Las enfermedades alérgicas representan una sobrerreacción del sistema inmune a

sustancias ambientales normalmente no peligrosas, como los ácaros del polvo, la caspa
de mascotas, el polen o el moho, y la incidencia de alergias en todo el mundo está
aumentando 1 , 2 . Los anticuerpos IgE son fundamentales para la mayoría de las
reacciones alérgicas y se unen a los receptores de alta afinidad (FcɛRI) presentes en los
mastocitos y los basófilos, sensibilizando estas células para responder a los
alérgenos. FcɛRI se expresa como un trímero con una cadena α y dos cadenas γ o como
un tetrámero con una cadena β adicional 3 . La cadena α de FcɛRI (FcɛRIα) se une a IgE
con afinidad subnanomolar 4 , 5, y las células que expresan FcɛRI están precargadas con
IgE y preparadas para la activación. Un segundo receptor IgE (CD23) se expresa en
células adicionales, incluidos los linfocitos B, donde se cree que desempeñan un papel
en la presentación del antígeno mediada por IgE y la regulación de retroalimentación de
la producción de anticuerpos IgE 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

La región IgE-Fc contiene tres dominios (Cɛ2-4). Los tres dominios afectan la unión al
receptor de IgE, aunque el fragmento Cɛ3-4 se une independientemente a FcɛRI y CD23
y contiene los residuos implicados en las interacciones del receptor de
IgE 13 , 14 , 15 ( figura 1a). La IgE-Fc homodimérica se une a FcɛRIα asimétricamente,
formando dos contactos no equivalentes con FcɛRIα en la parte superior de cada
dominio Cɛ3 denominado sitio 1 y sitio 2 ( Fig. 1b ) (referencia 5 ). Los reajustes
conformacionales entre los estados abierto y cerrado dentro del fragmento Cɛ3-4,
estabilizados por la unión de FcɛRIα y CD23, respectivamente, permiten que FcɛRI y
CD23 funcionen como inhibidores alostéricos recíprocos ( Fig. 1b ) (refs 14, 15 ). Por el
contrario, los dominios Cɛ2 no hacen un contacto extenso con los receptores IgE, sino
que forman contactos intramoleculares dentro de IgE, estabilizando una conformación
asimétrica 'doblada' de la molécula de longitud completa ( Fig. 1c ). El papel principal
del dominio Cɛ2 es contribuir a la disociación lenta de IgE de FcɛRIα (ref. 13 ).

Figura 1: Organización y reordenamientos conformacionales de IgE-Fc.

( a ) IgE y las ubicaciones relativas de los sitios de unión FcɛRIα- (púrpura) y CD23
(naranja). ( b ) Una representación de conformaciones abiertas y cerradas de
los dominios IgE-Fc 3-4 (incluido el mutante IgE-G335C-Fc 3-4 bloqueado en una
conformación cerrada), y una representación de la inhibición alostérica recíproca
por FcɛRIα (púrpura ) y CD23 (naranja). ( c ) Un esquema de la conformación doblada
de IgE y la posición relativa de los dominios Cɛ2.
Imagen de tamaño completo
 IgE ha sido un objetivo para el desarrollo terapéutico debido a su papel central en la
respuesta alérgica. El anticuerpo monoclonal anti-IgE omalizumab está actualmente
indicado para el tratamiento del asma persistente de moderada a grave y de la urticaria
idiopática crónica. Omalizumab ha demostrado una eficacia clínica sólida 16 , 17 ,18 y
promete una amplia gama de otras afecciones alérgicas, incluidos los regímenes de
desensibilización de alérgenos alimentarios orales 19. Omalizumab actúa principalmente
neutralizando la IgE sérica libre. Por lo tanto, también reduce los niveles de IgE en las
células que expresan FcɛRI, incluidos los mastocitos y los basófilos 20 , 21.. A medida
que los niveles de IgE en la superficie disminuyen en estas células efectoras alérgicas,
pierden la capacidad de unirse al alérgeno y experimentar una activación dependiente de
IgE.

Omalizumab recibió la aprobación de la FDA hace más de una década; sin embargo, no
se ha determinado ninguna estructura del complejo omalizumab: IgE. Para comprender
la base estructural de las interacciones omalizumab: IgE y su capacidad para inhibir la
unión a FcɛRI y CD23, determinamos la estructura del fab omalizumab unido a un
mutante del enlace disulfuro del fragmento IgE-Fc Cɛ3-Cɛ4 (IgE-G335C-Fc 3-4 ) a 2.5 Å
( Tabla 1 ). Omalizumab se une a los dominios de IgE Cɛ3 fuera del sitio de unión a
FcɛRI, similar a la proteína de repetición de Anykyrin diseñada para anti - IgE
(DARPin) E2_79, en buen acuerdo con estudios de mapeo previos del
epítope 22 , 23 , 24.. La estructura compleja aclara cómo omalizumab bloquea las
interacciones de IgE con los receptores de alta y baja afinidad. A pesar de la similitud
en omalizumab y sitios de unión a E2_79 en IgE, E2_79 es un inhibidor perturbador que
puede acelerar la disociación de complejos IgE: FcɛRI, mientras que omalizumab
tiene actividad disruptiva pobre ( ~ 1.000 veces más débil) 23 , 25 . La comparación de
los complejos omalizumab y E2_79 IgE proporciona información sobre el mecanismo
de inhibición disruptiva, que podría ayudar en el desarrollo de anticuerpos anti-IgE con
capacidades disruptivas mejoradas.

Tabla 1: Estadísticas de recopilación y refinamiento de datos.

Mesa de tamaño completo
La estructura de omalizumab también facilitó el diseño de un mutante IgE-Fc 3-4 (IgE-
R419N-Fc 3-4 ) que es resistente a la neutralización de omalizumab pero que es capaz de
unirse a CD23 y FcɛRI. Se han acumulado pruebas experimentales significativas que
sugieren que las vías reguladoras homeostáticas dependientes de IgE responden a la
pérdida de IgE unida al receptor inducida por el tratamiento con omalizumab, y podrían
contrarrestar o limitar el beneficio terapéutico del tratamiento anti-
IgE 8 , 12 , 26 , 27 , 28. , 29 , 30 , 31, 32 . Demostramos que el IgE-R419N-Fc 3-4mutante, en
combinación con omalizumab, puede intercambiar eficazmente IgE unida a células con
IgE-R419N-Fc 3-4 y que este tratamiento de doble inhibidor es más potente para bloquear
la activación de basófilos que cualquier inhibidor solo. Este enfoque de reducir
simultáneamente la IgE específica de antígeno, al tiempo que activa los receptores
FcɛRI y CD23 con una variante de IgE, puede utilizarse para investigar el papel de las
vías reguladoras dependientes de IgE durante el tratamiento anti-IgE y puede
proporcionar una ruta para mejorar la Terapias IgE.

Resultados
Estructura del complejo IgE-omalizumab
Anteriormente describimos un mutante IgE-Fc 3-4 (IgE-G335C-Fc 3-4), que contiene un
enlace disulfuro modificado en la posición 335 que atrapa el dominio IgE-Fc 3-4 en una
conformación cerrada con flexibilidad conformacional reducida 33 ( Fig. 1b ). Esta
variante conserva la unión de alta afinidad a omalizumab, pero no a FcɛRIα ( Figuras
complementarias 1 y 2 ). Empleando esta variante restringida IgE-Fc 3-4 , cristalizamos
el complejo IgE-G335C-Fc 3-4 : omalizumab-Fab (posteriormente denominado complejo
IgE: omalizumab). El complejo purificado ( Fig. 3a, b ) cristalizado en el P2 1grupo
espacial, rayos X difractados a 2,5 Å ( Tabla 1 ), y la estructura se resolvió mediante
reemplazo molecular utilizando las estructuras existentes IgE-G335C-Fc 3-
4 (referencia 33 ) y omalizumab-Fab 34 . La unidad asimétrica contiene dos copias de

IgE-G335C-Fc 3-4 y cuatro copias del omalizumab-Fab, proporcionando cuatro copias de

la interfaz IgE: omalizumab relacionadas por simetría no cristalográfica (NCS). La
densidad de electrones de la cadena lateral se resolvió bien en toda la IgE: interfaz de
omalizumab ( Figura 3c complementaria ).

El análisis de la estructura reveló que el omalizumab-Fab se acerca perpendicularmente

al dominio IgE Cɛ3, en contraste con los modelos 35 propuestos recientemente , y
establece contacto con sitios de unión simétrica en la cara de los dos dominios Cɛ3 del
dímero IgE ( Fig. 2a-c ) . Estos contactos se forman predominantemente entre los restos
omalizumab-Fab y C β3 β-hoja por debajo de los bucles de unión a FcɛRIα (FG, BC y
DE; Fig. 2d ). La alineación estructural del complejo IgE: FcɛRIα 5 con
el complejo IgE: omalizumab muestra que los bucles de unión están solo ligeramente
alterados dentro del complejo IgE: omalizumab en el sitio receptor 2 ( Fig. 2d).); por lo
tanto, omalizumab no parece inhibir las interacciones IgE: FcɛRIα al distorsionar el sitio
de unión a FcɛRIα. En cambio, el omalizumab-Fab se coloca entre los sitios de unión de
FcɛRI y CD23, bloqueando las interacciones con ambos receptores, con la cadena
pesada proximal al sitio CD23, y la cadena ligera proximal a los sitios de unión a
FcɛRIα ( Fig. 2d ) . Es de destacar que tanto la posición del epítopo omalizumab en la
cara de Cɛ3, como la orientación de unión perpendicular del fab omalizumab, sugieren
que omalizumab podría acercarse y dirigirse a un complejo IgE-FcɛRI preformado.

Figura 2: El complejo IgE: omalizumab.

Una visión general del complejo IgE: omalizumab. Azul, cadena pesada de
omalizumab; naranja, cadena ligera de omalizumab; y bronceado, IgE-G335C-Fc. ( a )
Un diagrama de dibujos animados de la unidad biológica, que muestra IgE-G335C-
Fc 3-4 y dos Fabs de omalizumab que unen sitios simétricos. ( b ) La vista lateral de la
unidad biológica del complejo IgE: omalizumab muestra que el omalizumab-Fab se
aproxima perpendicularmente a los dominios Cɛ3-Cɛ4. ( c ) La vista superior del
complejo revela los dos epítopos omalizumab no superpuestos y simétricos en cada
dominio Cɛ3 dentro de la IgE. ( d) La comparación de IgE: omalizumab, FcɛRIα (1F6A)
y CD23 (4EZM) complejos demuestra que omalizumab se une entre CD23 y FcɛRIα-
sitios de unión dentro del dominio IgE-Cɛ3. La alineación del complejo IgE:
omalizumab con el dominio Cɛ3 del complejo IgE: FcɛRIα, en magenta, no revela
perturbaciones importantes en los bucles de unión a FcɛRIα. ( e ) Omalizumab y Cɛ2
compiten directamente por los sitios de unión a IgE de la superficie de IgE.