Parcial Unidades 2 y 3

Biotecnología Industrial y Ambiental

Ingeniería Bioquímica
Facultad de Ingeniería
Universidad de Antioquia
Mayo 2018

Usted trabaja para la farmacéutica Sanofi, en el departamento de mercado de producción

de insulina de origen biotecnológico. Como ingeniero, usted está encargado del proceso
de producción de la insulina recombinante a partir de cultivos en tanque agitado de
Escherichia coli. Por favor describa el proceso de recuperación y purificación de la
insulina, incluyendo todos los pasos vistos en clase y en el laboratorio (Disrupción celular
que utilizaría de acuerdo al tipo de células y cómo sería la extracción de proteínas),
explique cómo purificaría este tipo específico de enzimas y cómo determinaría si la
insulina conserva su actividad.

Nota: La idea es describir con sus palabras estos procesos, basándose también en referencias
de textos científicos para apoyarse, para esto por favor inclúyanlas apropiadamente: Autores,
año, revista, volumen, número y página. Por favor no incluir referencias de sitios web.
Producción de insulina de origen biotecnológico

1. DISRUPCIÓN CELULAR Y EXTRACCION DE LA PROTEINA

Para llevar a cabo la disrupción celular se empleará un homogeneizador de alta presión, ya

que este dispositivo es más utilizado para lisar grandes cantidades de bacterias, a través del
pequeño orificio de una válvula de homogeneización se bombea una suspensión celular a alta
presión seguida de la descarga súbita de la presión sobre la suspensión; esto provoca una
expansión instantánea que genera las turbulencias y el cizallamiento que, junto con la alta
presión, rompen las células (Tripathi, 2016). El principal componente de disrupción en este
proceso es la presión aplicada a la muestra y la posterior caída de presión en la válvula. De
esta manera se forman el choque y el esfuerzo de cizalla necesarios para inducir la ruptura
de las células en proporción a la presión de funcionamiento. La molécula recombinante nativa
se solubiliza usando agentes caotrópicos a través de un proceso conocido como extracción;
para el cual se utilizará urea.
 2. PURIFICACIÓN DE LA INSULINA

Las proteínas recombinantes que se acumulan intracelularmente en E. coli frecuentemente se

depositan en forma de cuerpos de inclusión (García et al., 2013). El objetivo del desarrollo
del proceso de purificación es lograr niveles más altos de pureza con un tiempo mínimo y un
menor costo. Después de la expresión exitosa de proteínas recombinantes de E. coli, habrá
una necesidad de un proceso de purificación para obtener un producto altamente purificado
para usos terapéuticos. La proteína recombinante desnaturalizada es el componente principal
de los cuerpos de inclusión y la separación inicial de los mismos por centrifugación es un
paso eficaz de purificación.

La centrifugación se usa para separar la biomasa celular de la fermentación caldo, para el

proceso en cuestión se propone utilizar una centrifugadora de cubeta tubular (tubular bowl);
ya que son capaces de centrifugar a alta velocidad hasta 20 000 g de fuerza y la provisión de
enfriamiento es muy útil para la purificación de proteínas.

La filtración es la técnica rentable para la separación de las células del caldo de fermentación;
para este proceso se llevará a cabo una microfiltración de flujo cruzado (CMF), ya que a
través del proceso de microfiltración por flujo cruzado podemos conseguir proteína con sus
propiedades intactas (ya que CFM no requiere la aplicación de calor y por lo tanto no se
produce la desnaturalización de la proteína) (Tripathi, 2016).

Otro problema confrontado durante la purificación de proteínas terapéuticas expresadas en

E. coli es la eliminación de las endotoxinas bacterianas (García et al., 2013); para tratar este
problema se propone utilizar una resina de intercambio aniónico: Q XL, de la firma GE
Healthcare, la cual posee un grupo intercambiador amino cuaternario; y que según Chen y
colaboradores reportan la reducción de hasta dos mil veces en los niveles de endotoxinas en
un paso cromatografico.

Por último, la determinación de la actividad de la insulina se realizará utilizando el método

DNS, el cual está basado en la medida de la cantidad de azúcares reductores (glucosa
+fructosa) liberados durante la hidrólisis de la sacarosa, catalizada por la invertasa. Para ello
se utilizará el reactivo 3,5-dinitrosalicilato (DNS; este reactivo fue introducido por Summer
en1921 para la determinación de sustancias reductoras en sangre y orina). En presencia de
azúcares reductores el 3,5-dinitrosalicilato es reducido a 3,5-diaminosalicilato. Este
compuesto presenta un máximo de absorción a 530 nm y, por lo tanto, el valor de la
absorbancia a dicha longitud de onda será proporcional a la concentración de azúcares
reductores (glucosa + fructosa) presentes en el medio.

REFERENCIAS
García, J., Santana, Z., Zumalacárregui, L., Quintana, M., González, D., Furrazola, G., &
Cruz, O. (2013). Estrategias de obtención de proteínas recombinantes en escherichia
coli. VacciMonitor, 22(2), 30–39.
Tripathi, N. K. (2016). Production and Purification of Recombinant Proteins from
Escherichia coli, (3), 116–133. https://doi.org/10.1002/cben.201600002