5 BIOPROCESSOS PARA

PRODUÇÃO DE ENZIMAS
Elba P.S.Bon, Nei Pereira Jr.,
Leda Maria Fortes Gottschalk, Paula Sá-Pereira,
José Carlos Roseiro e Maria Antonieta Ferrara

SUMÁRIO
As enzimas industriais são majoritariamente produzidas por microrganismos, embora
alguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais e vegetais. Para o desenvolvi-
mento dos processos microbianos de produção de biocatalisadores, diversos aspectos
devem ser otimizados com vistas à obtenção de elevados rendimentos e produtividades:
linhagem produtora, matéria-prima empregada e formulação do meio de cultivo e oti-
mização de parâmetros operacionais. Os processos industriais compreendem um con-
junto de operações que incluem o tratamento da matéria prima, o preparo e esteriliza-
ção de meios de propagação e produção e a fermentação propriamente dita. A esta, se-
guem-se as etapas de separação e concentração de produto, seguidas ou não da sua pu-
rificação. Os processos industriais de produção de enzimas são desenvolvidos, em sua
maior parte, em cultivos submersos aerados, em biorreatores com agitação mecânica,
que permitem maior controle dos parâmetros operacionais. A batelada alimentada é a
forma mais empregada de condução do bioprocesso. O cultivo no estado sólido é
também utilizado, principalmente nos países orientais por apresentar vantagens para a
produção de algumas enzimas, especialmente as produzidas por fungos filamentosos.
Avanços recentes nas técnicas de biologia molecular, notadamente a expressão he-
teróloga em espécies microbianas seguras e de fácil cultivo, têm aumentando o leque de
enzimas obtidas por processos microbianos, permitindo a obtenção de maiores rendi-
mentos e produtividades. Estas técnicas devem continuar a impulsionar a diversificação
e o desenvolvimento da produção de enzimas em escala industrial.

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1ª prova
96 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

INTRODUÇÃO
As enzimas estão presentes em todas as células vivas, onde exercem a função de catalisa-
dores das reações que compõe as vias catabólicas e anabólicas do metabolismo celular.
Esses biocatalisadores são moléculas de proteínas e seu poder catalítico está associado à
conformação nativa, que depende de condições específicas de pH, temperatura e força
iônica do meio (ATLAS, 1997; MADIGAN et alii, 2000). Condições ambientais afasta-
das das ótimas podem provocar a desnaturação da biomolécula, isto é, mudança na sua
estrutura tridimensional nativa, freqüentemente irreversível, acompanhada de perda
de sua atividade catalítica.
Embora alguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais (por exemplo,
pancreatina, tripsina, pepsina e renina) e vegetais (por exemplo, papaína, bromelina,
ficina, malte, peroxidase), as enzimas industriais são, na sua maior parte, obtidas a par-
tir de microrganismos (LAMBERT e MEERS, 1983; EUROPEAN COMISSION, 2002;
ANTRANIKIAN, 2005; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006; SANT’ANNA JR., 2001). A tabe-
la 5.1 apresenta exemplos de enzimas comerciais microbianas.
Os microrganismos são as principais fontes de enzimas industriais e especiais devi-
do à grande variedade de atividades catalíticas, à possibilidade da produção das enzimas
por processos fermentativos em grande escala com a regularidade necessária e à simpli-
cidade dos requerimentos nutricionais. Muitas enzimas, entretanto, ainda são extraídas
de tecidos vegetais e animais, com sua produção influenciada pela sazonalidade.
Como as enzimas são proteínas, sua estrutura é codificada por genes específicos e a
síntese envolve transcrição, tradução e processos pós-traducionais (ATLAS, 1997;
MADIGAN et alii, 2000). Algumas enzimas estão sempre disponíveis e são designadas
constitutivas, enquanto outras, designadas indutivas, são sintetizadas em resposta às
condições ambientais. Com relação a estas últimas, as células possuem mecanismos de
regulação da expressão gênica, que são acionados, dentre outros fatores, por substânci-
as que podem exercer o papel de indutores, ativadores, inibidores ou repressores
(ATLAS, 1997 e MADIGAN et alii, 2000).
A biossíntese da enzima pode ser associada ao crescimento sendo, então, a taxa de
formação de produto proporcional ao aumento da biomassa; ou não associada ao cres-
cimento celular e, nesse caso, a taxa de formação de produto é independente da taxa de
crescimento celular ou varia com a taxa específica de crescimento de forma complexa
(NIELSEN et alii, 2003; SCHMIDELL et alii, 2001).
As enzimas microbianas podem ser intracelulares como a glicose oxidase, peri-
plásmicas como a invertase e a asparaginase de leveduras ou extracelulares, como as
proteases e as carboidrolases. As enzimas microbianas excretadas são normalmente
mais estáveis e produzidas em maiores quantidades. Estes biocatalisadores têm a fun-
ção principal de degradar macromoléculas presentes no meio ambiente, como a celu-
lose, o amido, a lignina e proteínas, para absorção dee seus componentes como nutri-
entes.

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 97

Tabela 5.1 Exemplos de enzimas comerciais obtidas a partir de microrganismos

Enzima Microrganismos produtores

aminopeptidase Aspergillus niger, A. oryzae, Lactococcus lactis, Rhizopus oryzae
Alfa-amilase Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, B.
licheniformis
Catalase Aspergillus niger, Micrococcus luteus
Celulase Aspergillus niger, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Humicola
isolens, Streptomyces lividans, Trichoderma reesei. T. viride,
Dextranase Chaetomium erraticum, Penicilium lilacinum
Alfa-galactosidase Aspergillus niger,
Beta-glucanase Aspergillus niger, A. aculeatus, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis,
Humicola isolens Talaromyces emersonii
Fitase Aspergillus niger
Glucoamilase Aspergillus niger, Rhizopus delemar, R. niveus, R. oryzae
Glicose isomerase Streptomyces murinus, S. olivochromogenes,
Hemicelulase Aspergillus niger, Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis
Inulase Aspergillus niger
Invertase Saccharomyces cerevisiae
Lactase Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis,
Lípase Aspergillus niger, Penicilium camembertii, Candida lipolytica, C.
rugosa, P. roqueforti, Rhizopus oryzae
Pectinase Aspergillus aculeatus, A. niger, A. pulverulentuns, Penicilium
funiculosum
Protease Bacillus halodurans, Aspergillus melleus, A. niger, A. oryzae, B. subtilis,
B. licheniformis, Penicilium citrinum, Rhizopus niveus, S. fradiae
Pululanase Bacillus acidopullulyticus, B. circulans
Xilanase Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Humicola insolens, Penicilium
funiculosum, Trichoderma reesei

Fonte: European Comission, 2002.

Embora a maioria das enzimas industriais seja exocelular e produzida por fungos e
bactérias, a tecnologia do DNA recombinante vem sendo crescentemente utilizada para a
produção de biocatalisadores. No atual estágio de conhecimentos, é teoricamente possível
expressar qualquer enzima de interesse, codificada por genes de origem animal, vegetal ou
de microrganismos, em microrganismos hospedeiros bem adaptados à fermentação em
larga escala. É de especial importância a expressão heteróloga nas bactérias Escherichia
coli, Bacillus subtilis e B. licheniformis, nas leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia pas-

1ª prova
98 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

toris e Hansenula polymorpha (estas duas últimas metilotróficas) e nos fungos Aspergillus
niger e Aspergillus oryzae (CEREGHINO e CREGG, 2000; GELLISSEN, 2000; ADRIO e
DEMAIN, 2003; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006). Exemplos de enzimas comerciais produ-
zidas por microrganismos recombinantes são apresentados na tabela 5.2.

Tabela 5.2 Exemplos de enzimas comerciais produzidas por microrganismos recombinantes.

Enzima Organismo doador do gene Microrganismo hospedeiro

aminopeptidase Aspergillus sp. Trichoderma reesei
Alfa-amilase Thermoactinomyces sp. Bacillus amyloliquefaciens,
B. subtilis
Arabinofuranosidase Aspergillus sp. Aspergillus niger
Catalase Aspergillus sp. Aspergillus niger
Celulase Myceliopthora sp. Aspergillus oryzae
Quimosina Estômago de bezerro Escherichia coli
Ciclodextrina gluconotransferase Thermoanaerobacter sp. Bacillus licheniformis
Alfa-galactosidase Guar (planta indiana) Saccharomyces cerevisiae
Beta-glucanase Trichoderma sp. Trichoderma reesei
Fitase Peniophora sp. Aspergillus niger
Glucoamilase Dado não disponível Pichia pastoris
Glicose isomerase Actinoplanes sp. Streptomyces lividans
Lacase Myceliopthora sp. Aspergillus oryzae
Lactase Kluyveromyces sp. Kluyveromyces lactis
Lípase Rhizomucor sp. Aspergillus oryzae
Pectina liase Bacillus sp. Bacillus licheniformis
Penicilina amidase Alcaligenes sp. Alcaligenes faecalis
Protease Rhizomucor sp. Aspergillus oryzae
Pululanase Bacillus sp. Bacillus subtilis
Xilanase Bacillus sp. Bacillus subtilis

Fonte: European Comission, 2002.

Abrindo ainda mais o leque de possibilidades do uso industrial de enzimas, exis-

tem os biocatalisadores produzidos por microrganismos extremófilos e, particularmen-
te, por aqueles do domínio Archea. Estes microorganismos vivem em ambientes hoje
considerados exóticos, mas que eram comuns na terra primitiva, tais como temperatu-
ras elevadas, em alguns casos superiores a 100°C, alta salinidade, valores de pH inferio-

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 99

res a 2,0 ou superiores a 10,0 e estresse nutricional. Apesar dos extremófilos serem co-
nhecidos há mais de 40 anos, só recentemente foi intensificada a busca por novas espé-
cies. O interesse biotecnológico corrente em enzimas destes microrganismos é motiva-
do por sua estabilidade em condições normalmente desnaturantes para enzimas meso-
fílicas. As extremozimas, além da sua termoestablidade, são mais estáveis ao pH, con-
centração de sais, pressão, solventes orgânicos e metais pesados, do que as enzimas me-
sofílicas, e sua atividade pode aumentar na presença de alguns detergentes. Seu uso po-
deria, em princípio, eliminar a necessidade da adição de reagentes estabilizadores de
enzimas, reduzindo os custos de processos enzimáticos.
Atenção particular vem sendo dada às extremozimas de microrganismos extremó-
filos e hipertermófilos. Um grande número de extremozimas de arquéas hipertermofí-
licas, intracelulares ou extracelulares, tem sido investigado e dados referentes à sua pro-
dução, purificação, caracterização estrutural e funcional estão disponíveis na literatura.
As extremozimas podem também formar a base de processos inteiramente novos.
O exemplo mais marcante é a Taq polimerase, de Thermus aquaticus, que é empregada
amplamente nos procedimentos de PCR (polymerase chain reaction). Esta técnica, in-
ventada em meados da década de 80 por Kary Mullis da Cetus Corporation, é atualmen-
te a base para análises forenses, como, por exemplo, o mapeamento de DNA (DNA-fin-
gerprinting) para exames de paternidade e procedimentos de criminalística. A técnica
PCR, também usada em diversas áreas de pesquisas e em diagnósticos médicos (por
exemplo, na detecção de infecção por HIV), aumentou a sensibilidade das técnicas de
procura de várias doenças genéticas, incluindo algumas formas de câncer.
Na PCR, uma enzima conhecida como DNA polimerase, copia repetidas vezes a fita
de DNA, produzindo grande quantidade de material genético. Este processo requer o
aquecimento e resfriamento da mistura de reação em repetidos ciclos. Na época em que
Mullis inventou a técnica, a polimerase utilizada era originária de microrganismos que
não eram termófilos e, assim, a atividade cessava na etapa de incubação a quente do pro-
cedimento e era necessária a reposição manual da enzima a cada ciclo. Para solucionar o
problema, no final da década de 80, os pesquisadores isolaram a DNA polimerase de
Thermus aquaticus (Taq polimerase), que é muito tolerante ao calor, o que levou ao de-
senvolvimento de uma tecnologia de PCR totalmente automatizada. Esta bactéria termo-
fílica foi isolada, em 1965, de uma piscina de água fervente do Parque Nacional Yellowsto-
ne, nos Estados Unidos da América. Para sobreviver, T. aquaticus sintetiza enzimas que
atuam em temperaturas elevadas, dentre as quais uma DNA polimerase, que auxilia a bac-
téria a produzir o seu próprio DNA. A polimerase de T. aquaticus é ativa em temperaturas
superiores a 95°C. Outras aplicações de PCR envolvem tanto exames de paternidade e
análises em criminalística. Mais recentemente, alguns usuários de PCR passaram a substi-
tuir a Taq polimerase pela Pfu polimerase, isolada da Archaea hipertermofílica Pyrococ-
cus furiosus, que tem atividade ótima em 100°C. O potencial industrial das extremozimas
é muito grande e, por esta razão, o número de extremozimas isoladas, clonadas e caracte-
rizadas vem aumentando rapidamente (ANDRADE et alii, 1999; ANTRANIKIAN et alii,
2005; ATLAS, 1997; EUROPEAN COMISSION, 2002; JORGENSEN, 1997; MADIGAN et
alii, 2000; MORACCI, 1995; NUNES, 1995; STETTER, 1999; WOESE et alii, 1990).
Apesar das diferenças existentes entre as diversas classes de microrganismos pro-
dutores de enzimas, principalmente entre os procariotas e eucariotas, e também entre

1ª prova
100 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

as enzimas com relação a massa molecular, propriedades físico-químicas e grau de gli-

cosilação, os mecanismos básicos da biossíntese enzimática são similares o suficiente
para permitir um tratamento genérico do processo microbiano da sua produção.

MICRORGANISMOS PRODUTORES: CARACTERÍSTICAS E

NUTRIÇÃO
A primeira etapa da produção microbiana de uma enzima de interesse consiste na iden-
tificação e aquisição do microrganismo produtor, que pode ser uma linhagem selvagem
ou modificada por genética clássica ou por técnicas de biologia molecular. A linhagem
de interesse pode ser adquirida de coleções de cultura científicas ou de serviço ou sele-
cionada a partir de amostras de solo, água, ar, tecidos vegetais como caules ou frutas em
decomposição, fezes de animais e vísceras de insetos como os cupins e outras fontes.
Idealmente, o microrganismo a ser utilizado em um processo de produção de enzi-
ma deve ter as seguintes características:
¡ Ser seguro sob o ponto de vista biológico (status GRAS – generally recognized as
safe).
¡ Apresentar elevada capacidade de síntese e excreção da enzima.
¡ Suportar condições ambientais adversas, relacionadas com a pressão osmótica, a
temperatura e a força iônica do meio.
¡ Ser tolerante à presença de substâncias tóxicas, que podem ser geradas no pro-
cesso de tratamento da matéria-prima ou pelo próprio metabolismo celular.
O melhoramento de linhagens produtoras, para atender total ou parcialmente os
critérios acima, tem sido fundamental para a produção de enzimas em larga escala. A mu-
tagênese clássica era tradicionalmente empregada com este objetivo. O uso recentemen-
te da tecnologia do DNA recombinante permite o aumento substancial do rendimento
em enzima através da utilização de promotores eficientes e da introdução de múltiplas có-
pias do gene que codifica para a enzima de interesse (PENG et alii, 2005; EUROPEAN
COMISSION, 2002; ADRIO e DEMAIN, 2003; OLEMPSKA-BEER et alii, 2006).
A manutenção e a preservação de microrganismos são etapas de extrema impor-
tância para assegurar a sua viabilidade e prevenir mudanças genéticas que levem à redu-
ção ou perda de propriedades fenotípicas. Técnicas de manutenção e conservação de
microrganismos estão amplamente descritas na literatura e incluem repicagens perió-
dicas, conservação em parafina ou em glicerol, liofilização e crioconservação (DEMAIN
e SOLOMON, 1986).
O crescimento do microrganismo em biorreatores para a produção da enzima de
interesse está diretamente relacionado à disponibilidade das substâncias necessárias a
suas necessidades nutricionais. Água, fontes de carbono e energia, nitrogênio e oxigê-
nio são algumas das necessidades comuns a todos os microrganismos. Os microrganis-
mos necessitam ainda de elementos minerais tais como fósforo, enxofre, potássio, cál-
cio, magnésio, sódio, ferro e, em alguns casos, cloro. Requerem também os chamados
elementos traços, que desempenham importante papel como constituintes de enzimas
e coenzimas. Estes últimos incluem manganês, cobre, zinco, molibdênio, cromo, ní-

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 101

quel, cobalto e boro e são, em geral, necessários em pequenas quantidades

(JENNINGS, 1988).
O potencial para metabolizar fontes de carbono varia entre os microrganismos. De
uma forma geral, os compostos orgânicos da natureza, incluindo desde os chamados
compostos C1 (CO, CO2, formaldeído, metanol, metilamina), até as macromoléculas
complexas (amido, proteínas, lipídios, celulose, hemicelulose, lignina, ácidos nucléi-
cos), podem ser utilizados como fonte de carbono e/ou energia, desde que os micror-
ganismos possuam os sistemas enzimáticos extra- e intracelulares e de transporte ade-
quados. As macromoléculas são inicialmente convertidas extracelularmente a subuni-
dades menores por enzimas hidrolíticas, sendo, então, transportadas para o interior da
célula e metabolizadas em vias catabólicas e/ou anabólicas. Os carboidratos são a prin-
cipal fonte de carbono e de energia, sendo a glicose a fonte de carbono universal
(KRÄMER e SPRENGER, 1993; MADIGAN et alii, 2000; ATLAS, 1997; CORTE-REAL et
alii, 2003).
Os microrganismos apresentam grande diversidade na assimilação de fontes de ni-
trogênio: os autotróficos são capazes de utilizar nitrato, amônio e, em alguns casos, ni-
trogênio gasoso como única fonte de nitrogênio. Outros, entretanto, necessitam do su-
primento deste elemento sob a forma de compostos orgânicos, como aminoácidos ou
uréia (MADIGAN et alii, 2000).
Muitos microrganismos são incapazes de sintetizar certos aminoácidos, purinas, piri-
midinas ou vitaminas que, sendo constituintes obrigatórios de proteínas estruturais ou
funcionais, ácidos nucléicos ou coenzimas, devem ser adicionados ao meio de cultura
sempre que necessário. Estas substâncias são denominadas fatores de crescimento
(MADIGAN et alii, 2000). Ressalta-se que microrganismos recombinantes podem reque-
rer a complementação do meio de cultura com fatores de crescimento como resultado
dos procedimentos de Biologia Molecular, que muitas vezes utilizam marcadores nutrici-
onais para a seleção dos transformantes (GLAZER e NIKAIDO, 1995; WALKER, 1998).
O oxigênio faz parte da composição da maioria das moléculas que constituem a es-
trutura celular e das que integram o metabolismo. Assim sendo o seu suprimento sob a
forma gazosa e/ou ligado molecularmente é essencial para a manutenção do metabo-
lismo da maior parte dos microrganismos aeróbios ou anaeróbios.

MEIOS DE CULTURA PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS

As características físico-químicas do meio de cultivo são de fundamental importância, não
apenas para o crescimento celular como também para o rendimento em produto. Isto
ocorre porque as células são capazes de responder aos estímulos químicos e físicos do
meio externo através de mecanismos bioquímicos que regulam a expressão gênica e a fisi-
ologia do microorganismo e, por extensão, seu desempenho na formação do produto de-
sejado. Conforme já mencionado, esses mecanismos são acionados, dentre outros fato-
res, por indutores, ativadores, inibidores e repressores (ATLAS, 1997; MADIGAN et alii,
2000).
A regulação por glicose da produção de enzimas extracelulares tem sido muito es-
tudada e é bem conhecido o efeito repressor deste açúcar na produção de varias enzi-

1ª prova
102 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

mas, como celulases, amilases (LAMBERT e MEERS, 1983) e invertase (DYNESEN et

alii, 1999; GEORIS et alii, 1999). Recentemente, a regulação por nitrogênio passou a
despertar interesse devido ao efeito negativo do sulfato de amônio na produção de al-
gumas enzimas como ligninases, peroxidases e particularmente glicoamilase produzida
por Aspergillus awamori (BON, 1993).
A regulação por nitrogênio de enzimas intracelulares de levedura tem sido extensi-
vamente estudada (MAGASANIK e KAISER, 2002) assim como a interrelação entre as
vias de sinalização da regulação da expressão gênica via o circuito do carbono e do nitro-
gênio (BERTRAM, 2002; COOPER, 2002). Adicionalmente, a partir dos estudos da regu-
lação por nitrogênio da enzima asparaginase II, localizada no espaço periplásmico de Sac-
charomyces cerevisie, e cuja atividade aumenta durante a estarvação por nitrogênio
(DUNLOP e ROON, 1975), aprofundaram-se os estudos sobre sua regulacão por nitro-
gênio e também a da enzima invertase, igualmente localizada no periplasma da célula da
levedura (BOM, 1997; OLIVEIRA, 2003; OLIVEIRA, 2005). Estes trabalhos identificaram
padrões comuns da regulação por nitrogênio das enzimas intracelulares e periplásmicas
de leveduras, indicando a importância desta regulação na expressão dos genes que codifi-
cam para enzimas industriais de interesse e por extenção no rendimento do processo de
produção. Assim sendo, identificada a regulação por nitrogênio, deve ser evitado, na for-
mulação do meio de cultivo, o uso de fontes de nitrogênio repressoras, como amônio, e
favorecido o uso de fontes não repressoras, como uréia ou prolina.
Processos microbianos industriais podem utilizar meios de composição quimica-
mente definida ou meios complexos. No primeiro caso, os componentes do meio são, na
medida do possível, qualitativa e quantitativamente conhecidos. Esses meios apresentam,
em geral, elevado custo e são empregados principalmente para a produção de enzimas te-
rapêuticas. Os meios de composição complexa, utilizados na maioria dos processos, em-
pregam matérias-primas industriais, provenientes principalmente do setor agrícola,
como por exemplo, melaço, açúcar não refinado, licor sulfítico, sucos de fruta e materiais
amiláceos (milho, arroz, batata, trigo, etc.) (EUROPEAN COMISSION, 2002; KRISHNA,
2005; SPENCER-MARTINS e SÁ-NOGUEIRA, 2003).
A matéria-prima é um dos componentes mais relevantes nos custos de produção,
podendo representar, em alguns casos, até 75% do custo total, sendo esta uma das ra-
zões para o crescente interesse no aproveitamento de resíduos lignocelulósicos agroin-
dustriais e florestais como matérias-primas para processos microbianos industriais.
Estes resíduos, dentre os quais destacam-se bagaço de cana-de-açúcar, sabugo de milho,
palha de arroz e farelo de trigo, são de grande interesse por não possuírem custos de
produção diretos. O uso em bioprocessos representa, assim, uma forma de se agregar
valor a resíduos abundantes, dando solução para seu acúmulo, que representa um sério
problema ambiental.
Viabilidade técnica, balanços energéticos e economicidade são aspectos relevantes
que devem ser considerados na escolha da matéria-prima. Em geral, esta deve apresen-
tar as seguintes características:

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 103

¡ Ter composição adequada para o crescimento do microrganismo e formação do

produto de interesse.
¡ Ter baixo custo de obtenção, beneficiamento, transporte e estocagem.
¡ Ter elevada disponibilidade e facilidade de padronização dos componentes.
¡ Não contribuir para dificultar os processos de separação do produto.
O perfil das matérias-primas tradicionalmente utilizadas nos processos microbia-
nos convencionais não sofreu significativas modificações nos últimos cinqüenta anos. O
uso da tecnologia do DNA recombinante, entretanto, vem gradativamente aumentan-
do a importância de fontes de carbono pouco utilizadas anteriormente. Como exem-
plo, a crescente utilização das leveduras metilotróficas Pichia pastoris e Hansenula poly-
morpha, para a produção de enzimas recombinantes preconiza o seu crescimento inici-
al em fontes de carbono menos repressoras como o glicerol e a indução do gene de
interesse com metanol (CEREGHINO e CREGG, 2000; GELISSEN, 2000).
As principais fontes de carbono e energia para os processos microbianos são os
açúcares, como glicose e sacarose. Outras importantes fontes são as matérias-primas
amiláceas e lignocelulósicas.
Os substratos na forma polimérica podem exigir hidrólise prévia, química ou enzi-
mática, se o agente microbiano não for capaz de sintetizar enzimas extracelulares neces-
sárias para a sua degradação. No caso de fermentações no estado sólido, pode-se pres-
cindir de pré-tratamentos, intensivos em energia e, conseqüentemente, onerosos, já
que muitos microrganismos têm a habilidade de atacar o complexo contendo os
polissacarídeos e outras macromoléculas.
A escolha da fonte de carbono é muito importante pois a síntese de diversas enzi-
mas está sujeita à repressão catabólica. A glicose, por exemplo, apesar de ser, em geral,
excelente fonte para crescimento celular, tem sido reportada, conforme já menciona-
do, como repressora para a produção de diversas enzimas, como á-amilase, celulase e
invertase. Para manter baixa a concentração de carboidrato durante o processo fer-
mentativo, este pode ser adicionado gradativamente durante o processo fermentativo
(batelada alimentada) ou ainda podem ser utilizadas fontes de assimilação lenta, como
amido ou lactose. Para a obtenção de rendimentos elevados de alguns biocatalisadores,
como lactase e pectinase, a presença do substrato é requerida para indução da síntese
da enzima (MADIGAN et alii, 2000).
Entre as fontes de nitrogênio inorgânicas, o sulfato de amônio é o sal mais utilizado
devido ao seu baixo custo, mas pode-se também empregar o nitrato de sódio. Adicional-
mente, existe uma grande disponibilidade de fontes de nitrogênio orgânico de grande
aplicação em processos microbianos industriais, como a uréia. As principais fontes de ni-
trogênio complexas empregadas são: extrato de levedura, rico em vitaminas do comple-
xo B e aminoácidos; licor da maceração do milho, subproduto da industrialização do mi-
lho, fonte bem balanceada em carbono, nitrogênio, enxofre e sais minerais, contendo
ainda vitaminas, como riboflavina, niacina, ácido pantotênico, biotina e piridoxina; fari-
nha de soja, resíduo da indústria de produção de óleo de soja, rico em nitrogênio, o qual

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104 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

é, entretanto, mais complexo e de mais difícil assimilação do que o nitrogênio do licor da

maceração do milho (EUROPEAN COMISSION, 2002; SANT’ANNA JR., 2001).
Da mesma forma que as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio devem ser esco-
lhida com bastante critério. Conforme mencionado anteriormente, fontes de nitrogê-
nio chamadas de preferenciais, ricas ou de fácil metabolismo, como o íon amônio, a
glutamina, a asparagina e a mistura de aminoácidos e peptídeos presentes na peptona e
em outros concentrados protéicos comerciais, são repressoras da produção de diversas
enzimas. Ao contrário, prolina e uréia, ornitina e alantoina, entre outros, chamadas de
fontes não preferenciais, pobres ou de difícil metabolismo, são fontes de nitrogênio
não repressoras e, portanto, o seu uso favorece, em geral, a produção de enzimas
(ADRIO, 2003; WALKER, 1998; MAGASANIK e KAISER, 2002; BON e WEBB, 1993).
A otimização da composição do meio de cultura para obtenção do máximo rendi-
mento em produto não é uma tarefa fácil. Abordagens empíricas têm sido tradicional-
mente adotadas, nas quais os efeitos de cada componente do meio sobre o rendimento
em biomassa e produto são investigados em frascos agitados. As fontes de carbono são
examinadas e, posteriormente, as fontes de nitrogênio, até que todas as combinações
dos componentes do meio tenham sido examinadas, determinando-se assim o meio de
composição otimizada. Ressalte-se que este procedimento envolve um grande número
de experiências e demanda bastante tempo, sendo os constituintes investigados
individualmente e, via de regra, ignorados os efeitos interativos entre os mesmos.
Métodos estatísticos, que permitem otimizar as concentrações dos componentes
fundamentais do meio, podem ser utilizados para aumentar a eficiência desta etapa.
Após seleção dos principais componentes do meio que afetam o rendimento em produ-
to e produtividade, eles são combinados em altas e baixas concentrações (ausente, se
não essencial para o crescimento), de acordo com uma metodologia estatística (plane-
jamento fatorial), que permite o planejamento de 2n experimentos, onde ‘n’ é o núme-
ro de variáveis envolvidas. Desta forma, o efeito de um componente individual no rendi-
mento em produto pode ser determinado com um número relativamente pequeno de
experimentos, mesmo que os demais componentes variem (DEMAIN e SOLOMON,
1986; RODRIGUES e IEME, 2005).
O valor do pH do meio de cultura é parâmetro de fundamental importância e tam-
bém deve ser otimizado, de forma a proporcionar um bom crescimento celular e eleva-
dos rendimentos em produto, devendo-se levar em conta, logicamente, a preservação
da atividade biológica da enzima. Se a produção da enzima de interesse não for associa-
da ao crescimento celular, o valor do pH ótimo da etapa de crescimento pode ser dife-
rente daquele da etapa de produção do biocatalisador. Este é o caso da produção de di-
versas enzimas heterólogas pela levedura metilotrófica Pichia pastoris, como por exem-
plo, a enzima asparaginase (FERRARA et alii, 2006).

PROCESSOS MICROBIANOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS

O processo microbiano de produção de enzimas, quer nativas ou recombinantes, com-
preende um conjunto de operações que incluem o tratamento da matéria prima, o pre-

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 105

paro de meios de propagação e produção, a esterilização e a transformação do substrato

em produto por via bioquímica, seguida de processos de separação e purificação do
produto. Um esquema simplificado é apresentado na figura 5.1.

TRATAMENTO DA
MATÉRIA PRIMA

PREPARO DO
EFLUENTE / TRATAMENTO /
MEIO
RESÍDUO APROVEITAMENTO

ESTERILIZAÇÃO

BIORREATOR DE BIORREATOR SEPARAÇÃO

PROPAGAÇÃO DE PRODUÇÃO DE CÉLULAS

INOCULAÇÃO BIOMASSA
FILTRAÇÃO
DO AR

BANCO DE MEIO ISENTO

CÉLULAS DE CÉLULAS
AERAÇÃO
ROMPIMENTO
CELULAR

PURIFICAÇÃO DA PURIFICAÇÃO DA
BIOMOLÉCULA BIOMOLÉCULA
INTRACELULAR EXTRACELULAR

BIOMOLÉCULA BIOMOLÉCULA
COM ALTO GRAU COM ALTO GRAU
DE PUREZA DE PUREZA

EFLUENTE /
RESÍDUO

TRATAMENTO / APROVEITAMENTO

Figura 5.1 Esquema simplificado de um processo microbiano de produção de enzima.

1ª prova
106 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Esterilização
A maior parte dos processos de produção de enzimas ocorre com culturas puras. Assim,
para prevenir contaminações, o bioprocesso é conduzido sob condições assépticas. Os
substratos sólidos são mantidos em câmaras a temperatura elevada por períodos de
tempo apropriados, enquanto que os meios líquidos são esterilizados no próprio bior-
reator ou em vasos separados.
A esterilização com vapor saturado sob pressão é a mais usual para meios de cultura e
equipamentos, e pode ser realizada em conjunto ou separadamente e, ainda, em batela-
da ou de forma contínua (BAILEY e OLLIS, 1986; RAJU e COONEY, 1993; SCHMIDELL
et alii, 2001).
Na prática industrial, é comum a esterilização de meios de cultura de forma des-
contínua em conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado sob pressão
através de serpentinas ou camisas (aquecimento indireto), ou introduzindo-se o vapor
saturado pelo difusor do vaso, sob agitação mínima (aquecimento direto). Neste último
caso, deve-se levar em consideração a diluição do meio de cultura causada pela conden-
sação do vapor ao entrar em contato com a superfície mais fria do meio. A temperatura
usual de esterilização é de 121°C.
Na esterilização descontínua, o tempo total de esterilização é relativamente gran-
de, podendo dar origem à decomposição de nutrientes termo-sensíveis, como as vitami-
nas, ou provocar reações indesejáveis entre os constituintes do meio, como por exem-
plo, reações entre aminoácidos e açúcares (reação de Maillard). Esta modalidade de es-
terilização vem sendo substituída, sempre que possível, pela esterilização contínua, na
qual a integridade dos constituintes do meio é conservada mais eficazmente, já que o
aquecimento e o arrefecimento são praticamente instantâneos.
Em processos aeróbicos, o ar deve ser esterilizado antes de ser fornecido à cultura.
Esta esterilização normalmente é efetuada por filtração com lã de vidro, material sinte-
rizado ou membranas apropriadas (SANT’ANNA JR., 2001; EUROPEAN COMISSION,
2002; RAJU e COONEY, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001).

Fermentação
Os processos microbianos de produção de enzimas ocorrem basicamente em cultivos
submersos e cultivos no estado sólido, sendo os primeiros os mais utilizados industrial-
mente.

Cultivo submerso
Os processos submersos são aqueles em que a célula produtora se desenvolve no seio do
meio de cultivo, sob agitação. No caso de fermentações aeróbicas, o oxigênio necessário à
população em desenvolvimento é suprido por borbulhamento de ar no líquido através de
um compressor. As fermentações são conduzidas em biorreatores aerados e agitados me-
canicamente (figura 5.2), em geral com volumes entre 20 e 200 m3, podendo chegar a 1
000 m3. Os parâmetros operacionais, tais como pH, temperatura, consumo de oxigênio e
formação de dióxido de carbono, são medidos e rigidamente controlados (MCNEIL e
HARVEY, 1990; LAMBERT e MEERS, 1983; EUROPEAN COMISSION, 2002).

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 107

Figura 5.2 Biorreator agitado mecanicamente.

Os processos submersos oferecem uma série de vantagens, tais como:

¡ Facilidade de controle de variáveis físico-químicas do processo.
¡ Maior eficiência de absorção de nutrientes e excreção de metabólitos pela célu-
la, levando a menores tempos de processo e conseqüentemente, a ganhos em
produtividade.
Dentre as desvantagens podem ser citados:
¡ Elevados custos com aeração e agitação, especialmente quando do uso de meios
reacionais com alta viscosidade e reologia complexa.
¡ Formação de espuma.
Os bioprocessos submersos podem ser operado de três modos: batelada simples,
batelada alimentada ou contínuo. A batelada simples, na qual uma suspensão celular é
adicionada ao meio de cultivo e o processo é transcorrido sem adição ou retirada de
meio reacional, já foi a forma mais utilizada de produção de enzimas microbianas, sen-
do, hoje em dia, pouco empregada. Caracteriza-se por alterações nas condições ambi-
entais a dutante todo o processo: as concentrações de nutrientes diminuem e de célu-
las, produtos e subprodutos aumentam (BAILEY e OLLIS, 1986; NIELSEN et alii, 2003;
NIELSEN e VILLADSEN, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001). O principal problema desta
forma de operar processos microbianos é decorrente de fenômenos de inibição pelo
substrato, produto ou outros metabólitos.

1ª prova
108 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Para contornar os problemas de inibição/repressão, outras formas de condução

podem ser utilizadas, como a batelada alimentada e suas variantes, que permitem a ma-
nutenção da concentração dessas substâncias em níveis subinibitórios/sub-repressores,
com implicações diretas no desempenho da célula (NIELSEN e VILLADSEN, 1993;
SCHMIDELL et alii, 2001).
A batelada alimentada é definida como um modo de operação em que um ou mais
nutrientes necessários ao crescimento celular e/ou formação de produto são adiciona-
dos ao biorreator de forma intermitente ou continua, sem que ocorra retirada de mate-
rial durante a operação.
A flexibilidade de operação oferecida por esta forma de fermentação é adequada a
processos microbianos em que o crescimento celular e/ou formação de produtos são
significativamente sensíveis à concentração do substrato limitante. É adequada à produ-
ção de várias enzimas extracelulares, uma vez que a formação destas biomoléculas é mu-
itas vezes sujeita à repressão pelo substrato. Embora a cultura em batelada simples tenha
sido inicialmente utilizada em muitos bioprocessos, a prática industrial mostra que o
cultivo em batelada alimentada tem efeito favorável no acúmulo de muitas enzimas ex-
tracelulares, sendo este processo hoje em dia muito utilizado na indústria de produção
de enzimas tais como amilases, celulases e proteases (EUROPEAN COMISSION, 2002).
Este modo de condução do bioprocesso tem sido também empregado com suces-
so para a produção de enzimas heterólogas pela levedura metilotrófica Pichia pastoris.
Neste caso, preconiza-se um cultivo multiestágio que permite atingir elevadas densida-
des celulares (da ordem de 100 g l-1 em peso seco), no qual, inicialmente, a célula cresce
em glicerol em batelada alimentada e, em seguida, a expressão da enzima é induzida
através do cultivo em metanol, também em batelada alimentada (GELISSEN 2000;
CEREGHINO e CREGG, 2000; FERRARA et alii, 2006).
Apesar dos processos em batelada simples ou batelada alimentada serem emprega-
dos com mais freqüência, a cultura contínua, na qual a alimentação de nutrientes e a reti-
rada de produtos é efetuada continuamente durante o processo fermentativo (NIELSEN
e VILLADSEN, 1993; SCHMIDELL et alii, 2001), é empregada em algumas situações,
como para a produção de glicose isomerase por Bacillus coagulans (LAMBERT e
MEERS, 1986).
A principal vantagem da cultura contínua está ligada à possibilidade de se operar o
sistema por extensos períodos de tempo, resultando em aumento de produtividade.
Adicionalmente, o agente biológico converte substrato em condições estacionárias,
que podem ser determinadas previamente para o seu melhor desempenho. Outras van-
tagens da condução contínua podem ser apontadas (BRITO, 2000): inexistência de
tempos improdutivos, levando o fermentador a permanecer muito mais tempo em ser-
viço; as operações que antecedem e sucedem o processo podem ser realizadas continua-
mente; possibilidade de instrumentação e controle automático, reduzindo os gastos
com mão-de-obra; e maior uniformidade do produto, tendo em vista que as condições
ambientais são mantidas constantes. Os principais problemas dessa forma de condução
são a baixa concentração da enzima em comparação à batelada alimentada e o alto risco
de contaminação e de degeneração da linhagem microbiana (EUROPEAN
COMISSION, 2002).

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 109

Cultivo no estado sólido

Não obstante a fermentação submersa ter sido durante muito tempo, e ser até hoje, a
tecnologia mais empregada para a produção de enzimas, existe grande interesse em uti-
lizar a fermentação no estado sólido com esta finalidade.
A fermentação no estado sólido é definida como um processo em que o crescimen-
to microbiano e a formação de produto ocorrem na superfície de substratos sólidos na
ausência de água livre. É distinta da fermentação submersa, em que, via de regra, os
substratos e outros nutrientes encontram-se na forma solúvel. Os substratos tradicional-
mente utilizados são produtos agrícolas, como arroz, trigo, painço, cevada, milho e soja,
além de substratos não convencionais, como os resíduos agroindustriais e florestais. Em
linhas gerais, a operação da fermentação no estado sólido pode ser realizada sem agita-
ção mecânica, com agitação ocasional ou contínua, ou em colunas recheadas com cir-
culação de líquido (MITCHELL et alii, 2000; PANDEY et alii, 2000; PANDEY et alii,
2001; KRISHNA, 2005; COUTO e SANROMÁN, 2006).
A fermentação no estado sólido apresenta as seguintes vantagens:
¡ Simplicidade dos meios de cultivo (o substrato sólido pode requerer somente
adição de água, embora outros nutrientes possam ser adicionados).
¡ Ausência de requerimentos de máquinas e equipamentos sofisticados.
¡ Possibilidade de uso de biorreatores com dimensões menores pelo fato do subs-
trato estar concentrado.
¡ Reduzido consumo de energia.
¡ Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminação.
¡ Condições de crescimento do microrganismo semelhantes às encontradas em
seu ambiente natural.
¡ Maiores concentrações de enzima em relação às fermentações submersas.
¡ Estabilidade da enzima excretada e baixo nível de repressão catabólica.
¡ Ausência de formação de espuma.
¡ Possibilidade de extração imediata do produto através da adição direta de sol-
ventes ou por filtração do meio fermentado.
¡ Pequenas quantidades de águas residuais.
Existem entretanto fatores limitantes nas fermentações no estado sólido, tais
como:
¡ Menor acessibilidade ao substrato.
¡ Problemas de transferência de massa (oxigênio e nutrientes), calor e quantida-
de de movimento.
¡ Dificuldades de controle de variáveis físico-químicas, tais como pH, temperatu-
ra, oxigênio e grau de mistura.
¡ Dificuldades no aumento de escala.
Diversas enzimas de importância industrial, como proteases, amilases, glucoamila-
se, celulases, xilanases e pectinases são produzidas por fermentação no estado sólido.

1ª prova
110 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Esforços também vêm sendo envidados para a produção de fitase, tanase e esterases,
dentre outras enzimas (KRISHNA, 2005; COUTO e SANROMÁN, 2006).
Dentre os microrganismos, os fungos filamentosos, principais produtores de enzi-
mas comerciais, são também os mais importantes e os que melhor se adaptam à fermen-
tação no estado sólido. Sua forma de crescimento em hifas e boa tolerância à baixa ativi-
dade de água e elevada pressão osmótica conferem aos fungos vantagens com relação
aos microrganismos unicelulares para a colonização de substratos sólidos. Poucos traba-
lhos foram desenvolvidos sobre a produção de enzimas por bactérias ou leveduras utili-
zando esta tecnologia. Como exemplos podem ser citados: a produção de alfa amilase
por Aeromonas caviae, de celulases por Bacilus subtilis e de lipases por Candida rugosa
(KRISHNA, 2005).
Quase todas as enzimas conhecidas e produzidas por outros processos poderiam,
em teoria, ser obtidas por fermentação no estado sólido. Entretanto, e apesar das diver-
sas vantagens citadas acima, esta tecnologia atualmente é muito mais desenvolvida no
mundo oriental.

Controle do bioprocesso
Conforme já mencionado, as enzimas podem sofrer desnaturação quando submetidas
a determinadas condições ambientais, que variam para cada enzima. Assim sendo, parâ-
metros operacionais do bioprocesso, tais como pH e temperatura, devem ser rigida-
mente controlados, de forma a garantir não apenas a manutenção das condições ótimas
de cultivo do microrganismo produtor, mas também a preservação da atividade
biológica da enzima.
A concentração de oxigênio dissolvido também tem efeito marcante no crescimen-
to celular e na síntese de enzimas. A maioria dos processos de produção de enzimas é ae-
róbica, mas em alguns casos a limitação do fornecimento de oxigênio pode ser vantajosa,
como no caso de produção de amiloglucosidase por Aspergilus niger (LAMBERT e
MEERS, 1986). Condições anaeróbicas são utilizadas para a produção da enzima colage-
nase por uma bactéria do gênero Clostridium.
Os processos aerados podem ser conduzidos com aeração natural ou forçada. Na
primeira modalidade, o oxigênio provém do ar ambiente. Grande parte dos processos
conduzidos no estado sólido, descritos anteriormente, é aerado de forma natural.
Nos processos microbianos com aeração forçada em culturas submersas, o ar at-
mosférico esterilizado é borbulhado no seio do meio, onde se dissolve parte do oxigê-
nio que é utilizado pelo agente microbiano. Algumas vezes emprega-se oxigênio puro
ou misturado com ar, o que resulta em aumento na transferência de massa da fase gás
para a fase líquido, com a conseqüente melhoria do processo (AUNINS e HENZLER,
1993; SCHMIDELL et alii, 2001).
O fornecimento de oxigênio a uma cultura em desenvolvimento constitui-se mui-
tas vezes na limitação da tecnologia de produção. É de fundamental importância, por
exemplo, a aeração de processos que utilizam leveduras metilotróficas para a produção
de enzimas heterólogas (GELISSEN 2000; CEREGHINO e CREGG, 2000).

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 111

SEPARAÇÃO, CONCENTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS

As operações que se seguem ao processo fermentativo (downstream) são de extrema
importância devido ao custo substancial de separação, concentração e/ou purificação
das enzimas de interesse tecnológico. O grau de pureza das enzimas comerciais varia de
preparações enzimáticas brutas até altamente purificadas e depende da sua aplicação fi-
nal. Além disso, a escolha do procedimento de purificação depende de sua origem (ani-
mal, vegetal ou microbiana).
Geralmente, as preparações enzimáticas comerciais consistem essencialmente do
sobrenadante da fermentação concentrado, ao qual podem ser misturados aditivos
para estabilizar a atividade enzimática. São removidas, apenas, substâncias que podem
interferir no processo onde o biocatalisador será utilizado. Etapas de purificação desne-
cessárias devem ser evitadas, pois são custosas em termos de equipamento, mão de obra
e perda da atividade enzimática (EUROPEAN COMISSION, 2002). A figura 5.3 ilustra
as etapas envolvidas na recuperação de enzimas e que envolvem procedimentos especí-
ficos e brandos em relação ao pH, temperatura e força iônica, adequados à manutenção
da conformação nativa do biocatalisador e, por extensão, da sua atividade.

Fermentação

Órgãos de animais Plantas Microrganismos

Rompimento Enzima Intracelular Enzima Extracelular

Extração
Rompimento

Filtração

Concentração

Purificação

Secagem

Produto Final

Figura 5.3 Etapas envolvidas na recuperação das enzimas (GERHARTZ, 1990).

1ª prova
112 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Quando a enzima é de origem animal, como a protease tripsina, os órgãos devem

ser transportados em baixa temperatura, congelados, triturados e as enzimas subse-
qüentemente extraídas com uma solução tampão. No caso de enzimas provenientes de
tecidos vegetais, como papaína e bromelina, o material vegetal é triturado e as enzimas
extraídas com o uso de solução tampão (GERHARTZ, 1990).

Etapas iniciais de separação e concentração

A maior parte das enzimas comercializadas industrialmente é extracelular e a primeira
etapa para o isolamento é a separação das células do meio de cultura. No entanto, existem
enzimas intracelulares de grande interesse tecnológico e, neste caso, a primeira etapa de
separação envolve a ruptura das células, que pode ser feita utilizando-se métodos mecâni-
cos, como a homogeneização em alta pressão e a moagem úmida. No primeiro método,
que é o mais utilizado, as células são rompidas por forças cisalhantes seguida de simultâ-
nea descompressão do sistema. Pode ocorrer inativação parcial das enzimas devido ao
aquecimento e às fortes forças cisalhantes, devendo haver resfriamento adequado duran-
te o processo. No caso da moagem úmida, são utilizadas bolas de vidro para a ruptura das
células. Além destes métodos, existem métodps outros não mecânicos, em que a ruptura
das células é feita por lise química, térmica ou enzimática (SCHÜTLE e KULA, 1993;
ABRAHÃO NETO, 2001; EUROPEAN COMISSION, 2002).
Após a ruptura das células, a próxima etapa é a separação das enzimas dos fragmen-
tos celulares. Esta operação, que na indústria é efetuada por filtração contínua, é bastante
complicada devido ao pequeno tamanho dos fragmentos celulares e à pequena diferença
entre a sua densidade e a do meio fermentado. No caso de se trabalhar com células maio-
res, como leveduras, pode-se usar decantação. Os métodos mais conhecidos para separa-
ção são: centrifugação, floculação, flotação, extração e filtração (GERHARTZ, 1990).
Atualmente, foram desenvolvidas centrífugas eficientes para separar as células e
fragmentos celulares em processo contínuo. A centrifugação tem sido empregada em
grande escala por ser sabidamente um método brando de simples aplicação e de baixo
impacto no rendimento final. O seu custo, no entanto, é relativamente alto e dificil-
mente atinge-se a clarificação desejada da corrente de alimentação. A extensão da apli-
cação das centrífugas depende do tamanho da partícula e do conteúdo de sólidos. Cen-
trífugas tubulares envolvem forças centrífugas maiores e podem ser utilizadas para sedi-
mentar partículas pequenas, mas não podem ser usadas continuamente. As centrífugas
com discos empilhados, também conhecidas como separadores, foram desenvolvidas
para serem usadas continuamente na remoção de material sólido de suspensões. Os de-
cantadores, que trabalham com baixa força centrífuga, são usados na separação de célu-
las maiores ou de proteínas precipitadas (STEPHANOPOULOS, 1993).
A floculação de células pequenas para a formação de partículas maiores pode ser
obtida pela adição de colóides minerais, sais ou polímeros orgânicos (SANTOS et alii,
1992). Os aglomerados podem ser então removidos por filtração ou por centrifugação.
Se não houver a formação de agregados, as células podem ser separadas por flotação. As
células são adsorvidas em bolhas de gás, levadas ao topo e acumuladas na espuma
(GERHARTZ, 1990).

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 113

A extração líquido-líquido em sistema aquoso de duas fases tem sido usada para
isolar enzimas intracelulares. Este método se baseia na mistura incompleta de diferen-
tes polímeros (por exemplo, polietileno glicol (PEG)/dextrana) (ENFORS et alii,
1992) ou de um polímero com um sal em solução aquosa. A primeira etapa da extração
separa os fragmentos celulares. Este método também pode ser utilizado na purificação
de enzimas.
Durante a filtração de suspensões, o aumento da espessura da torta que se forma e
da resistência causam a diminuição do fluxo. Dificuldades adicionais podem surgir de-
vido à compressibilidade do material biológico. Os filtros a pressão, por terem uma ca-
pacidade limitada, são geralmente usados na etapa final de filtração de soluções enzi-
máticas. Os filtros a vácuo são normalmente escolhidos devido à compressibilidade do
material biológico. O filtro rotatório a vácuo é muito usado para filtração contínua de
grandes volumes (EUROPEAN COMISSION, 2002).
Recentemente, a filtração em fluxo cruzado (“cross flow filtration”) vem ganhan-
do espaço para a separação (microfiltração) e para a concentração de enzimas
(ultrafiltração).
Na filtração convencional, a solução ou suspensão é pressionada contra a membra-
na, que deixa passar o solvente e os solutos dissolvidos. Os materiais em suspensão ficam
retidos, acumulando-se na interface da membrana/solução, um fenômeno conhecido
como polarização de concentração. Na filtração em fluxo cruzado, conhecida também
como filtração tangencial, a solução de alimentação escoa tangencialmente pela super-
fície da membrana, enquanto o permeado é transportado transversalmente à mesma.
Neste caso, é possível operar o sistema em regime estabelecido. A polarização de con-
centração continua presente, mas seu efeito é minimizado através da alteração da hi-
drodinâmica de escoamento da corrente de alimentação (HABERT et alii, 1997). Na fi-
gura 5.4 estão representados esquematicamente os dois modos de operação e suas
curvas típicas de fluxo do permeado em função do tempo, mostrando que no fluxo
cruzado pode-se atingir o regime estabelecido.
A microfiltração com fluxo cruzado tem sido bastante mencionada na literatura
(GOKLEN et alii, 1994; SANTOS et alii, 1992; JUNKER et alii, 1993).
Depois da separação, o volume a ser processado é geralmente grande, devendo ser
reduzido por concentração para garantir que se possa posteriormente alcançar uma
purificação economicamente viável. A concentração das enzimas pode ser feita através
de evaporadores a vácuo, por precipitação ou por ultrafiltração, em condições brandas
que não levem à inativação das enzimas. A precipitação é um procedimento simples
para a concentração de enzimas que pode ser efetuada por adição de sais, solventes or-
gânicos, soluções de polímeros ou por alteração do pH. No entanto, a precipitação é ge-
ralmente utilizada em pequena escala porque quando o volume a ser processado é mui-
to grande, o tempo de residência necessário é extremamente longo, especialmente no
caso de solventes orgânicos, podendo resultar na inativação das enzimas (GERHARTZ,
1990).

1ª prova
114 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

Filtração Convencional Filtração Tangencial

Fluxo Fluxo

Tempo Tempo
Figura 5.4 Filtração convencional x Filtração tangencial (GOTTSCHALK, 2002).

A ultrafiltração representa técnica atrativa para a concentração de enzimas e sua

purificação primária (KRSTIC et alii, 2007). A seletividade é definida pela relação de ta-
manho entre as espécies presentes e os poros da membrana. A enzima que se deseja
concentrar deve ser inerte em relação ao material da membrana e o fluxo permeado é
fundamentalmente convectivo devido à força motriz que é o gradiente de pressão. O
processo de ultrafiltração é um método comercialmente viável com uma alta produtivi-
dade, além de oferecer uma pureza razoável. Adicionalmente, é extremamente simples
do ponto de vista operacional e de escalonamento, por possuir sistemas modulares de
fácil operação (LI et alii, 2006).
Durante a concentração por ultrafiltração, independentemente da operação ser
do tipo convencional ou tangencial, a concentração do soluto na interface membra-
na/solução aumenta, já que a membrana é, supostamente, seletiva para o soluto. Imedi-
atamente inicia-se uma retrodifusão deste soluto em direção ao seio da solução, estabe-
lecendo-se um perfil de concentração do soluto nas proximidades da interface mem-
brana/solução. Este fenômeno, que é conhecido como polarização da concentração, é
reversível e se estabelece rapidamente podendo provocar uma queda inicial acentuada
do fluxo do permeado. Além disto, pode ocorrer queda do fluxo devido a problemas de
adsorção do soluto na membrana e eventual entupimento dos poros, fenômenos geral-
mente irreversíveis, conhecidos como fouling (GOTTSCHALK, 2002). Esta queda no
fluxo do permeado devido à polarização da concentração e ao “fouling” tem uma in-
fluência negativa na viabilidade econômica do processo com membrana, e por esta ra-
zão, medidas devem ser tomadas para minimizar sua incidência. Tanto a polarização da
concentração quanto o “fouling” dependem fortemente das condições operacionais e
da característica da membrana, como as propriedades da alimentação, peso molecular

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 115

de corte ou cut off, pressão transmembrana e a velocidade de escoamento tangencial da

alimentação (LI et alii, 2007). Para uma mesma pressão de operação, quanto maior a ve-
locidade de escoamento tangencial da alimentação menor será a polarização de con-
centração (HABERT et alii, 1997).
Diversos trabalhos na literatura utilizam a ultrafiltração para concentrar enzimas
(ROSEIRO et alii, 1993; GOTTSCHALK, 2002; TAKAC et alii, 2000; KRSTIC et alii,
2007; LI et alii, 2006) e para purificar enzimas em associação a outros métodos de purifi-
cação (BÔER et alii, 2006; RIDGWAY e TUCKER, 1999; SRINIVAS et alii, 2002; PARK et
alii, 1997; IVANOV et alii, 1996; GAWANDE e PATKAR, 2001).
A diafiltração consiste na operação dos processos de micro ou ultrafiltração com
uma alimentação contínua de solvente em vazão igual a do permeado. Trata-se em reali-
dade de uma operação de lavagem da solução problema. É bastante utilizada quando se
deseja purificar um determinado soluto de uma solução na qual os contaminantes são
compostos com dimensões menores do que a do soluto de interesse (CASTRO-OCHOA
et alii, 2005).
Na literatura já foram citados mais de 130 materiais utilizados para a fabricação de
membranas, no entanto, apenas alguns desses materiais alcançaram uso industrial e
poucos tiveram aprovação para aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e de
produtos infantis. Existem três polímeros principais utilizados para fabricação de mem-
branas utilizadas para microfiltração e ultrafiltração: acetato de celulose, poliamida e
polissulfona (CHERYAN, 1998). Recentemente, o uso de membranas cerâmicas tem
sido investigado na biotecnologia devido a sua resistência mecânica, térmica e química
(KRSTIC et alii, 2007).

Purificação de enzimas
Preparações enzimáticas parcialmente purificadas são suficientes para diversas aplica-
ções industriais. No entanto, para uso medicinal e analítico ou para aplicação em pes-
quisa, as enzimas devem ser extremamente puras, chegando, em alguns casos, em nível
de homogeneidade protéica. Procedimentos especiais, tais como cristalização, eletrofo-
rese, diferentes tipos de cromatografia, extração líquido-líquido e fracionamento com
espuma, são utilizados para purificação de enzimas, (SÁ-PEREIRA et alii, 2003; UHLIG,
1998). Esses procedimentos implicam, em geral, custos bastante elevados,
As enzimas podem ser concentradas por cristalização usando-se sais, como o sulfa-
to de amônio, ou solventes orgânicos, como etanol e acetona, mas geralmente a prepa-
ração final não apresenta alta pureza, o que limita o uso deste método (JESUS et alii,
1999; PARK et alii, 1997).
Já a eletroforese, em que a diferença da mobilidade das proteínas é imposta por
um campo elétrico, é usada apenas em laboratório pois o calor gerado durante o pro-
cesso e a interferência causada pela convecção são problemas associados ao escalona-
mento deste método (GERHARTZ, 1990; SÁ-PEREIRA et alii, 2000).
A cromatografia é uma técnica de fundamental importância para a purificação de
enzimas, que podem ser separadas de acordo com o seu tamanho, forma, carga, hidro-

1ª prova
116 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

fobicidade e afinidade bioespecífica. A separação cromatográfica é baseada na distribu-

ição dos componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.
Na cromatografia de peneira molecular ou cromatografia de exclusão, as molécu-
las de proteínas são separadas pelo seu tamanho e forma. Este método trabalha com vo-
lumes pequenos de soluções previamente concentradas, pois a capacidade máxima da
coluna é de 10% do seu volume. É comercialmente usada para separação e desaliniza-
ção de soluções enzimáticas (GERHARTZ, 1990; IVANOV et alii, 1996; GAWANDE e
PATKAR, 2001).
Na cromatografia de troca iônica, a separação baseia-se na carga líquida das proteí-
nas presentes em uma mistura. A carga é influenciada pelo pH e esta propriedade é uti-
lizada para separar as espécies protéicas. A capacidade de processamento de volumes
maiores de amostras diluídas torna este método bastante útil para aplicação industrial,
desde que se disponha de uma matriz de troca iônica com boa resolução, com altos flu-
xos e resistente ao gradiente salino e à mudança de pH (ABRAHÃO NETO, 2001;
EUROPEAN COMISSION, 2002).
A cromatografia por interação hidrofóbica baseia-se na interação das regiões hi-
drofóbicas das proteínas com os grupos hidrofóbicos da matriz. A adsorção ocorre em
altas concentrações salinas e o fracionamento é alcançado com um gradiente salino ne-
gativo. Este método é ideal para a purificação de enzimas que foram concentradas por
precipitação com sulfato de amônio (GERHARTZ, 1990).
A cromatografia de afinidade, por sua vez, baseia-se na ligação bioespecífica da en-
zima com ligantes presentes no suporte da coluna, que podem ser substratos ou inibido-
res. A enzima de interesse é posteriormente recuperada por eluição com solução de pH
ou força iônica adequados. A despeito de sua seletividade muito elevada, essa técnica
tem aplicação restrita à escala de laboratório ou a segmentos muito específicos, como o
caso das enzimas analíticas (SANT’ANNA, 2001).
A cromatografia de imunoafinidade ocupa um lugar único na tecnologia de purifi-
cação pois utiliza anticorpos monoclonais que interagem especificamente com a enzi-
ma a ser purificada (GERHARTZ, 1990).
A extração líquido-líquido permite a purificação das enzimas provenientes de caldos
fermentativos ou de homogeinados de células (SRINIVAS et alii, 2002; DA SILVA e LOH,
2006). A partição bifásica aquosa utiliza as propriedades das soluções de dois polímeros
ou de um polímero e de um sal de se separarem em duas fases aquosas quando certas con-
centrações mínimas são excedidas. As duas fases aquosas assim formadas apresentam
composição diferente, cada uma delas enriquecida em um dos constituintes do sistema,
isto é, os dois polímeros, ou o polímero e o sal, concentram-se em fases distintas. O teor de
água destas fases é usualmente superior a 80%, podendo em alguns casos atingir valores
superiores a 95%. Os sistemas bifásicos aquosos apresentam, portanto, ambientes suaves
para moléculas e partículas biológicas (XU et alii, 2003; BANIK et alii, 2003).
Uma análise econômica sugere que a extração líquido-líquido pode ser favoravel-
mente competitiva com as tecnologias já estabelecidas e com as vantagens de escalona-
mento fácil, rapidez na purificação e alta seletividade (STEPHANOPOULOS, 1993).

1ª prova
CAPÍTULO 5 ¡ BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS 117

O fracionamento com espuma, uma técnica de separação com bolhas adsortivas,

pode ser empregado como um método adicional de purificação de enzimas ou até mes-
mo substituir as operações cromatográficas. Especial atenção deve ser dada ao ajuste dos
principais parâmetros que afetam a distribuição da enzima na espuma, como pH, con-
centração da enzima e do detergente, velocidade superficial e tempo de formação de es-
puma. Resultados recentes refutaram a hipótese que processos com espuma obrigatoria-
mente vem acompanhados de perda da atividade enzimática (LINKE et alii, 2007).

Etapas finais de acabamento

As preparações enzimáticas, brutas ou purificadas, devem manter as suas características
de catalisador durante o armazenamento e comercialização até a sua aplicação, pois as
enzimas são comercializadas com base na sua atividade catalítica. O fabricante normal-
mente indica as condições de armazenamento e a validade da atividade nestas condições.
A maioria das preparações enzimáticas industriais contém, além da enzima ativa, ou-
tras proteínas, estabilizantes, preservativos, sais e um diluente que permite a padroniza-
ção entre as produções obtidas de diversas bateladas com diferentes atividades específi-
cas. Para a manutenção da atividade enzimática é fundamental a preservação de sua con-
formação nativa, sendo utilizados, para esta finalidade, aditivos, modificação química
controlada ou imobilização enzimática.
A estrutura das proteínas pode ser estabilizada em soluções de força iônica deter-
minada de sais neutros, como sulfato de amônio e fosfato de potássio. Adicionalmente,
altas concentrações de cloreto de sódio (20%) impedem o crescimento microbiano de-
vido ao efeito osmótico. Polióis de baixo peso molecular como glicerol, sorbitol e mani-
tol também estabilizam as enzimas e reprimem o crescimento microbiano devido à re-
dução da atividade da água (EUROPEAN COMISSION, 2002). Além disso, várias enzi-
mas podem ser mantidas na forma liofilizada por longos períodos de tempo na presen-
ça de estabilizadores, como sais, carboidratos ou proteínas inertes, predominantemen-
te albumina bovina sérica (BSA) (GERHARTZ, 1990). Outras substâncias que podem
ser adicionadas às preparações de enzimas para sua estabilização incluem: substratos,
tióis para manter o ambiente redutor, antibióticos, ésteres de ácidos benzóicos como
preservativos de preparações enzimáticas líquidas, inibidores de enzimas contaminan-
tes e agentes quelantes. Os aditivos devem ser compatíveis com o uso final da enzima em
questão. A maioria das preparações enzimáticas é comercializada na forma líquida ou
granulada e os detalhes da metodologia empregada na estabilização somente são
revelados a clientes quando necessário como informação confidencial (EUROPEAN
COMISSION, 2002).

PERSPECTIVAS
A aplicação de técnicas de biologia molecular tem contribuído fortemente para a ex-
ploração de novas enzimas e o desenvolvimento de novas propriedades enzimáticas e
certamente continuará a impulsionar o desenvolvimento na área de produção de enzi-

1ª prova
118 ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO

mas (OLEMPSKA-BEER et alii, 2006; EUROPEAN COMISSION, 2002; ADRIO, 2003;

PENG, 2005; OLEMPSKA-BEER, 2006; ANTRANIKIAN, 2005).
O uso dessas novas tecnologias permite aumentos substanciais nos rendimentos e
produtividades enzimáticos através do uso de sistemas de expressão eficientes ou que per-
mitam a inserção de multicópias de genes. Assim, novas enzimas, ainda não acessíveis an-
teriormente, podem ter seus genes clonados e serem produzidas em microrganismos
hospedeiros de fácil cultivo em grande escala. Nesse contexto, são de especial importân-
cia as chamadas extreomozimas, biocatalisadores naturalmente estáveis em condições ex-
tremas de pH, temperatura e salinidade, obtidos a partir de organismos extremófilos.
Métodos modernos de engenharia de proteínas e de evolução molecular têm per-
mitido, por sua vez, o aprimoramento de propriedades de uma dada enzima, tais como
estabilidade, mecanismos catalíticos, tipo e especificidade de substrato, atividade super-
ficial, dependência de cofator, pH e temperatura ótimos e parâmetros cinéticos.
A biossegurança da produção de enzimas deve também ser melhorada através da
restrição dos microrganismos produtores para poucas espécies bem conhecidas e segu-
ras, empregadas como hospedeiras para genes de diversas fontes. Entretanto, a produ-
ção de enzimas por microrganismos melhorados por genética clássica continuará a ter
um papel fundamental na produção de biocatalisadores.

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