Teknik Pemisahan: Kromatografi

ABSTRAK
Kromatografi adalah teknik biofisik penting yang memungkinkan pemisahan, pengidentifikasian,
dan purifikasi komponen campuran untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Protein dapat
dimurnikan berdasarkan karakteristik seperti ukuran dan bentuk, muatan total, gugus hidrofobik
yang ada di permukaan, dan kapasitas pengikatan. dengan fase diam. Empat teknik pemisahan
berdasarkan karakteristik molekuler dan penggunaan tipe interaksi mekanisme pertukaran ion,
adsorpsi permukaan, partisi, dan eksklusi ukuran. Teknik kromatografi lainnya didasarkan pada
tempat dasar stasioner, termasuk kolom, lapisan tipis, dan kromatografi kertas. Kromatografi
kolom adalah salah satu metode purifikasi protein yang paling umum.

Kromatografi didasarkan pada prinsip dimana molekul dalam campuran dioleskan ke permukaan
atau ke dalam fase stasioner padat dan fase stasioner cair (stabil fase) memisahkan satu sama lain
sambil bergerak dengan bantuan fase gerak. Faktor-faktor itu penting pada proses pemisahan ini
termasuk karakteristik molekuler yang berkaitan dengan adsorpsi (cair-padat), partisi (cair-padat),
dan afinitas atau perbedaan antara berat molekulnya. Karena perbedaan ini, beberapa komponen
campuran bertahan lebih lama di fase diam, dan mereka bergerak perlahan masuk sistem
kromatografi, sementara yang lain berlalu dengan cepat ke fase gerak, dan membiarkan sistem
lebih cepat. Berdasarkan pendekatan ini terbentuk tiga komponen dasar teknik kromatografi.
• Fase stasioner: Fase ini selalu tersusun fase "padat" atau "lapisan cairan yang teradsorbsi di
permukaan sebuah dukungan yang solid ". Fase gerak: Fase ini selalu tersusun "Cairan" atau
"komponen gas".
• Molekul terpisah
Jenis interaksi antara fase diam, fase gerak, dan zat yang terkandung dalam campuran adalah
komponen dasar yang efektif pada pemisahan dari molekul satu sama lain. Metode kromatografi
berdasarkan partisi sangat tepat pemisahan, dan pengidentifikasian molekul kecil sebagai asam
amino, karbohidrat, dan asam lemak. Namun, kromatografi afinitas (yaitu kromatografi pertukaran
ion) lebih efektif dalam pemisahan makromolekul sebagai asam nukleat, dan protein.
Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan protein, dan dalam penelitian yang berkaitan
dengan sintesis protein; Kromatografi cair gas digunakan dalam pemisahan kelompok alkohol,
ester, lipid, dan amino, dan pengamatan interaksi enzimatik, sedangkan kromatografi saringan
molekuler digunakan terutama untuk penentuan berat molekul protein. Agarose-gel kromatografi
digunakan untuk purifikasi RNA, partikel DNA, dan virus.
Fase stasioner dalam kromatografi, adalah fase padat atau fasa cair dilapisi pada permukaan fase
padat. Fase gerak yang melayang di atas fase diam adalah fasa gas atau cair. Jika fase gerak cair
itu disebut sebagai kromatografi cair (KC), dan jika gas maka disebut kromatografi gas (KG).
Kromatografi gas diterapkan untuk gas, dan campuran cairan yang mudah menguap, dan bahan
padat. Kromatografi cair digunakan terutama untuk sampel termal tidak stabil, dan non volatile
Tujuan penerapan kromatografi yang digunakan sebagai metode analisis kuantitatif tersendiri dari
pemisahannya, untuk mencapai pemisahan yang memuaskan dalam interval waktu yang sesuai.
Berbagai metode kromatografi telah dikembangkan sampai bagian terakhir. Beberapa diantaranya
meliputi kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis (KLT), kertas kromatografi, kromatografi
gas, pertukaran ion kromatografi, kromatografi permeasi gel, kromatografi cair bertekanan tinggi,
dan afnitas kromatografi.
Tipe Kromatografi
Kolom kromatografi
Karena protein memiliki karakteristik yang berbeda seperti ukuran, bentuk, muatan bersih, fase
diam yang digunakan, dan kapasitas pengikat, masing-masing karakteristik komponen ini dapat
dimurnikan dengan menggunakan metode kromatografi. Di antara metode ini, paling sering
diterapkan kromatografi kolom. Teknik ini digunakan untuk purifikasi biomolekul. Pada suatu
kolom (fase stasioner) yang pertama sampel dipisahkan, kemudian dicuci buffer (fase gerak)
(Gambar 1). Kemudian mengalir melalui kolom bagian dalam bahan yang ditempatkan pada
fiberglass untuk dipastikan. Sampel dikumpulkan di bagian bawah perangkat dengan tergantung
waktu dan dan volume.

Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion didasarkan pada interaksi elektrostatik antara kelompok protein yang
dibebankan, dan bahan pendukung padat (matrix). Matriks memiliki ion yang berlawanan dengan
protein yang akan dipisahkan, dan afinitas protein ke kolom dicapai dengan ikatan ionik. Protein
dipisahkan dari kolom baik dengan mengubah pH, konsentrasi garam ion atau kekuatan ion dari
larutan buffer. Matriks penukar ion bermuatan positif disebut matriks penukar anion, dan
menyerap protein bermuatan negatif. Sedangkan matriksnya terikat dengan kelompok bermuatan
negatif yang diketahui sebagai matriks penukar kation, dan menyerap secara positif protein yang
dibebankan (Gambar 2)
Kromatografi gel-permeasi (molecular sieve) Prinsip dasar metode ini adalah menggunakan
dekstran mengandung bahan untuk memisahkan makromolekul berdasarkan perbedaannya dalam
ukuran molekul. Prosedur ini pada dasarnya digunakan untuk menentukan bobot molekuler
protein, dan untuk mengurangi konsentrasi larutan protein garam. Dalam gel-permeasi fase
stasioner kolom terdiri dari molekul inert dengan pori-pori kecil. Larutan yang mengandung
molekul dimensi berbeda dilewatkan secara terus menerus dengan laju aliran konstan melalui
kolom.
Molekul yang lebih besar dari pori tidak bisa meresap ke dalam partikel gel, dan mereka ditahan
di antara partikel dalam area terlarang. Molekul lebih besar melewati ruang antara partikel berpori,
dan bergerak cepat melalui bagian dalam kolom. Molekul lebih kecil dari pori-pori yang di pori-
pori, dan Sebagai molekul semakin kecil, mereka meninggalkan kolom dengan Waktu retensi yang
proporsional lebih lama (Gambar 3). Tipe Sephadeks G adalah yang paling sering digunakan
sebagai bahan kolom Selain itu, dekstran, agorosa, poliakrilamida juga digunakan sebagai bahan
kolom.

Kromatografi afinitas
Teknik kromatografi ini digunakan untuk purifcasi enzim, hormon, antibodi, nukleat.asam, dan
protein spesifik. Sebuah ligan yang bisa membuat kompleks dengan protein spesifik (dekstran,
polyacrylamide, selulosa dll) mengikat bahan pengisi dari kolom. Protein spesifik yang membuat
Kompleks dengan ligan dilekatkan pada solid support (matriks), dan ditahan di kolom, sementara
bebas protein meninggalkan kolom Sepuluh protein terikat meninggalkan kolom dengan cara
mengubah ioniknya kekuatan melalui perubahan pH atau penambahan larutan garam (Gambar 4).
Kromatografi kertas
Pada bahan pendukung kromatografi kertas terdiri dari lapisan selulosa yang sangat jenuh dengan
air. Metode ini kertas filter tebal terdiri dari penyokong, dan tetesan air menetap di pori-pori yang
dibuat stasioner " fase cair”. Fase gerak terdiri cairan yang tepat ditempatkan di tangki yang
mengembangkan. Kromatografi kertas adalah kromatografi "cair cair"

Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis-tipis adalah kromatografi " adsorpsi padat-cair ". Pada fasa stasioner metoda
ini adalah zat penyerap padat yang dilapisi piring kaca sebagai bahan. Adsorben semua padat zat
yang digunakan Dalam kolom kromatografi (alumina, silika gel, selulosa) dapat dimanfaatkan.
Didalam metode, fase bergerak bergerak naik melalui fase stasioner. Pelarut bergerak ke atas pelat
tipis direndam dengan pelarut dengan cara aks kapiler. Selama prosedur ini campuran sebelumnya
turun di bagian bawah bagian piring dengan pipet ke atas dengan tingkat aliran yang berbeda.
Pemisahan analit ini tercapai. Tingkat laju kenaikan tergantung pada polaritas material, fasa padat,
dan pelarut. Dalam kasus di mana molekul sampel tidak berwarna, flerting, radioaktif atau bahan
kimia spesifik. Zatnya bisa digunakan untuk menghasilkan warna yang terlihat produk reaktif
untuk mengidentifikasi posisi kromatogram. Pembentukan warna yang terlihat Bisa diamati di
bawah cahaya ruangan atau sinar UV. Posisi masing-masing molekul dalam campuran bisa diukur
dengan menghitung rasio antara jarak yang ditempuh oleh molekul dan pelarutnya. Nilai
pengukurannya disebut mobilitas relatif, dan diekspresikan dengan simbol Rf. Rf. Nilai ini
digunakan untuk deskripsi kualitatif molekul.
Kromatografi Gas
Dalam metode fase stasioner ini, kolom ditempatkan dalam alat, dan berisi fase statsioner cair yang
diserap ke dalam permukaan padat inert. Kromatografi gas merupakan sebuah kromatografi “Cair-
gas”. Fase pembawa yang konsisten adalah He atau N2. Fase gerak yang merupakan gas inert
dilewati mellui kolom di bawah tekanan tinggi . Sampel di analisis diuapkan, dan masukan ke
dalam sebuah fase gerak gas. Komponen yang terisi dalam sampel didispersikan antara fase gerak,
dan fase stasioner dan penyokong padat. Kromatografi gas sederhana, beraneka, dengan tinggi
sensitive, dan teknik penggunaan yang cepat untuk pemisahan yang sangat unggul pada molekul.
Ini digunakan untuk memisahkan jumlah yang sangat sedikit dari analit.
Kromatografi Dye-ligad
Perkembangan tekhik ini didasarkan pada demonstrasi kemampuan banyak enzim untuk mengikat
nukleotida purin untuk Cibacron Blue F3GA pewarna. Struktur cincin planar dengan kelompok
bermuatan negatif analog dengan struktur NAD. Analogi ini telah dibuktikan dengan demonstrasi
pengikatan zat warna Cibacron Blue F3GA pada adenin, situs pengikat ribosa di NAD. Pewarna
berperilaku sebagai analog dari ADP-ribose. Kapasitas pengikatan adsorben jenis ini adalah 10-20
kali lipat lebih kuat dari jumlah penyerap lainnya. Dalam kondisi pH yang sesuai, elusi dengan
larutan kekuatan ion tinggi, dan menggunakan sifat ionisasi dari adsorben, protein yang teradsorpsi
dipisahkan dari kolom
Hydrophobic interaction chromatography (HIC)
Dalam metode ini adsorben disiapkan sebagai kolom bahan untuk mengikat ikatan ligan pada
kromatografi afnitas yang digunakan. Teknik HIC didasarkan pada interaksi hidrofobik antara
rantai samping yang terikat untuk matriks kromatografi.
Kromatografi pseudoafnitas
Beberapa senyawa sebagai pewarna antrakuinon, dan azodyes dapat digunakan sebagai ligan
karena kadar afinitasnya terutama untuk dehidrogenase, kinase, transferases, dan reductases.
Kebanyakan dikenal jenis ini kromatografi adalah immobilisasi afnitas logam kromatografi
(IMAC).

High-prssure liquid chromatography (HPLC)

Dengan teknik kromatografi ini dimungkinkan untuk melakukan analisis struktural dan fungsional,
dan purifikasi banyak molekul dalam waktu yang singkat, teknik ini menghasilkan hasil sempurna
pemisahan, dan pengidentifikasian asam amino, karbohidrat, lipid, asam nukleat, protein, steroid,
dan molekul biologis aktif lainnya, HPLC, fase gerak dilewati melalui kolom di bawah tekanan
atmosfir 10-400, dan dengan tinggi (0,1-5 cm // detik) laju aliran. Dalam teknik ini, penggunaan
partikel kecil, dan penerapan presure tinggi laju aliran pelarut meningkatkan daya pemisahan,
HPLC dan analisisnya selesai dalam waktu singkat. Komponen penting perangkat HPLC adalah
depot pelarut, pompa bertekanan tinggi, kolom, detektor, dan perekam yang dipaketkan secara
komersial. Lamanya pemisahan dikendalikan dengan bantuan sistem komputerisasi, dan
materialnya yang bertambah.
Coskun, O., 2016. Invited review Separation techniques: Chromatography. North Clin Istanbul
2016;3(2):156-60 doi: 10.14744/nci.2016.32757.