M, CTAB 2%, B-
mercaptoetanol 0.1%), seguidamente incubar a 65°C durante 1 hora.
5. Adicionar 500 ml de cloroformo y centrifugar a máxima velocidad
durante 15 minutos a temperatura ambiente. Recuperar el
sobrenadante el cual se colocará en un tubo limpio.
6. Adicionar a la muestra 500 ml de alcohol 96% e incubar por 20 min a
4°C.
7. Centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
8. Desechar el sobrenadante y lavar la pastilla con etanol 70%.
9. Centrifugar a 7500 rpm durante 5 min.
10. Recuperar la pastilla y secar 10 minutos a temperatura ambiente.
11. Resuspender la pastilla en 50 microlitros de agua libre de nucleasas.
12. Cuantificar la muestra a 280 nm en un espectrofotómetro UV/VIS y
almacenar hasta su uso a -20°C. De acuerdo a las siguientes
consideraciones:
a) Limpiar cada una de las celdas con etanol al 70% y agua
 destilada.
b) Utilizar 1 ml de agua inyectable en una celda para el blanco.
c) Encender y configurar el equipo con los parámetros de 260 nm-
280 nm.
d) Medir cada una de las muestras, tomando 10 L de muestra
en una celda, colocar en el espectrofotómetro y medir. Hacer lo
mismo con cada una de las muestras.
e) Anotar los resultados de cada una de las lecturas.

Extracción de ADN por el método convencional

1. Primeramente lavar el material y secar perfectamente, para envolver con
papel aluminio.
2. Colocar el material listo dentro de la autoclave para esterilizar a una
temperatura de 121 °C.
3. Limpiar la planta con etanol y colectar del material biológico, 1 gramo de
tejido vegetal; a continuación triturar mecánicamente, en un mortero, una
licuadora o en nitrógeno líquido.
4. Colocar la muestra en un tubo de ensaye y adicionar 10 ml de Jabón, 3
g de NaCl y 1% Jugo de piña, seguidamente incubar a 65°C durante 15
minutos.
5. Filtrar la muestra en un papel filtro y adicionar a la muestra 5 ml de alcohol
96% e incubar por 20 min a 4°C.
6. Centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
7. Desechar el sobrenadante y lavar la pastilla con etanol 70%.
8. Centrifugar a 7500 rpm durante 5 min.
9. Recuperar la pastilla y secar 10 minutos a temperatura ambiente.
10. Resuspender la pastilla en 50 microlitros de agua libre de nucleasas.
11. Cuantificar la muestra a 280 nm en un espectrofotómetro UV/VIS y
almacenar hasta su uso a -20°C. De acuerdo a las siguientes
 consideraciones:
a) Limpiar cada una de las celdas con etanol al 70% y agua
destilada.
b) Utilizar 1 ml de agua inyectable en una celda para el blanco.
c) Encender y configurar el equipo con los parámetros de 260 nm-
280 nm.
d) Medir cada una de las muestras, tomando 10 L de muestra
en una celda, colocar en el espectrofotómetro y medir. Hacer lo
mismo con cada una de las muestras.
e) Anotar los resultados de cada una de las lecturas.

VI. Resultados
La práctica se comenzó a las 9:10 a.m. el día 26/08/16, siguiendo la
metodología propuesta. La planta con la que se trabajó fue “Siempreviva”
Sempervivum tectorum L (Figura 1). Debido a que la planta contiene mucho
jugo pegajoso, afecto en las dos muestras para poder obtener el ADN.
La muestra hecha por el método convencional se arruino por la cantidad de
cloroformo, además de que no fue conveniente este método (Figura 2) por lo
que solo se obtuvo la muestra por el método de CTAB.

Figura 1. Muestra vegetal de la planta “Siempreviva”.

 Figura 2. Muestra fallida por el método convencional

Figura 3. Muestra por el método CTAB, la pastilla obtenida se encuentra en

el fondo del tubo eppendorf.

Cuantificamos cada una de las muestras en un espectrofotómetro UV/VIS

después de haber ejecutado los dos métodos de extracción. Se tomaron las
consideraciones siguientes:
 Densidad óptica- Factor de dilución 1 ml
 7 muestras
  50 microgramos ml
 Parámetros de 260 nm-280nm

Los materiales usados fueron:

 Espectrofotómetro UV/VIS
 Agua destilada
 Agua inyectable
 Etanol al 70%
 2 micropipetas (10-20 microlitros y 20-200 microlitros)

Fueron 8 muestras contempladas al analizar (2 por equipo), sin embargo

surgió un error en una de las muestras al momento de añadir la cantidad de
cloroformo. Por lo tanto, se obtuvieron 7 muestras en total de todo el grupo.
(Figura 4). La siguiente tabla muestra los resultados correspondientes:

Muestra Cantidad Absorbancia Observaciones Absorbancia

por 2da vez

G1 10 L 0.00008 Correcta -
Hijo Pro 10 L -0.00004 La muestra salió -
negativa, no se pudo
repetir la muestra
porque se terminó.

X 10 L -0.00012 La muestra salió 0.00017

negativa, por lo tanto
se repitió la muestra
con 20 L.

Héctor 10 L 0.00005 Correcta -

CTAB ISP 10 L 0.00000 El resultado fue cero, 0.00008
se repitió la muestra
con 20 L.

XU 10 L 0.00005 Correcta -
HXCTAB 10 L 0.00028 Correcta -
 Figura 4. Las 7 muestras después de haberlas sacado del refrigerador.

Nota:
 El resultado de las lecturas que dieron negativas, ocurrió por la
cantidad de muestra que fue 10 L, por lo tanto se aumentó a 20 L,
y así se obtuvieron absorbancias positivas.
 La concentración de las muestras del equipo, en este caso solo se
pudo cuantificar una muestra (G1), se calculó de la manera siguiente:

[ ]= (50 ml) (Absorbancia) (1000 ml)

[ ]= (50 g/ml) (8x10-5) (1000 g/ml)
[ ]= 4 g/ml
VII. Conclusiones
Utilizando la planta Siempreviva para la extracción de ADN genómico por el
método de extracción CTAB y el método convencional, observando que en
el segundo método no fue eficiente para extraer ADN de la muestra vegetal,
se siguieron las indicaciones, sin embargo las propiedades de la planta.
Proponiendo así un método convencional muy distinto para detectar con más
detalle cuales fueron tales inconvenientes. En general, los conocimientos
aprendidos en clase se llevaron a la práctica, con una práctica sencilla pero
muy explícita.

VIII. Referencias
 Rocha-Salvatierra P. 2002. Teoría y práctica para la extracción y
purificación de ADN de palma de aceite. PALMAS 23(3): 10-17.
 Lewin 1995 Genes. Oxford University Press, New York p 120.
 Luque J. y Herraéz J. 2001 Biología Molecular e Ingeniería Genética.
Capítulo 11 y 18.

IX. Anexos
Para determinar las cantidades adecuadas en los reactivos ya mencionados,
se realizaron los siguientes cálculos:

a) Tris-HCl
A base de 1 L de agua
1 M=157.6 g
x= 23.64 g
1000 mM ---------- 157.6 g
150 mM ---------- x
 b) EDTA
A base de 1 L de agua
1 M=292.2 g
x= 4.3836 g
1000 mM ---------- 292.2 g
15 mM ---------- x

c) NaCl
A base de 1 L de agua
1 M=58.4428g
x= 58.4428 g
1 M ---------- 58.4428 g
1 M ---------- x

d) CTAB 2%
A base de 1 L de agua x= 0.002 L=20 ml
1 L ---------- 100%
x ---------- 2%

e) Mercaptoetanol 0.1%
A base de 1 L de agua
x= 0.001 L=1 ml
1 L ---------- 100%
x ---------- 0.1%

f) Etanol 96%
A base de 1 L de agua
1 L ---------- 100% x= 0.96 L=960 ml
x ---------- 96%
 g) Etanol 70%
A base de 1 L de agua
x= 0.70 L=700 ml
1 L ---------- 100%
x ---------- 70%