www.elsevier.com/locate/resmic
Jaime Romero un, *, Carolina Yañez un, Mónica Vásquez un, Edward Moore RB segundo,
Romilio T. Espejo un
un Laboratorio de Biotecnología, Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos, Universidad de Chile, Macul 5540, 138-11 Santiago, Chile
segundo Bereich Mikrobiologie, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, 38124 Braunschweig, Alemania
Abstracto
La mayoría de las plantas de biolixiviación de cobre operan con una alta concentración de sales de sulfato, causada por la adición continua de ácido sulfúrico y el reciclaje de la solución de
lixiviación. Dado que las bacterias implicadas en la biolixiviación han sido generalmente aislado a bajas concentraciones de sulfato, la población bacteriana presente en el alto-sulfato (150 gl
- 1) solución, empleada en una planta de producción de cobre de lixiviación, se investigó. los
hierro-oxidantes bacterias capaces de crecer en la solución de lixiviación se enriquecieron por varios cultivos por lotes y, después de la dilución en serie, se aisló una cepa bacteriana abundante. Esta
cepa, denominada LA, exhibió una tasa relativamente constante de hierro-oxidación en medios que contienen iones de sulfato en concentraciones que van de 10 a 150 gl
- 1. Colección de cultivos de cepas
ferrooxidans Leptospirillum y Acidithiobacillus ferrooxidans
- 1. A pesar de su tolerancia a altas concentraciones de sulfato,
mostraron capacidades limitadas para crecer en concentraciones de iones de sulfato superiores a 70 gl
cepa LA era tan sensible a NaCl como A. ferrooxidans. Análisis comparativo de secuencias del gen 16S rRNA de la cepa LA indicó que
está filogenéticamente relacionada con cepas descritas como ferrooxidans Leptospirillum . patrones de restricción de ADN comunidad bacteriana de 16S rRNA
genes sugieren que la cepa LA era un componente menor de la población bacteriana presente en la solución de lixiviación, pero es abundante en mineral lixiviado con esta solución.
• 2003 Editions ques científica y medicales Elsevier SAS. Todos los derechos reservados.
0923-2508/03/$ – see front matter • 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved.
doi:10.1016/S0923-2508(03)00037-8
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que salen de los montones. Posteriormente, se seleccionaron la población El crecimiento bacteriano se controló como una función de la producción de hierro
bacteriana capaz de crecer a condiciones (pH bajo, alta sulfato, atmósfera aerobia) férrico, medida por la absorción espectrofotométrica a 405 nm (A 450) ( EL × 800,
que imitan la parte aeróbica de la pila, donde la mayor parte del crecimiento BIO-TEK Instruments Inc., EE.UU.). La cantidad de hierro férrico producido fue
bacteriano se produce. Una cepa bacteriana, llamada LA, era iso directamente proporcional a la absorbancia, a niveles tan altos como 3 g
/ l, con una
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coef regresión fi ciente mayor que 0,99, en los diferentes medios de comunicación a un fluorescente marcado con colorante didesoxinucleótidos. Los cebadores de
pH inicial de 1,9. A concentraciones superiores a 3 g / l, una gran desviación de la secuenciación se han descrito anteriormente [20]. Los datos de secuencia fueron
relación lineal se observa debido a la precipitación del hierro férrico. Suponiendo un alignedwith secuencias de referencia, utilizando conservadas regiones de la
rendimiento constante, la tasa de crecimiento c especificidad es igual a d secuencia primaria y las características de estructura secundaria como referencia
PAG/ re t × 1 / PAG , [13,35]. distancias evolutivas se calcularon [18] a partir de diferencias de secuencia
PAG siendo la cantidad de hierro ferroso oxidado. Bajo este supuesto, la tasa de de pares y dendrogramas de relaciones filogenéticas estimados se obtuvieron
crecimiento fi específica se calculó a partir de la pendiente de la curva, ln utilizando los programas de la Phlyogeny Inference Package PHYLIP [10]. Las
( Fe + 3) en función del tiempo, considerando sólo secuencias del 16S rDNA de
el lapso de tiempo que mostró un aumento exponencial de hierro férrico. Las L.
mediciones a 150 g de sulfato por litro se realizaron usando medio BRS. Las ferrooxidans DSM 2391 y la tensión LA fueron sometidos a EMBL AJ237903 y se
mediciones en concentraciones de sulfato más bajos se obtuvieron por dilución de les asigna el número de adhesión y AJ237902, respectivamente.
BRS en MS9b. El número de bacterias vivas en el medio de inóculo se determinó
por dilución de punto final en el mismo medio, mientras que el número de bacterias
vivas restante a la transferencia a un diferentes mediumwas determinados por
dilución de punto final en el último medio. Estas dos figuras permitió el cálculo de la 3. resultados
inactivación debido a la transferencia a un medio diferente. sensibilidades
bacteriana a cloruro de sodio se realizaron mediante la estimación de crecimiento a 3.1. Selección después de un crecimiento en la sal de sulfato de alta
diferentes concentraciones de NaCl, en placas de 96 pocillos, como se describió concentración a pH 1,9
- 1 de SO - 4, a un pH de 2,5. Seis
2.4. PCR la amplificación y análisis de los productos fi hierro ferroso y 150 gl
subcultures were carried out in the same solution sterilized by filtration and adjusted
to pH 1.9, i.e., the prevalent pH in the aerobic part of the commercial plant heaps
Las células bacterianas y ADN genómico se obtuvieron a partir de cultivos como
where most bacterial growth occurs [26]. Afterward, nine subsequent subcultures
se describe anteriormente [9], salvo que los cultivos en containingmore medios de
- 1 de sulfato se diluyeron were made in a synthetic medium of similar salt composition and pH as in the
100 gl
leaching solution (BRS). During the sequential cultures, the bacterial diversity and
en MS9b para reducir su densidad antes de la centrifugación de las bacterias.
the bacterial growth were monitored. The diversity of the bacterial community in the
Ampli fi cación de 16S rRNA de las posiciones 28 a 1492 se realizó como se
sequential cultureswas estimated by the electrophoretic migration patterns of
describe [7]. Se realizó Ampli fi cación de las regiones espaciadoras 16S-23S
PCR-amplified 16S–23S rDNA spacer regions [9]. Fig. 1 shows a graph of bacterial
ADNr tal como se describe por [9]. Los productos se analizaron por electroforesis
growth as observed by ferrous iron-oxidation (Fig. 1a), and the spacer patterns
de poliacrilamida y tinción de plata nitrato como se describe anteriormente [27].
obtained from the bacteria in the subcultures collected at the time indicated in each
lane (Fig. 1b). The predominant spacer type in the starting culture showed an
apparent size of approximately 530 bp, similar to the 16S–23S rDNA spacer
observed previously from
2.5. análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP)
Fig. 2. Análisis de fi PCR-ampli ed 16S rDNA por Alu yo y Director de Finanzas me RFLP
patrones. patrones de RFLP de 16S rDNA amplificado a partir de ADN extraído de la solución de
lixiviación (carriles S), mineral lixiviado con esta solución (carriles O) y cepa La (carriles LA). MW
corresponde al marcador escalera de peso molecular de 100 pb.
Leptospirillum parecido la tensión presente en esta cultura fue nombrado Ángeles. 3.2. Los análisis genotípicos
Para comprobar la ausencia de la bacteria con el espaciador más grande, observó
originalmente, el cultivo obtenido a partir de la más alta de inóculo dilución se PCR ampli fi cación y secuenciación directa permitió la identificación de 1670
subcultivó sucesivamente en el mismo medio, pero a pH 2,5. Si las bacterias con el posiciones de nucleótidos del gen de ARNr 16S de la cepa LA. Se observó que la
espaciador más grande persistieron en el cultivo de la dilución más alta, que secuencia del gen 16S rRNA de LA poseer 93,0% de similitud de secuencia con la
rápidamente habría superado cepa LA. Análisis de las regiones espaciadoras de las de la primera describe cepa de
bacterias después de cinco subcultivos a pH 2,5 no mostraron trazas de espaciador L. ferrooxidans ( DSM
más grande, lo que indica que el cultivo derivado de la dilución más alta contenía LA 2705) (EMBL número de acceso X86776) y 99,0% con
exclusivamente (resultados no mostrados). L. ferrooxidans la cepa DSM 2391 y con Leptospirillum
sp. la cepa DSM 9468 (EMBL número de acceso X72852).
Dado que el 460-bp 16S-23S rDNA región espaciadora, observada después de3.3. concentración de sal de sulfato y el crecimiento
cultivo selectivo no se había detectado en el cultivo de partida, la concentración
relativa a la que podría haber estado presente, pero no detectada por PCR de La capacidad de la cepa LA crecer a altas concentraciones de sal de
amplificación fi de los espaciadores, se exploró. Para esto, ampli fi cación de las sulfato se comparó con la de A. ferrooxidans
regiones espaciadoras del ADN extraído de cepa DSM 583 y L. ferrooxidans cepa DSM 2391. El primero fue aislado de una
A. ferrooxidans zona de extracción de carbón y se ha agrupado junto con los tipos más
y L. ferrooxidans, mezclado en diferentes proporciones, se realizó. Los resultados abundantes de esta especie por homología de ADN [14]. El segundo fue aislado
(no mostrados) indicaron que, en estas condiciones, el espaciador de de agua de drenaje ácido de minas de una mina de cobre [23]. Ambas cepas se
L. ferrooxidans era indetectable aislaron a partir y se mantuvieron en baja concentración media de sal de sulfato.
cuando su proporción relativa de célula estaba por debajo de 1 / 50. las tasas de crecimiento especıficos se calcularon a partir de la tasa de producción
Para evaluar la presencia de la cepa LA en la comunidad bacteriana de la de hierro férrico específica, suponiendo un rendimiento constante [21,31], como se
solución de lixiviación y en el mineral lixiviado con esta solución, el ADN a partir describe en Materiales
del mineral, la solución y LA
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(un)
(un) (segundo)
Fig. 4. férrico producción de hierro, medido por absorbancia a 405 nm, en cultivos de la cepa LA y A.
ferrooxidans DSM 583 (Tf) con medios que contienen NaCl. Las bacterias cultivadas en medios que
- 1 de sulfato de
contenían 110 gl
- 1 (a) o
ion se incubaron en medio (BRS-MS9b) que contiene 110 gl
5 gl - 1 (b) de sulfato y concentraciones crecientes de NaCl. El crecimiento bacteriano se controló midiendo
el aumento de absorbancia debido a la generación de férrico.
a bajas concentraciones de sal, aunque esta tasa de crecimiento específico de A. ferrooxidans rápidame
disminuido con concentraciones crecientes de sulfato, a un nivel indetectable en 130 g de
sulfato / l. El efecto del estrés osmótico en las células después de las transferencias se analizó
mediante la estimación de la supervivencia celular, en la transferencia, mediante la
determinación de la relación entre las más altas diluciones de las células que muestran el
crecimiento en el ensayo y medio original. No se observó la inactivación cuando cepa LA fue
transferido de un alto contenido de sal a un medio de bajo contenido de sal, pero se observó
una inactivación marcada en cada una de las tres bacterias después de la transferencia de bajo
contenido de sal a los medios de comunicación de alta sal (Tabla 1, los datos para la cepa DSM
2391 fueron similares a los de
(segundo)
Fig. 3. Las tasas de crecimiento especıficos medidos en cultivos de la cepa LA (bares LLED Fi), A. ferrooxidans,
A. ferrooxidans DSM 583 (barras abiertas) y L. ferrooxidans DSM 2391 (gris no mostrada).
bares), realizados en diferentes concentraciones de sal de sulfato. (A) valores obtenidos con inóculos de La resistencia de la cepa LA al cloruro de sodio se analizó mediante la evaluación
- 1,
LA y A. ferrooxidans crecido a 150 y 110 gl
de su crecimiento en cultivos que contienen cantidades crecientes de esta sal,
respectivamente. (B) valores obtenidos con inóculos de LA, A. ferrooxidans y
- 1 de sales de sulfato. bymeasuring la absorbencia debido a la resultante de hierro férrico.
L. ferrooxidans crecido a 10 gl
A. ferrooxidans DSM 583, fue
incluido para comparación. La inhibición del crecimiento por NaCl era casi
y métodos. Las tasas de crecimiento fi específicas de las tres cepas a diferentes - 1 De NaCl, cuando ambas cepas
completa en 3 gl
concentraciones de sal de sulfato se muestran en la Fig. 3. Dado que estos - 1 medio sulfato se ensayaron en medio
crecido en 110 gl
experimentos también estrés osmótico involucrado en las células debido a transferirque contiene la misma concentración de sal de sulfato alta (Fig. 4a). Sin embargo, cuando las
en diferentes concentraciones de sal, lo que podría resultar en la inactivación, que cepas se hicieron crecer a 110 gl - 1 sulfato eran
se llevaron a cabo por la transferencia de alta a bajas concentraciones de sal (Fig. probado a una baja concentración de sulfato (5 gl - 1), inhibición fue
3a) y, a la inversa, de baja a altas concentraciones (Fig. 3b). Strain LA creció a - 1 NaCl (Fig. 4b) y
observado para ambos organismos a 16 gl
aproximadamente las mismas tasas de mercantiles en concentraciones que van -1( resultados no mostrados).
era casi completa en 20 gl
from10 a 150 gramos de sulfato por litro. L. ferrooxidans la cepa DSM 2391 demostró
tasas similares de crecimiento, pero no creció en concentraciones de sulfato mayor
que 70 gl 4. Discusión
Leptospirillum- como cepa LA a través de una estrategia de cultivo que imitaba lum spp. y uncultured bacterias cuya 16S rRNA genes se han clonado y
condiciones que prevalecen en las secciones de pila de mineral, donde se había secuenciado [12] y que es, evidentemente, los miembros más predominantes
observado más actividad bacteriana [26]. Estas son: una atmósfera aeróbica, una activos en los procesos de biolixiviación, a diferencia de bacterias relacionadas
-1
concentración de 150 gl con la cepa de tipo L. fer-
de iones sulfato y un pH 1,9 en la solución de lixiviación usado como medio. rooxidans DSM 2705 T.
Hemos observado en el cultivo inicial que tanto A. ferrooxidans cepas se cree que son los principales agentes responsables de
A. ferrooxidans- y L. ferrooxidans- como cepas son capaces de crecer a la oxidación de mejora de ácido en la biolixiviación de cobre y drenaje de mina
- 1.
concentraciones de sulfato de hasta 150 gl ácido. Esto puede ser debido a la presunción de que estas cepas eran tan
A pesar de la abundancia inicial de A. ferrooxidans- me gusta abundantes en ambientes de minas, ya que han sido fácilmente aislado de estos
cepas, la condición selectiva de pH inferior permite sólo ambientes utilizando baja en sal medios sólidos. La relevancia de
L. ferrooxidans- como cepas para ser seleccionados. análisis del patrón de
restricción de las fi ed 16S rRNA genes PCR-cadores sugirió que la cepa LA era L. ferrooxidans cepas ha sido menos apreciado
sólo un componente menor de la población presente en la solución de lixiviación, porque crece menos e fi cientemente en los medios de aislamiento común. Sin
aunque era abundante en mineral lixiviado con esta solución. Por lo tanto, la cepa embargo, cada vez más pruebas ha sugerido que
LA puede ser un organismo relevante para el bacteriana oxidación de mejora en la L. ferrooxidans cepas podría ser un componente dominante en entornos mineros
planta comercial de cobre de Lo Aguirre. [1,2,6,28-30].
Estos hallazgos muestran que L. ferrooxidans- como las bacterias
Strain LA puede ser considerado como sulfato tolerantes, como observedby supuede llegar a ser las poblaciones bacterianas predominantes en minerales leachedwith
crecimiento en presencia de altas concentraciones de electrolito [4,5,20] y sus bajo pH y soluciones de alta sulfato. Por lo tanto L. fer-
exhiben tasas de crecimiento similares a concentraciones crecientes de sulfato, a rooxidans- como cepas pueden ser importantes “potenciadores” de la oxidación en el en
condiciones in situ de un cobre biolixiviación planta comercial. Estos organismos, sin
1,5 M. Es probablemente posee algún mecanismo de osmoprotection. Sin embargo,
a pesar de esto observado resistencia al sulfato, la cepa LA es al menos tan embargo, probablemente se supere por A. ferrooxidans a concentraciones de sal inferiores
sensible a NaCl como es y pH más alto, las condiciones empleadas habitualmente para el análisis cultural. Estos
A. ferrooxidans. los resultados, y otros [32], indican que el crecimiento de las bacterias a altas
sensibilidad a NaCl de ambos A. ferrooxidans and strain LA was observed to concentraciones de sal y ácido es posible, es decir, las condiciones que prevalecen en
muchas cobre lixiviación plantas comerciales. Sin embargo, estas observaciones no
increase at high sulfate salt concentrations. This increased sensitivity at high sulfate
salt concentration is important because of the potential inhibition by low deben desalentar esfuerzos para idear favorable al medio ambiente Amore para las
concentrations of NaCl in plants working with leaching solutions containing high bacterias en las plantas de biolixiviación porque la mejora general de oxidación en
sulfate concentration. High sulfate concentrations are uncommon in nature and themontones de mineral probablemente será bajo, particularmente cuando el pH bajo, baja
study of halophilic or halotolerant bacteria has been restricted to the effects of hightemperatura, alta sulfato concentrationand bajo, pero fi bisela, concentraciones
NaCl concentrations, which is more abundant in nature [4,5,33,34]. Kieft and significantes de cloruro de están combinados.
Spence (1998) classified A. ferrooxidans as a non-halophilic bacterium, based on
growth inhibition observed at 0.25 M (15 g l
− 1) Expresiones de gratitud
of NaCl or KCl. This inhibition, however, seems to be due to a specific effect of the
chloride ion rather than to an osmoregulation problem, as has been described for Este trabajo fue apoyado por una subvención de 1.961.216 FONDECYT.
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