6.

DETERMINACIÓN DE POLIFENOLOXIDASA (peras y manzanas)

(35, 63).

Fundamento:

Se basa el método en medir espectrofotométricamente, a intervalos de 1 minuto, el aumento de

absorbancia de una mezcla de la solución enzimática con ácido clorogénico como substrato. Al
graficar la absorbancia contra el tiempo, los resultados se expresan en aumento de absorbancia
por minuto y por g de proteína.

Reactivos:

1. Cloruro de potasio 0,3 M.

2. Solución tampón pH 5,2: 23,3 ml de solución de ácido cítrico 0,1 M (19,21 g en 1 litro) más 26,7
ml de sol. de fosfato disódico 0,2 M (53,65 g de + ó 71,7 g de + 12 en
1 litro) más agua destilada c.s.p. 100 ml.
3. Solución de ácido clorogénico 3,33 x M en solución tampón,
4. Solución de enzima: para extraer la enzima se pesan 70 g de manzana o pera mantenidas, por
lo menos dos horas antes en congelador a 0°C; luego se mondan y trozan. Se homogeneiza en
mezcladora eléctrica con KCl 0,3 M a 4°C, que actúa como liquido de extracción. La mezcla se
centrifuga por 30 min. a 10.000 rpm en centrifuga refrigerada a 0°C. El sobrenadante se filtra al
vacío y luego se enrasa a 200 ml con la sol. KCl.

Procedimiento:

En un matraz de 125 ml se colocan 25 ml de la solución tampón y 10 ml de la solución de ácido

clorogénico. Se mezcla suavemente y se mantiene por 10 minutos en un termostato a 30°C.
Luego se adicionan 5 ml de la solución enzimática ajustada a 0,1 mg/ml de proteína; se agita
suavemente unos segundos y se vuelve a llevar al baño de agua, a 30°C (sin agitación posterior).
A intervalos de 1 minuto o 30 segundos se lee el aumento de absorbancia a longitud de onda de
390 nm. Como blanco se usa una mezcla igual a la anterior, pero hervida por 10 minutos,
reconstituyendo su volumen original con agua.

Cálculos:

La actividad enzimática se mide al espectrofotómetro en % de transmitancia (% T), el cual se

expresa en absorbancia (A), aplicando la siguiente fórmula:

A = 2 - log T

Para expresar la actividad enzimática se grafican las absorbancias por minuto y por g de proteína
contra el tiempo (cada minuto) y se usa la pendiente inicial de la curva obtenida (porción recta).

6.1. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.

En un tubo del fotocolorímetro Klett-Summerson se colocan 5 ml de la solución enzimática

sobrenadante, se agregan 5 ml de ácido tricloroacético al 6% y se mide la extinción a 515 nm,
usando un filtro verde N° 54. Se usa como blanco una mezcla de 5 ml de agua más 5 ml de ácido
tricloroacético al 6 ó. Los valores obtenidos se pueden comparar con los de una solución tipo de
seroalbúmina de concentración igual a 2 mg/ml. E1 extracto enzimático original puede tener una
concentración en proteínas mayor que 0,1 mg por ml; para poder ajustarla después a esta cifra se
diluye con cloruro de potasio 0,3 M.

6.2. DETERMINACIÓN DE SUBSTRATOS POLIFENÓLICOS.

En la industria de alimentos se puede presentar el problema de efectuar una adecuada selección

de variedades de frutas que presentan en menor grado el fenómeno del pardeamiento enzimático,
sea por su menor contenido en substratos fenólicos, sea por su menor actividad enzimática (36).

Los estudios de substratos se pueden efectuar por las siguientes determinaciones:

a) Pardeamiento actual, que indica las posibilidades del substrato natural en condiciones óptimas
de actividad enzimática. En este caso, se mide la densidad óptica del color pardo que se produce
al oxidar el tejido vegetal, en este caso manzanas o peras, con aire, a pH adecuado y con adición
de sulfato de cobre, para permitir una actividad óptima de la enzima. Se usa como blanco otra
muestra, que en lugar de llevar cobre, contiene tiourea, que al unirse al cobre de la enzima inhibe
el pardeamiento. Los resultados se expresan en Unidades por 100 g de fruta, en que 1 Unidad
corresponde a una diferencia de 0,1 de densidad óptica.

b) Pardeamiento potencial, que mide una disponibilidad total de actividad enzimática, en

presencia de exceso de substrato. La determinación se hace en forma semejante a la anterior, con
la diferencia que se agregan 20 mg de catecol como substrato fenólico adicional. Los resultados se
expresan en las mismas unidades que en el pardeamiento actual.

c) Determinación directa de ácido clorogénico y de fenoles totales como substratos; se aplica

una reacción colorimétrica que se obtiene haciendo actuar el ácido clorogénico con ácido acético y
nitrito de sodio. Los fenoles totales se extraen con alcohol diluido y se miden con un reactivo
general de fenoles, según Folin a base de ácido túngstico o molibdico (36).

Estudios realizados entre las principales variedades de manzanas chilenas, permiten deducir que
la var. Winesap es la más aconsejable para su industrialización, por su bajo pardeamiento actual y
potencial. En peras se demostró que la variedad más recomendable es la Winter Bartlett, por su
menor actividad enzimática.

Al usar el anhídrido sulfuroso como agente de antipardeamiento (véase éste) hay que asegurarse
que el haya penetrado hasta el interior de la fruta, sobre todo cuando ésta es posteriormente
disgregada o si se trata de frutas que contengan mucho en sus tejidos, como sería el caso de
las manzanas, para evitar que se produzca el pardeamiento interno. Para verificar el grado de
penetración del al interior de las frutas se usa la llamada prueba del catecol, que consiste en
cortar en cruz la fruta o trozo de fruta que se ha sometido a la acción del , y luego agregarle en
la superficie una solución de pirocatecol al 1 %. Si la enzima no ha sido totalmente inactivada se
produce la oxidación del catecol y el consiguiente obscurecimiento de la fruta en la porción que
tenga enzima activa. Al emplear solución de ácido sulfuroso, la aplicación del test de catecol
comprueba que la penetración es casi completa a los 20Â’, a -5°C, mientras que con la sumersión
en bisulfito demora cerca de 24 horas, a la misma temperatura.