Anda di halaman 1dari 18

EKSTRAKSI, PEMISAHAN, DAN IDENTIFIKASI KLOROFIL

ANGGOTA :
1. Vanda Graveolita S (652017007)
2. Muhammad Ichsan A (652017015)
3. Achmad Yoga Chunaifi (652015025)
4. Adytia Cornelius (652015030)

PROGRAM STUDI KIMIA


FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA
2018
I. DASAR TEORI
Klorofil adalah pigmen pemberi warna hijau yang terdapat pada kloroplas sel
tanaman. Klorofil merupakan pigmen hijau tumbuhan dan merupakan pigmen yang
penting dalam proses fotosintesis. (Markus, 2013). Penyerapan cahaya oleh klorofil
ini disebabkan adanya peranan utama dari struktur porrin yang mengikat ion
magnesium (Mg2+), yang merupakan struktur utama klorofil (Akhirudin et al., 2015).
Klorofil a yang dapat berperan serta langsung dalam reaksi terang, yang mengubah
energi matahari menjadi energi kimia. Klorofil b hanya dalam satu gugus fungsional
yang di ikat pada porfirin. Klorofil terdapat dalam organel yang disebut kloroplas.
klorofil menyerap cahaya yang akan digunakan dalam fotosintesis. Ada yang
berwarna jingga berarti memiliki pigmen karotein, memiliki pigmen xantofil (kuning),
pigmen klorofil a (hijau biru), klorofil b (hijau kuning), dan pigmen antosianin (merah)
(Campbell, dkk, 2002).

Klorofil a dan klorofil b paling kuat menyerap cahaya bagian merah dan ungu
spektrum, cahaya hijau yang paling sedikit diserap maka apabila cahaya putih
menyinari struktur-struktur yang mengandung klorofil seperti misalnya daun maka
sinar hijau akan dikirimkan dan dipantulkan sehingga strukturnya tampak berwarna
hijau. (Khopkar, 1990).
Kadar dari klorofil yang terkandung dalam suatu organ tumbuhan dapat diukur
dengan metoda spektrofotometer. (Kimball, 1988). Spektofotometer temasuk dalam
analisa kuantitatif yang di dasarkan pada sifat warna larutan yang terjadi, atau
merupakan salah satu pembagian kalorimetri.
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-
komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase,
yakni fase diam dan fase gerak. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen
diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi).
Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi
kolom, kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Pemisahan
berdasarkan kromatografi adsorpsi, sangat tergantung pada distribusi pada kedua
fase cair dan padat.

Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif


dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom
berhasil atau tidak. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya
adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatome, selulosa dan lainnya yang
mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0,063 – 0,125 mm dilapiskan pada kaca,
lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. Fase gerak yang dikenal
sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh
kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh
gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Campbell, 2003).

II. TUJUAN
1. Menentukan % rendemen ekstrak yang diperoleh secara
maserasi/sonikasi
2. Menentukan kandungan klorofil a dan klorofil b dari ekstrak yang
diperoleh secara spektrofotometri
3. Menentukan fase gerak yang tepat untuk pemisahan komponen klorofil
secara kromatografi lapis tipis
4. Menentukan nilai Rf dari masing-masing komponen senyawa
5. Menentukan pola pemisahan yang terjadi pada KLT Preparatif
kromatografi kolom
6. Menentukan jenis komponen penyusun klorofil yang terpisahkan dan
membandingkannya dengan KLT

III. ALAT DAN BAHAN


1. Ekstraksi
 Alat :
- Neraca Analitis
- Alumunium foil
- Gelas Bekker
- Magnetic Stirrer
- Ultrasonikator
- Kertas saring
- Corong pisah
- Corong
- Gelas ukur
- Spektrofotometer
- Rotary evaporator
 Bahan :
- Sampel (daun singkong)
- Aseton
- Methanol
- Dietil ester
- Saturasi garam dapur
- Natrium sulfat
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
 Alat :
- Plat KLT
- Pipa kapiler
- Chamber
- Kertas saring
- Pinset
- Pensil
- Penggaris
- Pipet ukur
 Bahan :
- Ekstrak pigmen
- Aseton
- Heksan

3. KLT Preparatif
 Alat :
- Plat kaca preparative
- Pengaduk
- Gelas bekker
- Pipa kapiler
- Chamber
- Kertas saring
- Pinset
- Pensil penggaris
- Pipet ukur
 Bahan :
- Ekstrak pigmen
- Aseton
- Heksan
- Silika gel 60
- Akuades
4. Kromatografi
 Alat :
- Kolom
- Statif
- Klem
- Pipet tetes
- Kapas
- Pengaduk
- Gelas bekker
- Plat KLT
- Pipa kapiler
- Chamber
- Kertas saring
- Pinset
- Pensil
- Penggaris
- Pipet ukur
- Spektrofotometer

 Bahan :
- Ekstrak pigmen
- Aseton
- Heksan
- Silika gel 60
- Akuades

IV. METODE
Ekstraksi
1. Ditimbang 2 gram sampel yang telah dipotong kecil-kecil.
2. Sampel diekstrak dengan pelarut aseton : metanol (7 : 3, v/v) selama 30
menit menggunakan magnetic stirrer. Ekstraksi dilakukan dalam gelap
(tertutup alumunium foil). Sampel : Pelarut (1:10, b/v)
3. Ekstrak disaring dengan kertas saring kemudian ditentukan volumenya
dengan gelas ukur.
4. Ekstrak dituang ke dalam corong pisah dan ditambahkan dietil eter dengan
perbandingan 1 : 1 (v/v) terhadap ekstrak. Jika fraksinasi bertingkat, maka
dietil eter ditambahkan sebanyak dua kali (setelah langkah no 6) dengan total
volume tetap 1 : 1 (v/v) terhadap ekstrak.

Gambar 3. Proses Fraksinasi pada Corong Pisah


5. Dikocok perlahan dan diamati proses pemisahan pada corong pisah.
6. Ditambahkan saturasi garam dapur secara bertahap sampai terjadi
pemisahan.
7. Dikeluarkan lapisan atas kemudian ditambahkan natrium sulfat.
8. Disaring dan digenapkan dengan dietil eter menjadi 50 atau 100 mL (jika
ekstrak yang diperoleh mendekati 50 mL maka digenapkan menjadi 50 mL,
jika lebih maka digenapkan menjadi 100 mL) pada labu ukur.
9. Diukur serapan pigmen pada panjang gelombang 470; 642,2; dan 660,6 nm
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Dietil eter digunakan sebagai blanko.
10. Dihitung kandungan klorofil a, klorofil b, dan karotenoid total dengan rumus di
bawah ini.

Klorofil a = 10.05A660.6 – 0.97A642.2

Klorofil b = 16.36A642.2 – 2.43A660.6

11. Ditimbang kolf kosong


12. Ekstrak selanjutnya dikeringkan dengan rotary evaporator dan gas N2 jika
perlu.

Gambar 4. Proses Pemekatan Ekstrak dengan Rotary Evaporator


13. Ditimbang berat pigmen yang diperoleh beserta dengan kolfnya.
14. Dihitung persen (%) rendemen ekstrak.
15. Pigmen yang diperoleh disimpan dalam botol sampel yang tertutup
alumunium foil untuk digunakan analisis selanjutnya.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1. Dibuat garis melintang pada KLT selebar 1 cm sebagai batas bawah dan
batas atas.
2. Dibuat spot pada plat KLT menggunakan pipa kapiler.
3. Disiapkan chamber berisi campuran pelarut aseton : heksan dengan
perbandingan tertentu (ketinggian pelarut ≤ 0,5 cm)
4. Diletakkan plat KLT pada chamber yang telah dijenuhkan dan chamber
ditutup rapat.
5. Diamati pergerakan pigmen yang terjadi dan disudahi pemisahan setelah
pelarut mencapai batas atas.
6. Dikeluarkan plat dari chamber dan ditandai jarak dan warna spot yang muncul
selama pemisahan.
7. Diukur nilai Rf dari masing-masing spot yang terbentuk.
8. Diulang langkah-langkah diatas sampai diperoleh pemisahan yang baik
dengan variasi perbandingan pelarut. Campuran pelarut yang menghasilkan
pemisahan terbaik, digunakan sebagai pelarut untuk analisis-analisis
selanjutnya.

Gambar 5. Contoh KLT pada Berbagai Variasi Fase Gerak

KLT Preparatif
1. Dibuat KLT preparat (dilakukan 1 minggu sebelum praktikum dimulai) dengan
cara:
a. Dibersihkan kaca preparat dan dibilas menggunakan aseton.
b. Dibuat bubur silika dengan perbandingan 6 : 10 (b/v) dengan akuades.
c. Dituang silika ke atas permukaan kaca dan digoyangkan agar diperoleh
plat silika yang rata.
d. Dikeringkan KLT preparat dengan memasukkan ke dalam oven 100°C
selama 1 jam.
2. Disiapkan chamber yang diisi dengan fase gerak sesuai dengan KLT dan
sudah diberi kertas saring pada salah satu sisi dindingnya.
3. Sampel (ekstrak pigmen) ditotolkan membentuk garis horizontal pada
permukaan KLT preparat yang sudah diberi tanda garis setinggi 2 cm dari
permukaan bawah kaca.
4. KLT preparat dielusikan dalam chamber sesuai ukuran.
5. Elusi dihentikan ketika fase gerak telah mencapai batas atas (± 1 cm dari
permukaan kaca bagian atas).

Gambar 6. Contoh Hasil Pemisahan KLT Preparatif


6. Diamati hasil KLT preparatif dan dibandingkan dengan hasil KLT.

Kromatografi Kolom
1. Ditimbang 4 gram silika gel 60 dan dilarutkan dalam pelarut (fase gerak)
sesuai hasil percobaan KLT.
2. Disiapkan kolom lengkap dengan kapas penyangga seperti pada gambar di
bawah ini.
Gambar 7. Rangkaian Alat Kromatografi Kolom
3. Dibasahi permukaan kolom dengan pelarut KLT.
4. Diisi kolom dengan silika melalui dinding kolom (silika jangan sampai kering).
5. Dibiarkan kolom memadat dan terekuilibrasi.
6. Disisakan pelarut setinggi 1-2 mm dari permukaan kolom silika dan
diaplikasikan ekstrak pigmen sebanyak 1-2 pipet. Dibiarkan lapisan pigmen
masuk ke dalam gel.
7. Ditambahkan pelarut melalui dinding kolom (2 cm).
8. Diamati proses pemisahan yang berlangsung dan dijaga agar kolom tidak
kering.
9. Digambar skematik pemisahan pigmen dalam kolom, warna pigmen, dan
posisinya.

Gambar 7. Contoh Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom


10. Dikumpulkan setiap fraksi pigmen dan dianalisis jumlah spot-nya dengan
KLT. Plat KLT dapat divisualisasi secara visible menggunakan sinar UV bila
tidak terlihat.
11. Fraksi yang menunjukkan satu spot selanjutnya di-scanning pada panjang
gelombang 400 – 800 nm untuk ditentukan panjang gelombang
maksimumnya.
V. HASIL PENGAMATAN
Ekstraksi
Metode Ekstraksi Maserasi (Stirring)
Variabel Pengamatan Hasil
Massa sampel (g) 2,00 gr
Massa ekstrak pigmen (g) 14 mL
% ekstrak 17,5%
Absorbansi pada λ 470 nm 1,990 nm
Absorbansi pada λ 642,2 nm 1,046 nm
Absorbansi pada λ 660,6 nm 1,215 nm
Kandungan (mg/L)
- Klorofil a 11,1961 mg/L
- Klorofil b 14,1601 mg/L
- Karotenoid total 7,15155 mg/L

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)


Variabel Pengamatan Hasil
Fase gerak yang tepat 1:2 (aseton:heksan)
Jumlah komponen yang terpisahkan 5
Nilai Rf
- Spot 1 0,8
- Spot 2 0,54
- Spot 3 0,43
- Spot 4 0,28
- Spot 5 0,03
KLT Preparatif
Hasil pemisahan KLT Preparatif

Kromatografi Kolom
Variabel Pengamatan Hasil
Pola pemisahan pigmen Bening, Hijau pekat, Hijau tua, kuning
bening
Jumlah fraksi yang diperoleh 5
Fraksi yang menunjukkan satu noda 3
λ maks
- fraksi 1 (kuning) 430 nm & 670 nm
- fraksi 2 (hijau) 475 nm & 665 nm
- dst

VI. PEMBAHASAN
VII. KESIMPULAN
- Dari praktikum diatas didapatkan rendemen ekstrak sebesar 17,5% dari
proses maserasi (stirring).
- Dari proses spektrofotometri didapatkan perhitungan kandungan klorofil a
sebesar 11,1961 mg/L dan klorofil b sebesar 14,1601 mg/L dengan
perhitungan karotenoid total sebesar 7,15155 mg/L.
- Pada pemisahan komponen klorofil secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
didapatkan fase gerak yang tepat yaitu pada perbandingan aseton dengan
heksan (1:2).
- Pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) didapatkan 5 spot dengan nilai Rf
berbeda-beda. Spot 1 dengan nilai Rf 0,8 kemudian spot 2 dengan nilai Rf
0,54 kemudian spot 3 dengan nilai Rf 0,43 kemudian spot 4 dengan nilai Rf
0,28 dan spot 5 dengan nilai Rf 0,03
- Pada KLT Preparatif kromatografi Kolom didapatkan pola pemisahan pigmen
dengan 5 warna berbeda yaitu bening, hijau pekat, hijau tua, kuning tua, dan
yang terakhir kuning bening.
-

VIII. JAWAB PERTANYAAN


1) Sebutkan (minimal 3) kelebihan dan kekurangan ekstraksi secara maserasi
dan ultrasonikasi!
 Kelebihan ekstraksi secara maserasi :
 Alat yang digunakan sederhana
 Biaya operasionalnya relatif rendah
 Prosesnya mudah dan tanpa pemanasan
 Kelebihan ekstraksi secara ultrasonikasi:
 Dapat mempercepat waktu kontak antara sampel dan pelarut
 Lebih efisien dalam penggunaan pelarut
 Aman digunakan

 Kekurangan ekstraksi secara maserasi :


 Proses maserasi membutuhkan waktu yang lama
 Hasil ekstrak tidak sempurna, karena zat aktif hanya mampu
terektraksi sebesar 50%
 Pelarut yang digunakan banyak
 Kekurangan ekstraksi secara ultrasonikasi :
 Dapat merusak struktur senyawa
 Membutuhkan biaya yang tidak sedikit
 Membutuhkan proses curing pada prosesnya
2) Jelaskan bagaimana proses pemisahan pigmen klorofil yang terjadi pada
tahap fraksinasi (tahap pemisahan dalam corong pisah)!
Pada awalnya daun singkong diekstrak dengan aseton:metanol (7:3,v/v)
menggunakan magnetic stirrer dengan gelas beaker yang tertutup alumunium
foil. Kemudian disaring dengan kertas saring. Setelah itu ekstrak dituang ke
dalam corong pisah kemudian ditambahkan dietil eter dengan
perbandingan 1 : 1 (v/v) terhadap ekstrak. Setelah itu ditambahkan saturasi
garam dapur hingga membentuk pemisahan kemudian larutan garam dapur di
keluarkan dari corong pisah.

3) Sebut dan jelaskan (minimal 3) faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf!


1. Pelarut, karena perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam
komposisi pelarut dapat mempengaruhi nilai Rf
2. Suhu, karena perubahan suhu merubah koefisien partisi dan
juga kecepatan aliran
3. Ukuran dari bejana, karena Volume dari bejana mempengaruhi
homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan
penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika
bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama,
seperti perubahan-perubahan komposisi pelarut sepanjang
keras, maka koefesien partisi akan berubah juga.

4) Bagaimana hasil pemisahan komponen-komponen ekstrak klorofil pada KLT


Preparatif dan Kromatografi Kolom? Apakah sesuai dengan pemisahan pada
KLT? Jelaskan!
Pemisahan komponen pada KLT prerative terlihat lebih jelas dibandingkan
dengan pemisahan pada KLT. Sehingga spot pada KLT preparative terlihat lebih
jelas. Sama halnya yang terjadi pada kromatografi kolom, pemisahannya terlihat
lebih jelas. Namun untuk kromatografi kolom, pemisahan yang dihasilkan lebih
banyak dibanding dengan KLT dan KLT preparatif.

5) A. Apakah mungkin isolasi klorofil dilakukan HPLC(High Performance Liquid


Chromatograhpy) Berikan alasan!
B. Sebutkan kelebihan dan kelemahan isolasi klorofil secara HPLC
dibandingankan dengan metode praktikum!

IX. DAFTAR PUSTAKA


Akhiruddin Maddu, Paulus P Gareso, Sugianto. 2015. Karakteristik Optik Film Hibrid
ZnO/Klorofil yang Termodifikasi Logam Seng (Zn) dan Tembaga (Cu). OMEGA
Jurnal Fisika dan Pendidikan Fisika 1 (1) : 45-48. IPB. Bogor.
Campbell dkk. 2002 Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta: Erlangga
Campbell. 2003. Neil A. Biologi. Jakarta: Erlangga.
J.W. Kimball. 1988. Biologi Umum. Erlangga. Jakarta.
Markus Prima Kurniawan, Widodo Farid Ma'ruf, Tri Winarni Agustini. 2013. Pengaruh
Penambahan MgCO3 dan NaHCO3 dengan Perbedaan Pencahayaan terhadap
Stabilitas Pigmen Klorofil-A Mikroalga Chlorella vulgaris. Jurnal Pengolahan dan
Bioteknologi Hasil Perikanan 2 (3): 25-33. Jurusan Perikanan, Fakultas Perikanan
dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro. Semarang.
S. M. Khopar. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press. Jakarta.
X. LAMPIRAN
Ekstraksi

Sampel daun singkong Proses magnetic stirrer

Penyaringan ekstrak Proses fraksinasi


Pengukuran serapan pigmen beberapa Proses Rotary Evaporator
panjang gelombang

Penimbangan kolf+pigmen

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

KLT yang sudah diberi batas atas KLT pada campuran larutan
dan batas bawah

Hasil KLT yang dicelupkan di


beberapa jenis perbandingan larutan
campuran
KLT Preparatif

Hasil pemisahan KLT preparatif

Pembuatan plat silika

Kromatografi kolom

Hasil pemisahan kromatografi kolom


Beberapa warna pigmen pada klorofil