JUDUL: Strategi Penahanan untuk Produksi dari Protein Rekombinan pada Beras Transgenik

Author: Xianwen Zhang, Dongfang Wang, Sinao Zhao, & Zhicheng Shen (Cina)

ABSTRAK

Menggunakan beras transgenic sebagai sebuah bioreactor untuk produksi masa dari
protein farmasi dapat berpotensi mengurangi biaya secara signifikan. Namun, perhatian utama
terhadap beras transgenic ini adalah pada resiko penyebaran yang tidak disengaja pada
lingkungan dan menjadi bahan makanan atau persediaan pangan. Disini kami melaporkan sebuah
metode mitigasi untuk mencegah penyebaran beras transgenic yang tidak diinginkan dengan
strategi penahanan ganda, yang menerapkan sebuah metode terminasi yang selektif dan sebuah
teknologi tag visual pada T-DNA untuk transformasi. Kami membuat beras transgenic dengan T-
DNA yang telah diinsersi dengan gabungan gen proinsulin manusia dengan gen protein
fluorescent far-red mKate_S158A, sebuah kaset RNAi yang menekan ekspresi dari enzim
detoksifikasi bentazon CYP81A6, dan sebuah gen EPSPS sebagai penanda yang menseleksi dari
transformasi. Tes penyemprotan herbisida mengindikasikan bahwa jenis tanaman beras
transgenic dapatterbunuh secara selektif dengan sebuah penyemprotan oleh bentazon pada dosis
yang biasa digunakan pada ladang untuk pengendalian gulma padi. Selain itu, benih padi
transgenik berwarna merah terang karena protein neon merah yang menyatu, dan dapat dengan
mudah divisualisasikan di bawah cahaya siang dengan mata telanjang. Dengan demikian,
tanaman padi transgenik yang dilaporkan dalam penelitian ini dapat dibunuh secara selektif oleh
herbisida yang umum digunakan selama tahap pertumbuhannya, dan benih mereka dapat
dideteksi secara visual selama pemrosesan dan konsumsi setelah panen. Strategi penahanan
bawaan ganda ini dapat sangat meningkatkan kurungan beras transgenic.

INTRODUCTION

Tanaman transgenic sebagai sebuah bioreactor yang dipersembahkan sebagai sebuah

bentukan yang efektif untuk produksi protein yang bernilai pada skala besar. Diantara tanaman
yang berbeda dan organ tanaman, biji sereal muncul sebagai salah satu organ yang ideal. Biji
sereal merupakan organ yang alami dengan berisi protein tinggi, berisi air rendah, dan aktivitas
protease rendah. Varietas dari protein rekombinan telah berhasil diekspresikan pada biji beras,
seperti lactoferin manusia, serum albumin manusia, lipase, dan modifikasi virus hepatitis B
antigen gen SS1.

Beras merupakan salah satu makanan yang terpenting di berbagai belahan dunia, yang
pertama dan paling diperhatikan untuk kegunaannya pada keamanan lingkungan dan keamanan
pangan. Meski kebijakan regulasi ketat dan penahanan fisik dari bioreactor beras transgenic
dapat sangat mengurangi kemungkinan penyebaran tidak sengaja, kecelakaan dapat tetap terjadi.
Faktanya, beberapa kecelakaan telah dilaporkan pada beberapa tahun lalu. Karena beras
transgenic dan beras konvensional non transgenic penampilannya sangat identic, deteksi dari
beras transgenic memerlukan cara molekuler dan teknologi biokimia. Demikian itu, apabila beras
transgenic dicampur dengan beras konvensional nontransgenik, hal ini akan sulit dideteksi.

Metode penahanan fisik, strategi penahanan biologis, seperti transformasi plasmid

sterilisasi jantan, dan tenologi pembatasan penggunaan genetic (GURTs), yang ditujukan atau
dikembangkan untuk membatasi penyebaran transgene. Namun, beberapa dari strategi yang telah
dilakukan tidak menyelesaikan masalah, dan beberapa tidak cocok untuk tanaman biji-bijian
seperti jagung dan beras. Demikian itu, sebuah strategi efektif dan sederhana yang dapat
membatasi dan/atau mengatur penyebaran beras transgenic sangat diinginkan untuk penggunaan
beras transgenic pada produksi protein rekombinan.

Protein fluorescent merah dan protein fluorescent hijau memiliki kegunaan sebagai gen
pelapor untuk tranformasi tanaman. Tidak seperti protein fluorescent hijau, yang ditunjukkan
oleh cahaya UV, protein fluorescent merah jauh mKate_S158A dengan rangsangan pada 588 nm
dan 633 nm, bercahaya terang dibawah cahaya siang. Demikian proteinfluorescent merah
diekspresikan pada tanaman transgenic yang terlihat di bawah cahaya siang dengan mata
telanjang.

Pada laporan ini, kami menggabungkan startegi penghentian selektif bentazon dengan
metode penandaan warna menggunakan protein fluorescent merah mKate_S158A untuk
membuat beras transgenic yang selektif dan dapat dideteksi secara visual.

RESULTS

 Pembuatan bioreakstor beras transgenic dengan peralatan yang aman

1. Plasmid transformasi T-DNA biner dikpnstruksi berdasarkan pCAMBIAI300. T-
DNAnya diisi dengan gen pengkode protein fusi dari protein fluorescent merah
mKate_S158A dan proinsulin manusia, sebuah gen EPSPS untuk toleransi glifosfat,
dan sebuah kaset RNAi untuk menekan ekspresi dari gen pendetoksifikasi bentazon
CYP81A6 (gambar 1). Kami memindahkan T-DNA ini pada sebuah beras local
kultivar “Xiushui134” (O. sativa japonica) dengan metode transformasi media
Agrobacterium.

2. Total dari 235 transgenik T0 bebas dihasilkan dengan menggunakan glifosfat sebagai
agen penyeleksi. Kami menemikan bahwa 162 jalur transgenic T0 memproduksi biji
merah secara visual. Uji penyemprotan bentazon menunjukkan bahwa sekitar dua
pertiga dari kejadian ini sensitive terhadapt bentazon. Untuk mencari materi
transgenic yang hanya memiliki single copy dari transgene, yang sensitive akan
berwarna merah terang saat dianalisis dengan metode southern anaisis, maka
digunakan metode Southern analysis yang ternyata dihasilkan hanya R6, R11, dan
R42 yang memiliki single copy dari insersi T-DNA (gambar 2a).

3. Rasio dari traansgenik dan nontransgenik pada tanaman T1 adalah 3:1. Western
analisis dari protein G6 (EPSPS) pada semua beras transgenic dari ketiga materi di
 atas, meunjukkan pita specific sekitar 45 kDa yang menyatakan ukuran dari protein
G6 (EPSPS) (gambar 2b).

 Deteksi secara visual dari beras transgenic

1. Untuk melihat fluorescent merah pada biji beras transgenic, kami melihat secara
visual spikelet (biji yang masih ada kulit ari) biji dari T2 beras transgenik. Saat beras
transgenic tumbuh dari fase filling ke fase milk ripe, beras transgenic mulai
menunjukkan warna ungu kemerahan, yang berbeda dengan beras nontransgenik
(gambar 3a).
2. Ketika beras sampai pada fase ripe, maka warna merah dapat diamati dengan lebih
jelas (gambar 3b, 3c, 3d).
3. Ketika beras sudah masuk fase ripe komplit, maka warna merah akan terlihat lebih
terang (gambar 3e).
4. Warna merah ini ditunjukkan oleh bagian dari endosperm (gambar 3f). lebih jelasnya,
warna merah ini terlihat pada fase milk ripe sampai dengan komplit ripe dengan mata
telanjang.

 Penghentian selektif beras transgenic

1. Beras yang berisi 3 materi transgenic R-6, R-11, dan R42 ini dikultur pada media
hidroponik di greenhouse dan dianalisis dari sensitifitas mereka terhadap bentazon
dan glifosfat. 1 grup dari tanaman disemprot dengan bentazon 1500 mg/L dan grup
lain di semprot dengan glifosfat 20 mM.
2. Setelah 10 hari, kami menemukan bahwa semprotan bentazon membunuh semua
tanaman padi transgenic tetapi tidak untuk tanaman padi non transgenik (gambar 4a).
 3. Sedangkan, semprotan glifosfat ini membunuh semua beras non transgenic tetapi
tidak untuk tanaman transgenik (gambar 4b). Uji ini menunjukkan bahwa tanaman
beras transgenic ini dapat diseleksi dengan bentazon.

4. Untuk mengetahui hubungan antara sensitifitas bentazon dan suppresi dari mRNA
CYP81A6 pada tanaman beras transgenik, mRNA CYP81A6 pada tanaman beras dari
ketiga materi transgenik bebas yaitu R6, R11, dan R42 yang diukur dengan kuantitatif
RT-PCR. Hasilnya menandakan bahwa level transgenik dari CYP81A6 pada tanaman
padi transgenik pada semua dari ketiga materi adalah rendah daripada pada tanaman
kontrol non transgenik (gambar 5), sensitifitas dari bentazon ini dikarenakan oleh
adanya suspresi dari ekspresi CYP81A6 pada tanaman transgenik.

 Analisis dari protein gabungan pada biji beras transgenik

1. Untuk memeriksa ekspresi dari protein gabungan proinsulin (proinsulin + mKate
fluorescent merah), kami menggunakan analisis western blot dari ekstrak biji padi
transgenik dengan spesifik antibodi monoklonal pada proinsulin manusia ataupun
mKate. Sinyal yang kuat terdeteksi pada semua materi beras transgenik tetapi tidak
ada pada tanaman kontrol padi non transgenik dengan antibody yang melawat
(AGAINTS) proinsulin manusia maupun mKate (gambar 6a).
 2. Pita lemah dari ukuran terbesar atau terkecil telah diketahui, dan mereka
menunjukkan hubungan atau degradasi dari protein gabungan. Hasil ini mengusulkan
bahwa protein gabungan proinsulin manusia banyak diekspresikan dengan ukuran
yang diharapkan pada beras transgenik. Sebagai protein fluorescent yang telah
bergabung dengan proinsulin, munculnya warna merah terang pada endosperma dapat
menjadi indikator dari level ekspresi.

DISCUSSION

 Resiko penyebaran transgenic sekarang menjadi perhatian, transgenic tersebar pada fase
kultivasi via pollen.
 Metode baru untuk mengurangi risiko penyebaran transgenik sangat diinginkan. Strategi
yang digunakan pada penelitian ini merupakan metode baru.
 Strategi penahanan ganda ini dilaporkan sangat mengurangi risiko dari penyebaran
transgenic. Strategi ini memberikan langkah-langkah pengendalian untuk fase tanam serta
fase pengolahan dan konsumsi beras (gambar 7).
  Pada fase tanam, pengendaliannya ialah dalam bentuk seleksi dari penyemprotan
bentazon dengan dosis biasa seperti yang digunakan pada masa tanam yang berfungsi
sebagai anti gulma pada padi. Penyemprotan bentazon dapat mematikan tanaman padi
transgenic tanpa menimbulkan biaya tambahan.
 Selama fase pengolahan dan konsumsi beras, pengendaliannya dalam bentuk
memunculkan warna merah pada bijinya, sehingga dapat diseleksi secara visual dengan
mata telanjang.
 Namun, teknologi built-in ganda yang dilaporkan di sini tidak bermaksud mengganti atau
menghilangkan kontrol penyebaran fisik beras transgenik secara reguler.
 Dalam penelitian ini, protein fluorescent merah mKate_S158A telah menyatu dengan
proinsulin manusia untuk memvisualisasikan protein rekombinan. Metode ini mungkin
lebih disukai jika pemulihan protein target dari protein fusi secara teknis layak dilakukan
dan hemat biaya. Sebagai alternatif, kaset ekspresi independen dari warna merah protein
fluorescent juga bisa dihubungkan secara bersamaan dengan kaset ekspresi protein yang
diminati
 Metode dua kaset ini akan menghasilkan protein individu secara langsung, yang
kemungkinan akan berakibat pada pengurangan biaya untuk pemurnian protein dan
pengolahan.
 Namun, tingkat ekspresi dua gen yang saling terkait seringkali berbeda, dan
kemungkinan akan jauh lebih sulit untuk mendapatkan materi transgenic dari kedua gen
yang diekspresikan.
 Selain itu, kemungkinan pemisahan kedua kaset tersebut dengan rekombinasi, walaupun
pada tingkat yang sangat rendah, peluangnya jauh lebih tinggi daripada kemungkinan
pembagian gen fusi secara fungsional (alami).

MATERIALS DAN METHODS

Pembangunan Vektor Biner Untuk Transformasi Padi

Plasmid biner bernama p1300-450i-G6 telah dijelaskan sebelumnya, yang

berisi 207 bp urutan ulang CYP81A6 untuk interferensi RNA dan gen EPSPS G6. Secara
singkat, fragmen 207 bp dari ujung 5’ CYP81A6 diperoleh dengan PCR dari DNA genomik
beras menggunakan 450F primer dan 450R. Fragmen ini mewakili ujung 5’ CYP81A6 cDNA
dari 1 menjadi 207 bp. Fragmen 327 bp yang lainnya dari ujung 5’ CYP81A6 diperoleh dengan
PCR dari DNA genom padi yang sama menggunakan 450F primer dan 450R2 primer. Fragmen
ini mewakili ujung 5’ cDNA dari 1 menjadi 327 bp. Kedua produk PCR diklon ke vektor pMD-
T, dan kemudian dilepaskan dari vektor-T. Kedua fragmen ini diklon ke dalam vektor plasmid T-
DNA pCAMBIA1300 yang dicirikan dengan XhoI dan dephosphorylated. Plasmid yang
dihasilkan, berisi 207 bp urutan ulang CYP81A6 untuk interferensi RNA, dinamakan sebagai
p1300-450i.

Promotor poliuretanin-1 Zea mays (ZmUbi-1) diperoleh dengan PCR menggunakan

ZmUbiF-K dan ZmUbiR. ZmUbi-1 digunakan untuk ekspresi langsung gen G6 yang disatukan
dengan peptida transit kloroplas dari sintesis asam acetohydroxy Z. mays. Plasmid biner ini
dinamakan p1300-450i-G6.

Urutan 884 bp yang mengkodekan protein fusi fluoresen far-red protein mKate_S158A
(gb: EU383029) dan fragmen proinsulin manusia (gb: AGC54790) disintesis oleh Shanghai
Sangon Limited Corp, dengan modifikasi berikut: situs XbaI di ujung 5’ gen fusi; karboksilase
fosffoenolpiruvat jagung (PEPC) terminator dengan situs KpnI ditambahkan ke ujung 3’ gen
fusi. Promotor dan peptida sinyal protein penyimpanan beras Gt1 diperoleh dengan PCR
menggunakan dua primer, Gt1F dan Gt1R. Produk PCR pertama kali diklon ke vektor pMD18-T
dan diurutkan. Satu sisipan adalah promotor Gt1 (termasuk peptida sinyal) yang terpola dengan
HindIII dan XbaI, dan yang sisipan lainnya adalah protein fluoresen far-red. Konstruksi biner T-
DNA terakhir diberi nama p1300-450i-G6-red-proinsulin dan digunakan untuk transformasi
beras yang dimediasi Agrobacterium.

Transformasi Beras yang Dimediasi Agrobacterium

Transformasi T-DNA vektor plasmid p1300-450i-G6-red-proinsulin diubah menjadi

Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) dengan elektroporasi. Sebuah Kultivar padi lokal
''Xiushui-134'' (O. sativa japonica) ditransformasikan menggunakan metode transformasi yang
dimediasi Agrobacterium dijelaskan sebelumnya. Glyphosate (Sigma) konsentrasi akhir 2,3 mM
digunakan untuk seleksi dan regenerasi kalus transgenik. Kejadian yang ditransformasikan
secara independen dibudidayakan di rumah kaca pada larutan yang disiapkan dengan suhu
sekitar 18-25°C dengan cahaya 12-14 h.

Pemilihan Tanaman Homozigot

Tanaman T1 dari peristiwa transgenik R-6, R-11 dan R-42 ditanam sendiri-sendiri.
Tanaman homozigot diidentifikasi dengan memeriksa apakah ada segregasi transgen dalam
populasi tanaman T2. Tanaman homozigot digunakan untuk karakterisasi dalam penelitian ini.

Penyemprotan Herbisida

Sasaran tanaman padi pada tahap anakan disemprot dengan semprotan pegangan di
laju 100 mL/m2 untuk bentazon dan glifosat. Bentazon (solusi 48%) disemprot dengan
konsentrasi akhir 1500 mg/L. Untuk menguji toleransi glifosat, digunakan Roundup (41%
garam propylamine dari glifosat, Monsanto, USA). Itu diencerkan 20 mM kemudian
ditambahkan dengan Tween-20 ke konsentrasi akhir 0,01% untuk semprotan, dan pertumbuhan
tanaman dipantau setiap hari.

Ekstraksi RNA, Isolasi cDNA dan RT-PCR Kuantitatif (qRTPCR)

Tiga tanaman padi transgenik dari berbagai peristiwa transgenik, dan non transgenik,
tanaman kontrol dari kultivar yang sama diambil sampelnya pada 30 hari setelah
perkecambahan. Total RNA diekstraksi dari 100 mg daun menggunakan Isolasi Total Isolasi SV
System kit (Promega). Jumlah RNA yang sama diubah menjadi single-strand
cDNA menggunakan kit reagen PrimeScript RT (TaKaRa, Jepang). Untuk perbandingan
transkrip CYP81A6 antara tanaman transgenik, dan non transgenik kontrol, produk amplifikasi
PCR yang dihasilkan dengan menggunakan untai tunggal yang sama cDNA sebagai template
dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 1%. Beras Gen Ubiquitin digunakan sebagai kontrol
internal. Primer digunakan untuk qRT-PCR adalah R450-qF (5’
GGCGAGAAGAAGAGCATGAT) dan R450-qR (5’ GACATCGCCCATTCTGATGT). qRT-
PCR dilakukan dengan menggunakan SYBR Green Kit RT-PCR (BIO-RAD) dengan sistem
deteksi urutan ABI PRISM 7500 (Biosystem Terapan). Untuk setiap eksperimen qRT-PCR,
dilakukan tiga ulangan, dan dihitung nilai rata-rata.
Analisis Western Blot

Metode analisis western blot standar dilakukan. Untuk mendeteksi ekspresi protein fusi
mKate_S158A dan proinsulin manusia secara transgenik biji padi. Biji padi transgenik dan juga
biji padi kontrol tidak transgenik digiling menjadi bubuk dan kemudian dilarutkan dalam buffer
SDS. Setelah lisis dan disentrifugasi, fraksi terlarut dari sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE 10%
dan kemudian dicampur ke membran nitroselulosa.

Analisis Southern Blot

Southern blot dilakukan sesuai dengan DIG System Manual. DNA genom diisolasi dari
daun padi dengan menggunakan metode CTAB-based. DNA genom 50 mg dicerna dengan KpnI
dan ukuran fraksinasi pada gel agarosa 0,7% (w/v) dengan elektroforesis. DNA yang
didenaturasi dan dinetralisir kemudian dipindahkan ke membran nilon (Hybond-N +,
Amersham, Inggris) dengan menggunakan metode transfer kapiler. Probe hibridisasi
khusus untuk gen mKate_S158A disiapkan sesuai dengan Sistem Manual DIG. Probe
mKate_S158A diperkuat oleh PCR dengan menggunakan primer Red-F dan Red-R. Blot
dihibridisasi dengan probe pada suhu 55°C untuk semalam, dan kemudian dicuci dengan
2 × SSC, SDS 0,1% pada suhu 25°C selama 10 menit. Cuci kedua dengan 0.5 × SSC, 0,1% SDS
pada suhu 65°C selama 30 menit.

Uji Coba Lapangan

Baik tanaman padi transgenik maupun non transgenik ditanam dan diuji di lapangan di
Zhejiang University Farm di Hangzhou, China. Saat panen, sifat agronomi pada tanaman, jumlah
malai per tanaman, biji-bijian per malai dan berat 1.000 butir diukur, dicatat dan dihitung nilai
rata-rata.

TEMUAN PENTING

1. Teknologi built-in ganda yang dilaporkan di sini tidak bermaksud mengganti atau
menghilangkan kontrol penyebaran fisik beras transgenik secara regular.
2. Beras transgenic dapat dideteksi secara visual dengan mata telanjang yaitu karena protein
fluorescent merah yang diekspresikan di dalan biji beras.