Anda di halaman 1dari 26

Laporan

ikan zebra Embrio Analisis Lipidomic Mengungkapkan


bahwa Yolk Sel aktif secara metabolik dalam Pengolahan
Lipid
Graphical Abstrak
Highlights
d

Penulis
Daniel Fraher, Andrew Sanigorski, Natalie A. Mellett, Peter J. Meikle, Andrew J. Sinclair, Yann Gibert
Correspondence andrew.sinclair@deakin .edu.au (AJS), y.gibert@deakin.edu.au (YG)
Singkat Fraher et al. mengembangkan metode untuk mengidentifikasi lipid secara terpisah dalam kuning ikan zebra
dan tubuh embrio. Penggunaan lipid dan konten yang dinamis dalam kuning telur dan embrio selama
pengembangan. Kuning telur secara aktif memproses lipid sebelum migrasi ke tubuh selama embriogenesis awal.
Analisis Lipidomic mengungkapkan penggunaan lipid selama awal pengembangan
d
Beberapa peningkatan lipid dalam konsentrasi dalam kuning telur selama perkembangan
d
Penghambatan aktivitas PPARG perubahan profil lipid selama ikan zebra embriogenesis
d
Lipid secara aktif diproses dalam kuning telur selama embriogenesis
Fraher et al., 2016, Laporan Sel 14, 1317-1329 16 Februari 2016 © 2016 The Authors
http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.01.016
Sel Laporan Laporan

ikan zebra embrio Analisis Lipidomic Mengungkapkan


bahwa Yolk Sel aktif secara metabolik di Pengolahan
Lipid
Daniel Fraher, 1 Andrew Sanigorski, 1 Natalie A. Mellett, 2 Peter J. Meikle, 2 Andrew J. Sinclair, 1, * dan Yann Gibert1, *
1Metabolic genetik Penyakit Laboratorium, metabolik Research unit, Deakin University School of Medicine, 75 Pigdons Road,
Geelong, VIC 3216, Australia 2Baker IDI Heart and Diabetes Institute, 75 Commercial Road, Melbourne, VIC 3004, Australia *
Korespondensi: andrew.sinclair@deakin.edu.au (AJS), y.gibert@deakin.edu.au (YG)
http: //dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.01.016 Ini adalah akses artikel terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0 /).
RINGKASAN

Peran lipid dalam menyediakan energi dan komponen seluler struktural selama perkembangan vertebrata kurang
dipahami. Untuk menjelaskan peran ini lebih lanjut, kami divisualisasikan deposisi lipid dan diperiksa ekspresi gen
lipid yang mengatur kunci selama brafish embriogenesis ze-. Kami juga melakukan analisis kuantitatif semi
komposisi lipidomic menggunakan kromatografi cair (LC) -mass spektrometri. Akhirnya, kami menganalisis
pengolahan analog lipid boron-dipyrrome- thene (BODIPY) disuntikkan ke dalam kuning telur dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis. Data kami menunjukkan bahwa lipid yang paling melimpah di embrio yang
kolesterol, fosfatidilkolin, dan trigliserida. Selain itu, kami menunjukkan bahwa lipid diproses dalam kuning telur
sebelum mobilisasi ke tubuh embrio. Data kami mengidentifikasi kuning aktif secara metabolik dan tubuh
menghasilkan komposisi lipid yang dinamis. Ini memberikan dasar untuk mempelajari biologi lipid selama
embriogenesis normal atau farmakologi dikompromikan.
PENDAHULUAN
Lipid memiliki peran signifikan dalam homeostasis energi, struktur selular, dan sinyal selular (Belkhou et al, 1991;. Simons dan
Ikonen, 1997;. Spiegel et al, 1996). Namun, sedikit yang diketahui tentang pengaruh komposisi lipid pada genesis embryo-
vertebrata dan pengembangan. Banyak hewan, dikenal sebagai trophs lecitho-, bergantung pada kuning telur maternal disediakan
untuk nutrisi dan energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan embrio (Allen dan Pernet, 2007). Studi sebelumnya telah
menetapkan bahwa lipid maternal disimpan dalam kuning telur menyediakan sumber energi bagi organisme berkembang dan
karena itu dianggap kuning sebagai cadangan nutrisi tanpa aktivitas metabolik (Heras et al, 2000;.. Ho ̈ ltta ̈ -Vuori et al, 2010 ;
Rosa et al, 2005).. Berdasarkan ini, asam lemak esensial dan nutrisi penting lainnya seperti kolin yang dibutuhkan untuk
perkembangan struktural dianggap disimpan dalam sel kuning dan dimobilisasi jika diperlukan (Wiegand, 1996).vertebrata
individu
Oositdan embrio memiliki kadar lemak mereka dianalisis pada titik waktu tunggal (Ferreira et al, 2010;.. Gonza lez-Serrano et al,
2013); dinamika kadar lemak tidak dipelajari dur- ing pembangunan. Sebuah studi terbaru oleh Guan et al. (2013) meneliti profil
lipid dari lalat buah, Drosophila melanogaster, selama tahap-tahap embrionik, pupa, larva, dan dewasa. Meskipun studi ini pro-
vided wawasan persyaratan lipid, penggunaan trigliserida, dan perubahan sphingolipids selama pengembangan lalat buah, fokus
dari studi mereka adalah membran lipid dalam hewan non-vertebrata, dan penulis tidak dapat membedakan antara cadangan
kuning telur lipid dan lipid hadir dalam tubuh embrio (Guan et al., 2013). Secara kumulatif, studi ini telah memberikan gambaran
luas dari peran lipid dan pentingnya mereka selama pembangunan, tetapi pemahaman yang komprehensif tentang renovasi plex
com- lipid dalam pengembangan vertebrata membutuhkan studi lebih lanjut.
The ikan zebra (Danio rerio) adalah model organisme vertebrata yang telah intensif digunakan untuk mempelajari biologi
perkembangan dan penyakit manusia (Dawid, 2004; Zon, 1999). Baru-baru ini, ikan zebra telah digunakan untuk mempelajari
berbagai aspek biologi lipid termasuk metabolisme lipid, gen yang mengatur pengolahan lipid, dan peran lipid dalam penyakit
(Carten et al, 2011;. Flynn et al, 2009;. Schlegel dan Stainier 2006 ). Yang penting, banyak sifat dari lipid biologi hadir dalam
ikan zebra dilestarikan pada manusia. Gen homolog mengatur metabolisme lipid ditemukan di brafish ze- dan mereka berbagi
lipid dan lipoprotein metabolisme mirip dengan manusia (Miyares et al, 2014;. Schlegel dan Gut 2015; Schlegel dan Stainier,
2006; Thisse et al, 2001. ; Thisse dan Thisse, 2004). Homologi ini telah memungkinkan peneliti unprece- wawasan penyok ke
dalam patologi penyakit termasuk aterosklerosis, penyakit lemak-hati non-alkohol, dan obesitas (Fang et al, 2014;. Flynn et al,
2009;. Schlegel, 2012).
Ikan zebra adalah organisme lecithotrophic (dibahas dalam Kunz- Ramsay, 2013), bergantung pada isi kuning telur untuk
nutrisi di seluruh pembangunan sampai tahap larva awal, hari AT5 pasca fertilisasi (DPF), kalau itu bisa dimulai makan. Karena
ketergantungan ini pada kuning telur, embrio ikan zebra dapat dianggap sebagai '' sistem tertutup, '' yang berarti bahwa asupan
gizi mereka uninflu- enced oleh faktor-faktor luar. Oleh karena itu, potensi variabel- ables eksperimental karena makan bisa
dihilangkan selama embriogenesis. Ikan zebra setuju untuk berbagai teknik untuk mempelajari metabolisme selama
pengembangan termasukfarmakologis
selReports 14, 1317-1329, 16 Februari, 2016 © 2016 The Authors 1317
Gambar 1. Lipid Distribusi dan Metabolik Gene Expression seluruh Embriogenesis (A-E) Cerah gambar lapangan menunjukkan
pemanfaatan kuning dari 0 hpf sampai 5 dpf. (F-I) ORO pewarnaan menunjukkan bahwa tidak ada deposito dari lipid netral
dalam kepala embrio pada 24 hpf (F), tapi lipid hadir di 48 hpf di otak depan (panah, G) dan sekitar mata dan di bawahnya yang
otic vesikel (panah, G), pada 72 hpf sekitar mata (panah, H), dan pada 5 dpf pada jumlah rendah (I). (J) c / ebpa ekspresi hadir di
24 hpf di mengembangkan hati dan usus (panah). (K-M) c / ebpa ekspresi meningkat pada organ-organ ini dari 48 hpf ke 5 DPF
(panah).
(legenda bersambung ke halaman berikutnya)
1318 Sel Laporan 14, 1317-1329, 16 Februari, 2016 © 2016 The Penulis
adalah penghambatan protein kunci yang terlibat dalam biologi lipid (Nishio et al.,
masih ada (Gambar 1I). Perhatikan bahwa intensitas
ORO noda-2008, 2012).
ing secara bertahap menurun dalam kuning telur sebagai
berjalannya waktu, berarti manfaat tambahan dari ikan zebra sebagai model adalah bahwa itu
yang lipid kurang netral hadir dalam kuning telur dan
bahwa sebagian besar berkembang eksternal dari ibu dan embrio menjalani dis
lipid ini telah baik telah digunakan oleh embrio atau
disimpan dalam coidal, belahan dada meroblastic, sebuah proses yang memisahkan
tubuhembrio. Whole-me-mount in situ hybridization
(BERHARAP) mengembangkan embrio dari kuning telur ditinjau oleh Gilbert (2000).
dilakukan, pada titik waktu yang sama, menggunakan
mRNA antisense Pemisahan ini didirikan oleh berintilapisan sel
probegen yang diketahui menjadi bagian integral kegiatan
yang disebut lapisan kuning syncytial (YSL) (Kimmel dan Hukum, 1985)
lipid metabolisme, pengolahan lipid, dan lipid mobilisasi,
(lihat Gambar S1 untuk rincian). Fitur-fitur ini memungkinkan untuk dissoci- mudah
termasuk pra-adiposit penanda CCAAT / asi enhancer-
mengikat dari kuning telur dan tubuh embrio memungkinkan lipidukur yang
alphaprotein (c / ebpa), lipid protein transportasi asam
lemak KASIH bind- dari dua independen. Hal ini memberikan kesempatan untuk
ing 11a protein (fabp11a), yang lipoprotein pengolahan
lipid protein membandingkan dinamika lipid tidak hanya terhadap waktu, tetapi juga
lipase (LPL), dan adiposit transkripsi faktor Peroksisom
utama antara sumber (kuning) dan tujuan (tubuh). Di sini, kita
proliferator-diaktifkan gamma reseptor (PPARG). c / ebpa
adalah telah meneliti sifat dinamis dari spesies molekul lipid
diekspresikan pada 24 hpf di anlage hati dan usus dan
dalam komposisi YSL, kelimpahan, lokasi, dan regulasi genetik
(Gambar 1J). Ekspresi terus meningkat di opment ini
seluruh embriogenesis ikan zebra (0-72 hpf) dan awallarva
organ opingsama sekali kemudian waktu poin (Angka 1K-
1M). Perhatikan bahwa tahap (72-120 hpf). Kami melakukan lipidomic analisis untuk
hibridisasi in situ dilakukan dengan menggunakan probe
akal bagi c / ebpa mengamati perubahan dari 365 spesies lipid individu, yang
atau PPARG tidak menodai usus berkembang (Gambar S1).
fabp11a dikelompokkan ke dalam 24 kelas lipid dan subclass, dalam kedua
hadir di otak depan, di mata, dan otak belakang di kuning
telur dan tubuh selama pengembangan ikan zebra. Selain itu, kami
24 hpf (Gambar 1N). Pada 48 hpf, ekspresi meningkat
farmakologi menghambat reseptor nuklir penting (PPARG)
seluruh kepala dan tetap hadir di lokasi tersebut terlibat
dalam metabolisme lipid (Ferre, 2004) dan mempelajari
pada 72 hpf dan 5 DPF (Angka 1O-1Q) . LPL mRNA
terletak di perubahan profil lipidomic. Selanjutnya, dengan menggunakan fluorescent
primordial hati pada 24 hpf (Gambar 1R). Ekspresi LPL
gradu- berlabel analog lipid BODIPY, kami mampu mengidentifikasikuning
sekutumeningkat di hati sebagai embriogenesis berkembang
(Angka sebagai situs metabolisme lipid aktif. Analisis ini memiliki pro
1S-1U). PPARG tidak terdeteksi pada 24 hpf (Gambar 1V).
Pada 48 hpf vided pemeriksaan belum pernah terjadi sebelumnya dalam perkembangan Lip
dan 72 hpf, ekspresi terletak di usus berkembang
(komposisi idomic angka yang cukup dan metabolisme dalam mengembangkanvertebrata
ures1W-1X). Dengan 5 dpf, ekspresi PPARG itu sangat
terdeteksi organisme mengungkapkan renovasi lipid aktif dalam kuning telur sebelum
di hati, usus, dan berenang kandung kemih (Gambar 1Y).
The berkembang mencapai embrio yang tepat.
dan memperluas pola ekspresi gen ini tampaknya meningkatkan seluruh pembangunan, tetapi juga cocok dengan awal HASIL di-
lipatan dalam kelimpahan lipid yang dideteksi oleh ORO.
Perkembangan ikan zebra Ekspresi Gen dan lipid
Temporal Perubahan Lipid Kelas selama ikan zebra
Lokalisasi selama Embriogenesis
Pembangunan Lipidomic analisis yang dilakukan pada
berbagai tahap zebra-
Dalam rangka untuk membedakan perubahan lipid
kelimpahan relatif untuk pengembangan ikan kuning, pada tahap 1 sel atau 0 hr pasca fertilisasi (hpf)
dan tubuh secara terpisah, keduanya manual dibedah dan
(dibuahi embrio, Gambar 1A), pada 24 hpf, waktu terbaru dari somi-
dianalisis secara independen (jumlah absolut dari masing-
masing spesies lipid togenesis (Gambar 1B), selama organogenesis pada 48 dan 72 hpf
pada semua titik waktu yang tercantum dalam Tabel S1).
Pada 0 hpf, yang (Angka 1C dan 1D) dan selama perkembangan larva awal, segera
dianggap reservoir awal lipid untuk opment embrio
sebelum ikan zebra menjadi larva makan gratis, dan pada 5 dpf dan
ngunan, lipid utama hadir baik polar dan non-polar tidak
semata-mata bergantung pada cadangan kuning telur lagi (Gambar 1E). Catatan
lipid, dan dalam rangka penurunan kelimpahan, tersebut
choles- bahwa ukuran isi kuning menurun sebagai embrio opment
Terol (COH), fosfatidilkolin (PC), triasilgliserol (TG),
ngunan berkembang. Ikan zebra diwarnai dengan Minyak-Red-O
fosfatidilinositol (PI), fosfatidiletanolamin (PE), diacyl-
(ORO), untuk label lipid netral, pada tahap perkembangan yang sama.
gliserol (DG), ester kolesterol (CE), dan sphingomyelins
(SM) Pada 24 hpf, tubuh sebagian besar noda-bebas (Gambar 1F). Dengan 48 hpf,
(Gambar 2A). Kolesterol adalah yang paling melimpah di 0
hpf dan noda hadir di otak depan, sekitar mata, dan bawah-
menyumbang 40% dari total lipid, sedangkan PC adalah
17%, Neath vesikel otic (Gambar 1G), dan semakin di yang vascu-
TG adalah 9%, PI adalah 8%, PE adalah 5%, Dirjen adalah
4%, CE lature (tidak ditampilkan). Pada 72 hpf, noda telah bertambah ini
adalah 3%, dan SM adalah 3%. Kelas lipid lain yang
wilayah dan juga terdeteksi di lengkungan faring, yang
terdeteksi dalam kuning telur pada konsentrasi yang lebih
rendah termasuk nantinya akan membentuk insang (Gambar 1H). Dengan 5 dpf, noda menurun
phosphatidylserine (PS), fosfatidilgliserol (PG), eter seluruh
tubuh embrio, tetapi jumlah jejak
lipid dan plasmalogens terkait, alkylphosphatidylcholine
(N-Q) ekspresi fabp11a terletak di otak bagian depan (panah ), di mata dan di otak belakang (panah) dari 24 hpf ke 5 dpf. (R-U)
LPL hadir dalam mengembangkan hati (panah) 24-5 dpf. (V) PPARG tidak terdeteksi dalam embrio pada 24 hpf. (W dan X)
Pada 48 dan 72 hpf, PPARG diungkapkan dalam mengembangkan usus (panah). (Y) Pada 5 dpf, ekspresi meningkat di hati
(panah) dan usus (panah) dan hadir dalam kandung kemih berenang. E, mata; G, usus; L, hati; Y, kuning. Lihat juga Gambar S1.
Sel Laporan 14, 1317-1329, 16 Februari, 2016 © 2016 The Authors 1319
(PC-O), alkenylphosphatidylcholine (PC-P), alkylphosphati- dylethanolamine (PE-O), dan alkenylphosphatidylethanolamine
(PE-P). Kami juga mengamati lysophospholipids, lysophosphati- dylethanolamine (LPE), lysophosphatidylcholine (LPC),
kylphosphatidylcholine lysoal- (LPC-O), dan lysophosphatidylinositol (LPI) serta sphingolipids, dihydroceramide (dhCer),
ceramide (Cer), monohexosylceramide ( MHC), dihexosylcera- mide (DHC), trihexosylceramide (THC), dan G
M3
ganglioside (GM3) (Gambar 2A). Kebanyakan lipid kuning menurun
dalam nilai absolut dengan meningkatnya hari setelah pembuahan, dengan mayoritas dari mereka lipid pada dasarnya
menunjukkan penurunan yang cukup linear. Sur- prisingly, tiga lipid menunjukkan peningkatan konsentrasi antara 0 dan 24 hpf
dan kemudian penurunan linear: TG dan PC (Angka 2F dan 2j) dan LPE (Gambar S2P). Menariknya, konten DG dipertahankan
pada tingkat yang konstan di seluruh pembangunan (Gambar 2H).
Di dalam tubuh, sebagian besar kelompok lipid disebut untuk kuning telur yang hadir tapi dalam nilai absolut rendah pada 24
hpf, dengan pengecualian dari dua fosfolipid (PC dan PE) yang dalam konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah
dalam kuning telur pada 24 hpf (Angka 2j dan 2K). Lipid tubuh berikut meningkat konsentrasi terus 24-120 hpf: COH, DG, CE,
PE, PS, SM, PG, GM3, dan dhCer dengan sedikit peningkatan dengan waktu untuk PC (Angka 2G-2K). Konsentrasi yang relatif
rendah dan stabil terdeteksi melalui waktu untuk PI dan TG (Angka 2E dan 2 F). Pada
Gambar 2. Lipid Kategori Profil dari ikan zebra Embrio Kuning dan Badan seluruh Embriogenesis (A-E) Komposisi lipid embrio
ikan zebra seluruh pada 0 hpf (A), dari kuning pada 24 hpf (B) dan 5 DPF (C) dan badan-badan pada 24 hpf (D) dan 5 dPF (E)
digambarkan berdasarkan kategori persentase lipid relatif terhadap jumlah total lipid terdeteksi. (F-K) Jumlah kategori lipid
individu untuk kedua kuning dan tubuh yang ditampilkan pada 0, 24, 48, 72, dan 120 hpf untuk enam kategori lipid yang paling
melimpah: TG (F), COH (G), DG (H ), CE (I), PC (J), dan PE (K). Konsentrasi spesies lipid ditunjukkan pada pmol / 15 embrio.
Lihat juga Gambar S2 dan Tabel S1.
5dpf, empat kelompok lipid utama dalam tubuh adalah COH (39%), PC (15%), DG (10%), dan PE (8%), sedangkan kelas lipid
lainnya hadir pada konsentrasi yang lebih rendah (Gambar 2E) . Sebuah analisis lengkap konsentrasi kelas 24 lipid seluruh
pembangunan di kedua kuning dan tubuh dapat ditemukan pada Gambar S2.
Dinamika temporal Komposisi lipid Spesies Ketika membandingkan spesies molekul yang menunjukkan tingkat tertinggi dalam
kelas, itu jelas ada dua pola yang berbeda: (1) spesies molekul yang paling berlimpah dalam kelas lipid, yang sama dalam kuning
telur dan dalam tubuh, dan (2) spesies molekul yang paling berlimpah dalam kelas lipid, yang tidak sama dalam kuning telur dan
dalam tubuh yang diukur dengan spektrometri massa. Kelompok satu terdiri dari spesies lipid PE 40: 6, LPE 22: 6, PE-O 40: 6,
PC 34: 1, LPAF 16: 0, PC-O 38: 5, PI 38: 6, PS 40: 6 , PG 16: 0-18: 1, dhCer 16: 0, DHC 16: 0, GM3 16: 0, SM 34: 1, LPC 22:
6, dan TG 16: 0-16: 0-18: 1. Dalam kelompok dua, lipid yang paling melimpah di kuning telur yang PE-P 16: 0-22: 6, PC-P 40:
5, Cer 24: 1, CE 20: 5, MHC 24: 1, dan DG 16: 0 -18: 1, sedangkan di tubuh yang paling banyak adalah PE-P 16: 0-22: 5, PC-P
38: 5, Cer 16: 0, CE 16: 0, MHC 16: 0, dan DG 16: 0-22: 6 (tidak ditampilkan).
Untuk mengungkap perubahan lipid selama pengembangan, tarian abun- dari spesies lipid individu itu ditampilkan sebagai
seorang kerabat
1320 Sel Laporan 14, 1317-1329, 16 Februari, 2016 © 2016 The Authors
disuntikkan perubahan dibandingkan dengan tingkat rata-rata dari spesies tertentu
di tengah sel kuning dengan sekitar 5 nl dari
seluruh interval waktu, divisualisasikan sebagai peta panas. Panas
analog BODIPY diencerkan dalam larutan minyak zaitun (1
mg / ml) pada peta mengungkapkan bahwa sebagian besar spesies lipid dalam yolk sac
24 hpf. Tetesan yang disuntikkan menyebar dengan cepat,
terasa menurun dari waktu ke waktu, sementara kebanyakan dari mereka meningkat dalam
menyebar dari tetesan injeksi dengan 1 jam pasca injeksi
(HPI) tubuh (Gambar S2). Ia juga mengungkapkan bahwa banyak spesies lipid TG
(Angka 3A dan 3D), dan terus menyebar di seluruh
mencapai jumlah relatif tertinggi pada 72 hpf dan menjatuhkan
kuning pada titik waktu kemudian, diamati sampai 6 HPI
(Angka 3B bawah rata-rata pada 120 hpf. Hal yang sama berlaku untuk beberapa DG
dan 3E). dan spesies PC (Gambar S2). Ini cocok
denganpengamatan
Pendiriankamianalog lipid ditentukan dengan
mengekstraksi bahwa ORO pewarnaan adalah yang terkuat dalam tubuh embrio pada 48
lipid dari kuning dan tubuh embrio secara terpisah. Ekstrak
lipid dan 72 hpf dan menurun pada 120 hpf (Angka 1G-1I), sebagai ORO
kemudian dijalankan pada kromatografi lapis tipis (TLC)
piring dan noda untuk lipid netral termasuk TG. Dalam kuning telur, di
dipantau untuk band-band neon. Kami disaring untuk
dimasukkan tahap satu sel, LPE spesies 16: 1-0: 0 dan 18: 2-0: 0 lebih rendah
pada 1 HPI, 3 HPI, dan 6 hpi dalam kuning dan tubuh
(Angka 3C dan 3F; dari mereka berarti kelimpahan dan mereka meningkat menjadi poin yang tinggi
lihat juga Gambar S3 untuk pelat non-dimainkan
berlebihan). Dalam FFA-disuntikkan pada 72 hpf dan 120 hpf, masing-masing. GM3 20: 0, 22: 0, dan 24: 0
embrio, fluoresensi terdeteksi pada band sampel kuning
tidak hadir dalam kuning telur, namun terdeteksi dalam tubuh.
yang berkorelasi dengan standar TG sedini 1 HPI (Gambar
3C, putih spesies ini naik dalam peningkatan linear curam dalamtubuh).
panah Khususnya, band-band ini tidak hadir dalam sampel
tubuh karena mereka enam kali, sepuluh kali, dan 19 kali lebih banyak,
pada 1 HPI dan 3 HPI, tapi band TG terdeteksi dalam
embrio masing-masing, pada 120 hpf daripada mereka pada 24 hpf. GM3 16: 0,
sampel tubuh pada 6 HPI (Gambar 3C, tanda bintang).
Selain itu, ada yang hadir di kedua kuning dan tubuh, meningkat 16
band berada di bawah band TG ini (Gambar 3C, mata
panah terbuka) kali dalam tubuh 24-120 hpf (tidak ditampilkan).
yang mengikuti pola yang sama, bahwa mereka hadir dalam
kuning telur Menariknya, tidak semua spesies lipid menurun dalamkuning
sampelpada setiap titik waktu dan hanya terdeteksi dalam
tubuh di 0-24 hpf. Ada 77 (dari 332 terdeteksi, 23%)
6 HPI (Gambar 3C, pound tanda). Selain itu, ada
pengelompokan spesies lipid yang meningkat secara signifikan (p <0,05, menggunakan satu-
dari empat band hadir dalam sampel kuning pada 1 HPI dan
3 HPI (cara angka yang cukup ANOVA dan Tukey HSD, lihat Prosedur Eksperimental) di
ure 3C, kurung) ; sedangkan hanya ada satu band yang
hadir dalam jumlah absolut selama masa perkembangan ini (Tabel S2).
yang sesuai lokasi di 1 HPI dan 3 HPI sampel tubuh
Banyak spesies lipid ini berada di TG dan kelas PC, yang
(Gambar 3C, cross). Pada 6 HPI, sebuah band baru
terdeteksi baik di menunjukkan peningkatan secara keseluruhan dalam interval ini. Khususnya, TG 18: 0-18:
sampel kuning telur dan tubuh (Gambar 3C, lingkaran). 0-
18: 0 meningkat lebih dari tiga kali, sedangkan TG 14:
baru dimasukkan band neon terdeteksi di PC 0-16: 0-18:
2, 14: 0-16: 1-18: 2, 14: 0- 18: 0-18: 1, dan 16: 1-16: 1-16: 1
analog disuntikkan embrio (Gambar 3F). Dua band yang
hadir semua meningkat minimal 60% dalam jumlah absolut. PC 30: 0, 32: 2,
dalam sampel kuning pada 1 HPI, 3 HPI, dan 6 HPI
(Gambar 3F, panah, dan 33: 0 meningkat lebih dari 50% dalam kuning telur 0-24
kurung) di daerah antara FFA dan TG standar lipid hpf.
Spesies lipid dalam kelas-kelas lain dari TG dan PC meningkat
yang tidak pernah terdeteksi dalam sampel tubuh. Selain
itu, ada juga. CE 20: 0 meningkat sebesar 90%. LPC 14: 0 meningkat lebih
adalah sebuah band hadir dalam sampel kuning telur pada
semua titik waktu (angka yang cukup dari tiga kali, sedangkan LPC 15: 0, 18: 2, dan 20: 4 semua meningkat
ure 3F, panah merah), yang terletak dekat dengan posisi
dengan lebih dari 50%. Cer 20: 0 adalah 57% lebih tinggi pada 24 hpf di
standar lipid DG dan tidak terdeteksi dalam kuning telur
tubuh dari pada 0 hpf. Perlu dicatat bahwa lipid inihadir.
sampel dalam kuning di berbagai persentase relatif, dan
dampak darimereka
Pendiriandari analog lipid neon dalam kuning telur,
kenaikan mungkin tergantung pada kelimpahan absolut mereka. Ini adalah di-
yang dibuktikan dengan deteksi band neon, terest demon-
untuk dicatat bahwa dalam periode ini, banyak peningkatan yang signifikan
strates bahwa sel kuning telur adalah situs metabolisme
lipid aktif, pro yang baik jenuh atau tak jenuh tunggal spesies, mean
ducing lipid yang baru terbentuk sebelum mobilisasi ke
dalam tubuh. ing yang tidak jelas. Kecenderungan peningkatan spesies lipid dalam
Catatan bahwa kuning uninjected menunjukkan tidak ada
band fluorescent (angka yang cukup kuning telur tidak terus sepanjang embrio dan larva
ure S3). Hasil ini menjelaskan pengamatan kami meningkat
tahap abun-. Peningkatan jumlah spesies lipid selama pertama
tariandari beberapa spesies lipid dalam kuning telur antara 0
dan 24 hari hpf pembangunan menunjukkan bahwa proses metabolisme lipid
(Angka 2, 3, dan S2). Kami menyimpulkan dari injeksi ini
exper- yang terjadi di kuning telur. Namun, jumlah spesies lipid
iments bahwa metabolisme lipid terjadi dalam kuning telur
sebelum untuk mengerahkan yang meningkat secara signifikan selama hari kedua hanya
lization untuk tubuh. Data kami juga menunjukkan bahwa
berbeda tujuh spesies.
lipid dimobilisasi pada langkah yang berbeda dari kuning ke tubuh embrio. Demonstrasi ini bahwa sel kuning telur adalah
metaboli- Fluorescent Lipid Analog Incorporation Mengungkapkan
Cally aktif dalam pengolahan lipid dapat menjelaskan
deteksi Metabolically Active Yolk Sel
beberapa enzim lipid metabolisme dalam kuning atau YSL
seluruh Kami berspekulasi bahwa kenaikan lipid dalam kuning telur yang
pengembangan (Tabel 1;. lihat juga Tabel S3 untuk daftar
meta lipid karena peran aktif dari sel kuning telur dalam pengolahan lipid untuk
gen bolism menyatakan selama embriogenesis ikan zebra).
mengkonfirmasi hipotesis ini, kami disuntikkan BODIPY-label fluores- analog persen lipid ke dalam kuning telur dan diikuti
penggabungan mereka
PPARG Penghambatan Memodifikasi Lipid Akumulasi
dalam menjadi lipid pada titik-titik waktu yang berbeda posting injeksi. Kami menyuntikkan
Mengembangkan Embrio asam lemak bebas (FFA) analog,
yang dapat dengan cepat dimasukkan
PPARG merupakan faktor transkripsi reseptor nuklir yang
merupakan besar menjadi lipid netral yang baru disintesis dan fosfolipid dan PC
komponendalam pengembangan adiposit dan sangat analog,
untuk meniru metabolisme PC endogen. Embrio
yang terlibat dalam metabolisme lipid (Ferre, 2004; Rosen et al, 1999;.
Sel Laporan 14, 1317-1329, 16 Februari, 2016 © 2016 The Authors 1321
Gambar 3. BODIPY-Berlabel Lipid Suntikan Apakah Dimasukkan ke Lipid New di yang yolk Sac (A, B, D, dan E) BODIPY-
label FFA dan PC yang disuntikkan ke yolk sac embrio pada 24 hpf. pencitraan fluorescent menunjukkan penyebaran FFA
fluorescent (A) dan PC (D) pada 1 HPI ( seperti ditandai dengan garis-garis putih putus-putus) yang terus menyebar ke seluruh
kuning telur pada 6 hpi (B dan E). (C) TLC suntikan FFA BODIPY-berlabel, dengan standar lipid dalam oranye pucat,
menunjukkan band neon dalam sampel yolk sac di 1, 3, dan 6 HPI (panah putih) dan band di 6 HPI dalam sampel tubuh (tanda
bintang) yang sesuai dengan standar TG. Band di bawah band TG yang hadir dalam sampel kuning telur pada 1, 3, dan 6 HPI
(panah terbuka) sementara band yang sama hanya terdeteksi pada 6 HPI dalam sampel tubuh (pon tanda). Pengelompokan dari
empat band, tepat di atas berdiri kolesterol ard, hadir dalam sampel kuning pada 1 HPI dan 3 HPI (tanda kurung). Salah satu band
yang hanya terdeteksi di daerah yang berdekatan dalam sampel tubuh pada 1 HPI dan 3 HPI (cross). Pada 6 HPI, band lain yang
terdeteksi di atas band-band ini baik dalam yolk sac dan tubuh sampel yang tidak hadir pada titik-titik waktu sebelumnya
(lingkaran) menunjukkan evolusi dinamis temporal lipid selama pengembangan. (F) TLC suntikan PC BODIPY-berlabel
menghasilkan sepasang band antara standar TG dan FFA hanya dalam sampel yolk sac pada 1, 3, dan 6 HPI (panah, tanda
kurung). Band-band ini tidak pernah terdeteksi dalam tubuh hingga 6 HPI. Band yang terletak pada tingkat yang konsisten
dengan standar DG terdeteksi dalam sampel kuning telur pada 1, 3, dan 6 HPI (panah merah) tapi tidak pernah diamati dalam
tubuh hingga 6 HPI. Lihat juga Gambar S3.
Tontonoz dan Spiegelman, 2008). Oleh karena itu, kami memutuskan untuk menyelidiki perubahan profil lipid pada embrio di
mana fungsi PPARG telah farmakologi tidak aktif. Untuk melakukan ini, kita terkena embrio ikan zebra untuk bisphenol A
diglisidil eter (BADGE) seperti yang dijelaskan sebelumnya (Lagu et al., 2009), yang berikatan dengan reseptor PPARG dan blok
aktivitasnya (Wright et al., 2000). Perawatan embrio ikan zebra dari 26 hpf ke 52 hpf dengan 5 mM BADGE berkurang ORO
noda seluruh tubuh embrio dan terutama di kepala (Angka 4A dan 4B). Paparan BADGE juga mengurangi ekspresi c / ebpa dan
LPL ketika embrio diperlakukan 50-72 hpf (Angka 4C-4F). BADGE tidak mempengaruhi ekspresi PPARG pada 72 hpf (Angka
4G dan 4H). Menghambat aktivitas PPARG dikaitkan dengan sedikit tetapi direproduksi peningkatan ekspresi fabp11a pada
embrio ikan zebra (Gambar 4I dan 4J).
Karena kita mengamati penurunan ORO noda dan ekspresi c / ebpa dan LPL dalam embrio BADGE-diperlakukan, kami ingin
menganalisis perubahan yang PPARG penghambatan akan menyebabkan pada profil lipid dari embrio berkembang. Oleh karena
itu, bryos em-ikan zebra diobati dengan 5 mM BADGE dari 26 hpf ke 52 hpf, yang eutanasia, dan memiliki kuning dan tubuh
secara manual terpisah (dengan cara yang sama seperti yang disajikan di atas). Kromatografi cair (LC) -mass spektrometri
dilakukan pada BADGE-diperlakukan dan kontrol sampel untuk mengukur jumlah
1322 Sel Laporan 14, 1317-1329, 16 Februari, 2016 © 2016 The Authors
spesies lipid tertentu. Analisis lipidomic mengungkapkan bahwa lebih dari seperempat (25,9%) dari spesies lipid hadir dalam
kontrol (tidak diobati) badan secara signifikan berubah di tubuh BADGE- diperlakukan (menggunakan Tukey HSD). Di antara
spesies lipid yang paling terpengaruh adalah spesies lysophospholipid, di mana PPARG reseptor penghambatan meningkatkan
konsentrasi banyak LPCs, LPAFs, dan LPEs (Gambar 4K). Dari 18 LPCs yang diidentifikasi, 17 menunjukkan peningkatan
minimal 1,48 kali jumlah kontrol. Lima dari enam LPAFs terdeteksi lebih tinggi dari kontrol (Gambar 4K), dengan PC-O spesies
18: 0-0: 0 di lebih dari dua kali jumlah di kontrol sam- prinsip keuangan. The dihydroceramides juga meningkat dalam tubuh
embrio BADGE-diobati, terutama dhCer 18: 0, yang meningkat hampir delapan kali dibandingkan dengan kontrol. Sementara
sebagian besar spesies tidylcholine phospha- tetap tidak berubah, dua spesies meningkat secara signifikan; PC 35: 4 itu hampir
dua kali lebih tinggi dan PC 18: 2-20: 4 lebih dari 2,5 kali lebih tinggi dari kontrol (Angka 4K dan 4L).
Selain peningkatan spesies lipid, banyak spesies lipid menurun dalam tubuh dalam embrio BADGE-diperlakukan relatif untuk
mengontrol jumlah. PC-O dan PC-P kelas menunjukkan kecenderungan umum menurun. Spesies PC-O 36: 5, 38: 4, 40: 6, dan
40: 7 semua menurun lebih dari 30% (p <0,05) dibandingkan dengan tingkat trol con, sedangkan 5 dari 16 spesies PC-P dianalisis
menunjukkan
ple penurunan minimal 25% (p <0,05). Sementara PE-O lipid melakukan
lipid tak dikenal lainnya. Literatur ekspresi gen kami
tidak menunjukkan penurunan secara keseluruhan, spesies lipid tertentu yang
pemberitahuan-pencarian(Tabel 1) mengidentifikasi bahwa
setidaknya tiga elongations dari cakap menurun, termasuk PE-O 18: 2/18: 2 dan PE-O 34: 1, yang
asam lemak rantai sangat panjang (elvol) gen diekspresikan
dalam berkurang lebih dari 20% (p = 0,071, p <0,05dilakukan masing
kuningatau YSL. ini enzim elongase memperpanjang asam
lemak tively sebelumnya). Spesies PE-P juga memiliki kecenderungan yang konsisten dari
ke anabolisme lebih lipid kompleks (Jakobsson et al.,
2006). menurun. Enam dari sepuluh spesies PE-P menunjukkan signifikan
Phospholipase A2 dan fosfolipase D2 juga ditemukan
menurun dibandingkan dengan kontrol (Angka 4K dan 4L). Untuk com- sebuah
dinyatakan dalam kuning telur. Kedua lipase memainkan
peran dalam analisis pengolahan plete perubahan kelas lipid dalam embrio BADGE-diobati,
fosfolipid, melanggar mereka ke kelompok konstituen lihat
Gambar S4.
(Jang et al, 2003;.. Ravaux et al, 2007). Enzim ini, bersama dengan enzim metabolik mungkin lainnya belum ditemukan mantan
PEMBAHASAN
menekan dalam kuning telur, kemungkinan bertindak untuk memproses lemak kuning maternal depos- ited sebelum mereka
diangkut ke dalam tubuh.Dalam rangka memberikan wawasan sifat lipid fundamental, kitaini
Pemrosesanlipidbisa menjelaskan peningkatan lipid dari 0
sampai analisis lipidomic dilakukan sepanjang embriogenesis dalam
24 hpf dan penggabungan analog lipid neon dalam
organisme vertebrata. Untuk memahami perubahan temporal
kuning dan menunjukkan sel kuning sebagai situs aktivitas
metabolik. profil lipidomic tubuh embrio, kami mengukur lipid
pengolahan lebih lanjut dan transportasi lipid terus di
YSL dalam kuning dan tubuh secara terpisah. Hal ini memungkinkan untuk pengamatan
(Gambar S1). Lipid dimobilisasi untuk jaringan ini dari
butiran di profil dinamis lipid. For example, we observed that
the yolk cell, where they can be packaged into lipoproteins
the absolute amount of TG amount increased in the yolk from
and circulated throughout the body (Ho ̈ltta ̈-Vuori et al.,
2010; 0 to 24 hpf and then steadily declined. Unexpectedly, in the
Schlegel and Stainier, 2006). By 24 hpf, blood circulation
has body, TG only increased a little relative to the amount in yolk (Fig-
begun in the zebrafish and is concurrent with the earliest
pres- ure 2F). The low level of TG was probably due to it immediately
ence of ORO stain that we detected in the vasculature in our
em- being used as an energy source upon transfer from the yolk to
bryos. Furthermore, the caudal vein is in direct contact with
the body. The low relative abundance of TG that we detected in
YSL at this time (Figure S1). This indicates that circulation
may the body at 120 hpf (Figure 2E) fits with a previous report of a
further provide the means to deliver high quantities of lipid
relatively low percentage of TG in whole larvae at 6dpf (Miyares
throughout the body. Additional lipid transport and
processing et al., 2014).
could occur in the pharynx of the embryo starting around
Measurement of DG revealed a different trend in lipid utiliza-
48 hpf. This structure is located in close proximity to the
YSL tion. Although the amount of DG increased in the body as
and yolk (Figure S1). Furthermore, gene expression of
adiponec- embryogenesis progressed, a basal level of DG was maintained
tin, the adiponectin receptor, and the leptin receptor in the
in the yolk. As DGs are important in cellular signaling (Spiegel
pharyngeal region has led others to propose that it could
play et al., 1996), it is possible that maintaining a consistent level of
a role in incorporating yolk nutrients into the body
(Lampert DG is necessary to sustain proper trafficking within the yolk.
et al., 2003; Nishio et al., 2008). This idea is supported by
the However, the secondary signaling role of DG may only require
localized expression of phospholipase C, beta 3,
phospholipase low amounts of the lipid and therefore could not account for
D1a, high density lipoprotein binding protein a, fatty acid
binding the quantities that we have observed. DG is an intermediate in
protein 3, and several other lipid metabolism-related genes
the anabolism and catabolism of TG and phospholipids including
(Table S3). At 4 dpf, lipids have been observed to
accumulate PC, PE, PI, and PS (Choi et al., 2004; Gibellini and Smith, 2010).
in the lumen of the gut (Miyares et al., 2014). Furthermore,
Therefore, it is possible that a relatively consistent level of DG is
by this time, multiple cell types required for digestion are
differ- maintained because it was used and produced at the same rate
entiated and present in the intestine (Wallace et al., 2005).
It is within the processing of metabolic pathways. We noted that
interesting to speculate that lipids may be processed in the
gut while PC increased in absolute amounts in the body from 24 to
before feeding has commenced. By 5 dpf, the yolk has
predom- 120 hpf, it did not increase as sharply as other putative cellular
inantly been used up and the zebrafish begins feeding.
Taken membrane lipids. The level of PC that we detected in the body
together, these data indicate, unlike previously speculated,
at 120 hpf, while relatively abundant at 15% of the total lipid (Fig-
that the yolk cell is not only a nutrient reserve but it also
plays ure 2E), was not as high as the 32.9% that was reported at 6 dpf
an active role in lipid transformation prior to transport into
the (Miyares et al., 2014). This difference was probably due to the
embryo's body. PC contained in the yolk that was measured
by the latter
Having developed a comprehensive understanding of the
experiment.
changes in lipid composition in the zebrafish during develop-
Lipid transport from the yolk to body is poorly understood. Our
ment, it is now possible to use the model to study various
as- data reveal a previously unidentified role of the yolk cell in active
pects of lipid metabolism and its regulation. We postulated
metabolism of lipids prior to transfer into the body. We measured
that inhibition of PPARg would cause a change in the lipid
profile an increase in nearly one-fourth of lipid species from 0 to 24 hpf
of the embryo as PPARg is highly involved in adipogenesis
(Table S2), including many in TG and PC classes, as well as spe-
(Rosen et al., 1999). A notable effect of BADGE treatment
on cific lipids in other classes. Additionally, we observed that exog-
the embryos was an increase in lysophospholipid species.
enous FFA and PC lipid analogs were incorporated into TG and
In a previous study, a PPARg chemical agonist was DG
lipids, respectively, in the yolk prior to detection in the body.
shown to decrease the mRNA expression and activity of
phos- Furthermore, there was incorporation of both analogs into multi-
pholipase A2 in cultured rat vascular smooth muscle cells
Cell Reports 14, 1317–1329, February 16, 2016 ©2016 The Authors 1323
Table 1. Lipid-Associated Genes Expressed in the Yolk of Zebrafish Gene Name (Zebrafish Gene Abbreviation) Known
Function Timing of Expression in Zebrafish References
Phospholipase A2, group XIIB (pla2g12b)
phospholipase A2 enzymes hydrolyze ester bonds of glyceroacylphospholipids to produce lysophospholipids and nonesterified
fatty acids (Ravaux et al., 2007)
50% epiboly-5 dpf Thisse and Thisse, 2004
Phospholipase B domain containing 1 (plbd1)
unknown 50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Phospholipase D2 (pld2) phospholipase D hydrolyzes phosphatidylcholine to generate
phosphatidic acid (PA) and choline (Jang et al., 2003)
50% epiboly-10 hpf, 4–13 dpf Liu et al., 2010
Thisse and Thisse, 2004
Patatin-like phospholipase domain c ontaining 7b (pnpla7b)
unknown one cell-72 hpf Thisse and Thisse, 2004
Apolipoprotein A-Ia (apoA-Ia) apolipoprotein AI is the major protein component of high
density lipoprotein in plasma (Schonfeld and Pfleger, 1974)
6 hpf-72 hpf, adult Babin et al., 1997
T
hisse et al., 2001 Apolipoprotein A-II (apoA-II) apolipoprotein A-II is the second most abundant protein of the
high density lipoprotein particles (Schonfeld et al., 1977)
four cell-72 hpf, adult Thisse et al., 2001 Cheng et al., 2006
Z
hang et al., 2011 Apolipoprotein A-IVa (apoA-IVa) apolipoprotein A-IV is a key protein component of
chylomicrons (Wang et al., 2013)
50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Apolipoprotein A-IV b, tandem duplicate 1 (apoA-IVb.1)
50% epiboly-5 dpf, adult Thisse and Thisse, 2004;
L
evi et al., 2012 Apolipoprotein A-IV b, tandem duplicate 2 (apoA-IVb.2)
two cell-5 dpf Rauch et al., 2003
Apolipoprotein Ba (apoBa) apolipoprotein B is the primary apolipoprotein of chylomicrons
and low-density lipoproteins (Kane et al., 1980; Knott et al., 1986)
50% epiboly-60 hpf, adult Thisse and Thisse, 2004;
C
heng et al., 2006 Apolipoprotein Bb, tandem duplicate 1 (apoBb.1)
50% epiboly-60 hpf, adult Thisse and Thisse, 2004
Apolipoprotein Ea (apoEa) apolipoprotein E is a class of apolipoprotein found in the chylomicron
and LDLs. It is important in lipoprotein receptor binding (Mahley, 1988)
50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Apolipoprotein Eb (apoEb) 128 cell-5 dpf, adult Thisse and Thisse, 2005 Microsomal triglyceride transfer protein (mtp)
MTP combines TG, cholesterol esters of fatty acids, free cholesterol, and phospholipids with apolipoprotein B to form
chylomicrons (Schlegel and Stainier, 2006)
one cell-5 dpf, adult Thisse and Thisse, 2004;
Marza et al., 2005
ELOVL fatty acid elongase 2 (elovl2) ELOVLs are involved in fatty acid synthesis by elongating
fatty acid chains (Jakobsson et al., 2006)
one cell-5 dpf, adult Monroig et al., 2009
ELOVL fatty acid elongase 5 (elovl5) one cell-60 hpf, adult Thisse and Thisse, 2004
Monroig et al., 2009
ELOVL fatty acid elongase 6 (elovl6) 50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004 Fatty acid binding protein 1b, tandem
duplicate 1 (fabp1b.1)
fatty acid binding proteins regulate fatty acid transport (Chmurzy ́nska, 2006)
10 hpf-5 dpf, adult Sharma et al., 2006
24-Dehydrocholesterol reductase (dhcr24)
DHCR24 is an oxidoreductase that catalyzes the reduction of the delta-24 double bond of sterol intermediates during cholesterol
biosynthesis (Waterham et al., 2001)
50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Delta(4)-desaturase, sphingolipid 1 (degs1)
DEGS1 converts dhCer into Cer (Ruangsiriluk et al., 2012) 50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Table 1. Continued
Gene Name (Zebrafish Gene Abbreviation) Known Function Timing of Expression in Zebrafish References
Arylsulfatase A (arsa) arylsulfatase A is an enzyme that hydrolyzes the sulfate ester bond of cerebroside 3-sulfate, a component
of the myelin sheath, to produce cerebroside and sulfate (Lukatela et al., 1998)
one cell-72 hpf Thisse and Thisse, 2004
Sphingomyelin phosphodiesterase 2a (smpd2a)
SMPD2 is responsible for breaking sphingomyelin down into phosphocholine and ceramide (Ago et al., 2006)
50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4a (acsl4a)
ACSL enzymes convert free fatty acids to fatty acyl-CoAs as the initial step in a majority of processing events (Miyares et al.,
2014)
four cell-4 dpf Miyares et al., 2014
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4b (acsl4b)
50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Enoyl-CoA, hydratase/3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (ehhadh)
this enzyme catalyzes the metabolism of fatty acids to produce acetyl-CoA and energy (B ahnson et al., 2002)
one cell-72 hpf, adult Thisse and Thisse, 2004
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1b (acsl1b)
all ACSLs convert long-chain fatty acids into acyl-CoA (Soupene and Kuypers, 2008)
50% epiboly-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 5 (acsl5)
one cell-60 hpf Thisse and Thisse, 2004
ATP-binding cassette transporter (abca1b)
ABCA1 is a cholesterol and phospholipid transporter in conjunction with Apolipoprotein AI (Wang et al., 2001)
50% epiboly-5 dpf Thisse and Thisse, 2004
Scavenger receptor class b, member 1 (scarb1)
SCARB1 acts as a receptor for HDL and may influence its plasma levels (Rigotti et al., 1997)
50% epiboly-19 hpf Thisse and Thisse, 2004
Cholesteryl ester transfer protein (cetp) CETP is an enzyme that mediates the exchange of lipids
between lipoproteins (Kuivenhoven et al., 1998)
50% epiboly-5 dpf Thisse and Thisse, 2004
ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3 (ormdl3)
ORMDL3 may regulate ceramide biosynthe sis, but its function is still unknown (Siow and Wattenberg, 2012)
one cell-72 hpf Thisse and Thisse, 2004
List of genes expressed in the yolk sac, their know function, and their timing of expression. See also Tables S2 and S3.
(Ravaux et al., 2007). Phospholipase A2 is responsible for pro- ducing lysophospholipid species from phospholipids (D'Arrigo
and Servi, 2010). Therefore, it is reasonable to presume that in our PPARg-inhibited embryos there may have been an
Figure 4. The Effects of PPARg Inhibition on the Lipid Profile and Gene Expression of Zebrafish Embryos (A and B) ORO
staining showed decreased lipid present in embryos treated with 5 mM BADGE from 26–52 hpf (B) compared with controls (A).
(C–J) Treatment with 5 mM BADGE from 50–72 hpf decreased the expression of c/ebpa (C and D, arrowheads) and lpl (E and F,
arrowheads), did not affect the expression of pparg (G and H, arrowheads) and increased the expression of fabp11a (I and J,
arrowheads). (K) Lipid amounts are depicted for lipid categories that were significantly changed by exposure to 5 mM BADGE
from 26–52 hpf. Lipid species concentrations are shown in pmol/15 embryos (K). The amount of each individual lipid at a single
time point in 5 mM BADGE-treated embryos was set relative to the level of that lipid species in control embryos. * p <0,05. (L)
A log2 ratio was then calculated for the signals of each lipid species. Red indicates an increase compared to the mean, green
indicates a decrease and black shows no change. Gray is displayed when there is no lipid present. See also Figure S4.
increase in phospholipase A2 expression and activity that could have the led to the increased levels of the lysophospholipid
species. Although the lysophospholipid data correlated to results reported in a previous study (Ravaux et al., 2007), many
1326 Cell Reports 14, 1317–1329, February 16, 2016 ©2016 The Authors
additional changes in the lipids in the BADGE-treated embryos were identified in this project. Liquid chromatography-mass
spectrometry provides a promising tool for in depth analyses into many aspects of lipid biology, including pharmaco- logical,
disease, or metabolic studies, in an amenable model organism.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Lipid Extraction Lipids were extracted with dichloromethane:methanol (2:1) using the Folch method (Folch et al., 1957). The
organic phase was dried with nitrogen and reconstituted in 50 ml of chloroform for thin layer chromatography (TLC).
Thin Layer Chromatography Samples were run on silica gel 60 aluminum sheets (Merck Millipore). Twenty- five microliters of
samples and standards were spotted on the plate. TLC plates were developed in a solution of 43 ml petroleum ether, 7 ml diethyl
ether, and 1 ml acetic acid. Standard 1 (Nu-chek Prep) contains equal parts lecithin (1,2 distearoyl), cholesterol, oleic acid,
triolein, and cholesteryl oleate. Standard 2 (Nu-chek Prep) contains equal parts monoolein, diolein, triolein, and methyl oleate.
Positive controls were 0.5 ml BODIPY/oil stock dissolved in 25 ml of chloroform. Non-fluorescent lipids were detected with
KMnO
4
Bahnson, BJ, Anderson, VE, and Petsko, GA (2002). Structural mechanism of enoyl-CoA hydratase: three atoms from a single
water are added in either an E1cb stepwise or concerted fashion. Biochemistry 41, 2621–2629.
Belkhou, R., Cherel, Y., Heitz, A., Robin, J.-P., and Le Maho, Y. (1991). Energy contribution of proteins and lipids during
prolonged fasting in the rat. Nutr. Res. 11, 365–374.
Carten, JD, Bradford, MK, and Farber, SA (2011). Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty
acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276–285.
Cheng, W., Guo, L., Zhang, Z., Soo, HM, Wen, C., Wu, W., and Peng, J. (2006). HNF factors form a network to regulate liver-
enriched genes in zebra- fish. Dev. Biol. 294, 482–496. Chmurzy ́nska, A. (2006). The multigene family of fatty acid-binding
proteins (FABPs): function, structure and polymorphism. J. Appl. Genet. 47, 39–48.
Choi, H.-S., Sreenivas, A., Han, G.-S., and Carman, GM (2004). Regulation of phospholipid synthesis in the yeast cki1D eki1D
mutant defective in the Ken- nedy pathway. The Cho1-encoded phosphatidylserine synthase is regulated by mRNA stability. J.
Biol. Chem. 279, 12081–12087.
D'Arrigo, P., and Servi, S. (2010). Synthesis of lysophospholipids. Molecules 15, 1354–1377.
Dawid, IB (2004). Developmental biology of zebrafish. Ann. NY Acad. Sci.
stain
1038, 88–93.
giving a pale orange color.
Fang, L., Liu, C., and Miller, YI (2014). Zebrafish models of dyslipidemia: rele-
For complete experimental procedures, see the Supplemental Information.
vance to atherosclerosis and angiogenesis. Transl. Res. 163, 99–108.
Ferre ́, P. (2004). The biology of peroxisome proliferator-
activated receptors: SUPPLEMENTAL INFORMATION
relationship with lipid metabolism and insulin sensitivity. Diabetes 53 (Suppl 1), S43–S50. Supplemental Information includes
Supplemental Experimental Procedures,
Ferreira, CR, Saraiva, SA, Catharino, RR, Garcia, JS,
Gozzo, FC, San- four figures, and three tables and can be found with this article online at
vido, GB, Santos, LFA, Lo Turco, EG, Pontes, JHF, Basso,
AC, et al. http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.01.016.
(2010). Single embryo and oocyte lipid fingerprinting by mass spectrometry. J. Lipid Res. 51, 1218–1227. AUTHOR
CONTRIBUTIONS
Folch, J., Lees, M., and Sloane Stanley, GH (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipides from
animal tissues. J. Biol. Chem. DF performed zebrafish experimental work and lipidomics works, image
226, 497–509. acquisition, data quantification, and data
analysis. AS performed data quan- tification and data analysis. NAM and PJM performed lipidomics work. AJS and YG designed
the experiments. DF, AJS, and YG wrote the pa-
Flynn, EJ, 3rd, Trent, CM, and Rawls, JF (2009). Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J.
Lipid Res. 50, 1641–1652.
per. YG directed the research.
Gibellini, F., and Smith, TK (2010). The Kennedy pathway–De novo synthesis of phosphatidylethanolamine and
phosphatidylcholine. IUBMB Life 62,
ACKNOWLEDGMENTS
414–428.
Gilbert, SF (2000). Early development in fish. In
Developmental Biology (Sina- The authors would like to thank the Deakin University zebrafish facility for
uer Associates). providing excellent husbandry care. YG is
supported by the Centre for Molec-
Gonza ́lez-Serrano, AF, Pirro, V., Ferreira, CR, Oliveri, P.,
Eberlin, LS, ular and Medical Research and a Central Research Grant Scheme at Deakin
Heinzmann, J., Lucas-Hahn, A., Niemann, H., and Cooks,
RG (2013). Desorp- University.
tion electrospray ionization mass spectrometry reveals lipid metabolism of in- dividual oocytes and embryos. PLoS ONE 8,
e74981. Received: September 4, 2015 Revised: December 20, 2015 Accepted: January 2, 2016 Published: February 2, 2016
Guan, XL, Cestra, G., Shui, G., Kuhrs, A., Schittenhelm, RB, Hafen, E., van der Goot, FG, Robinett, CC, Gatti, M., Gonzalez-
Gaitan, M., and Wenk, MR (2013). Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Dev. Cell 24, 98–111.
REFERENCES
Heras, H., Gonzalez-Baro ́ , MR, and Pollero, RJ (2000). Lipid and fatty acid composition and energy partitioning during embryo
development in the shrimp
Ago, H., Oda, M., Takahashi, M., Tsuge, H., Ochi, S., Katunuma, N., Miyano,
Macrobrachium borellii. Lipids 35, 645–651.
M., and Sakurai, J. (2006). Structural basis of the sphingomyelin phosphodies-
Ho ̈ ltta ̈ -Vuori, M., Salo, VT, Nyberg, L., Brackmann, C.,
Enejder, A., Panula, P., terase activity in neutral sphingomyelinase from Bacillus cereus. J. Biol. Chem.
and Ikonen, E. (2010). Zebrafish: gaining popularity in lipid
research. Biochem. 281, 16157–16167.
J. 429, 235–242.
Allen, JD, and Pernet, B. (2007). Intermediate modes of larval development:
Jakobsson, A., Westerberg, R., and Jacobsson, A. (2006).
Fatty acid elon- bridging the gap between planktotrophy and lecithotrophy. Evol. Dev. 9,
gases in mammals: their regulation and roles in metabolism.
Prog. Res lipid. 643–653.
45, 237–249.
Babin, PJ, Thisse, C., Durliat, M., Andre, M., Akimenko, M.-A., and Thisse, B.
Jang, IH, Lee, S., Park, JB, Kim, JH, Lee, CS, Hur, E.-M.,
Kim, IS, Kim, (1997). Both apolipoprotein E and AI genes are present in a nonmammalian
K.-T., Yagisawa, H., Suh, P.-G., and Ryu, SH (2003). The
direct interaction of vertebrate and are highly expressed during embryonic development. Proc.
phospholipase Cg 1 with phospholipase D2 is important for
epidermal growth Natl. Acad. Sci. USA 94, 8622–8627.
factor signaling. J. Biol. Chem. 278, 18184–18190.
Cell Reports 14, 1317–1329, February 16, 2016 ©2016 The Authors 1327
Rosa, Kane, JP, Hardman, DA, and Paulus, HE (1980). Heterogeneity of apolipo-
R., Calado, R., Andrade, AM, Narciso, L., and Nunes,
ML (2005). protein B: isolation of a new species from human chylomicrons. Proc. Natl.
Changes in amino acids and lipids during embryogenesis of
European lobster, Acad. Sci. USA 77, 2465–2469.
Homarus gammarus (Crustacea: Decapoda). Comp. Biochem. Physiol. B Bio-
Kimmel, CB, and Law, RD (1985). Cell lineage of zebrafish blastomeres. II.
chem. Mol. Biol. 140, 241–249.
Formation of the yolk syncytial layer. Dev. Biol. 108, 86–93.
Rosen, ED, Sarraf, P., Troy, AE, Bradwin, G., Moore, K., Milstone, DS,
Knott, TJ, Pease, RJ, Powell, LM, Wallis, SC, Rall, SC, Jr., Innerarity,
Spiegelman, BM, and Mortensen, RM (1999). PPAR g is required for the dif-
TL, Blackhart, B., Taylor, WH, Marcel, Y., Milne, R., et al. (1986). Complete
ferentiation of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol. Cell 4, 611–617.
protein sequence and identification of structural domains of human apolipo-
Ruangsiriluk, W., Grosskurth, SE, Ziemek, D., Kuhn, M.,
des Etages, SG, protein B. Nature 323, 734–738.
and Francone, OL (2012). Silencing of enzymes involved in ceramide biosyn-
Kuivenhoven, JA, Jukema, JW, Zwinderman, AH, de Knijff, P., McPherson,
thesis causes distinct global alterations of lipid homeostasis and gene expres-
R., Bruschke, AV, Lie, KI, and Kastelein, JJ; The Regression Growth Eval-
sion. J. Lipid Res. 53, 1459–1471.
uation Statin Study Group (1998). The role of a common variant of the choles-
Schlegel, A. (2012). Studying non-alcoholic fatty liver
disease with zebrafish: a teryl ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis.
confluence of optics, genetics, and physiology. Sel. Mol.
Hidup Sci. 69, 3953– N. Engl. J. Med. 338, 86–93.
3961.
Kunz-Ramsay, Y. (2013). Lecithotrophic species. In Developmental Biology of
Schlegel, A., and Gut, P. (2015). Metabolic insights from
zebrafish genetics, Teleost Fishes (Springer Science & Business Media).
physiology, and chemical biology. Sel. Mol. Hidup Sci. 72, 2249–2260.
Lampert, JM, Holzschuh, J., Hessel, S., Driever, W., Vogt, K., and von Lintig,
Schlegel, A., and Stainier, DY (2006). Microsomal
triglyceride transfer protein J. (2003). Provitamin A conversion to retinal via the b,b-carotene-15,150-oxy-
is required for yolk lipid utilization and absorption of
dietary lipids in zebrafish genase (bcox) is essential for pattern formation and differentiation during
larvae. Biochemistry 45, 15179–15187. zebrafish
embryogenesis. Development 130, 2173–2186.
Schonfeld, G., and Pfleger, B. (1974). The structure of
human high density lipo- Levi, L., Ziv, T., Admon, A., Levavi-Sivan, B., and Lubzens, E. (2012). Insight
protein and the levels of apolipoprotein AI in plasma as
determined by radio- into molecular pathways of retinal metabolism, associated with vitellogenesis
immunoassay. J. Clin. Menginvestasikan. 54, 236–246. in
zebrafish. Saya. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302, E626–E644.
Schonfeld, G., Chen, J., McDonnell, WF, and Jeng, I.
(1977). Apolipoprotein Liu, H.-Y., Lee, N., Tsai, T.-Y., and Ho, S.-Y. (2010). Zebrafish fat-free, a novel
A-II content of human plasma high density lipoproteins
measured by radioim- Arf effector, regulates phospholipase D to mediate lipid and glucose meta-
munoassay. J. Lipid Res. 18, 645–655. bolism. Biochim.
Biophys. Acta 1801, 1330–1340.
Sharma, MK, Liu, RZ, Thisse, C., Thisse, B., Denovan-
Wright, EM, and Lukatela, G., Krauss, N., Theis, K., Selmer, T., Gieselmann, V., von Figura, K.,
Wright, JM (2006). Hierarchical subfunctionalization of
fabp1a, fabp1b and and Saenger, W. (1998). Crystal structure of human arylsulfatase A: the alde-
fabp10 tissue-specific expression may account for retention
of these dupli- hyde function and the metal ion at the active site suggest a novel mechanism
cated genes in the zebrafish (Danio rerio) genome. FEBS J.
273, 3216–3229. for sulfate ester hydrolysis. Biochemistry 37, 3654–3664.
Simons, K., and Ikonen, E. (1997). Functional rafts in cell
membranes. Nature Mahley, RW (1988). Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with ex-
387, 569–572. panding role in cell biology. Science 240,
622–630.
Siow, DL, and Wattenberg, BW (2012). Mammalian
ORMDL proteins Marza, E., Barthe, C., Andre ́, M., Villeneuve, L., He ́lou, C., and Babin, PJ
mediate the feedback response in ceramide biosynthesis. J.
Biol. Chem. (2005). Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish
287, 40198–40204. gene homologous to mammalian
microsomal triglyceride transfer protein large
Song, Y., Selak, MA, Watson, CT, Coutts, C., Scherer, PC,
Panzer, JA, subunit. Dev. Dyn. 232, 506–518.
Gibbs, S., Scott, MO, Willer, G., Gregg, RG, et al. (2009).
Mechanisms Miyares, RL, de Rezende, VB, and Farber, SA (2014). Zebrafish yolk lipid
underlying metabolic and neural defects in zebrafish and
human multiple processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and meta-
acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD). PLoS ONE
4, e8329. bolism. Dis. Model. Mech. 7, 915–927.
Soupene, E., and Kuypers, FA (2008). Mammalian long-
chain acyl-CoA syn- Monroig, O., Rotllant, J., Sa ́ nchez, E., Cerda ́ -Reverter, JM, and Tocher, DR
thetases. Exp. Biol. Med. (Maywood) 233, 507–521.
(2009). Expression of long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) biosyn-
Spiegel, S., Foster, D., and Kolesnick, R. (1996). Signal
transduction through thesis genes during zebrafish Danio rerio early embryogenesis. Biochim.
lipid second messengers. Curr. Opin. Cell Biol. 8, 159–167.
Biophys. Acta 1791, 1093–1101.
Thisse, B., and Thisse, C. (2004). Fast release clones: a
high throughput Nishio, S., Gibert, Y., Bernard, L., Brunet, F., Triqueneaux, G., and Laudet, V.
expression analysis. ZFIN Direct Data Submission
(http://zfin.org). (2008). Adiponectin and adiponectin receptor genes are coexpressed during zebrafish embryogenesis and
regulated by food deprivation. Dev. Dyn. 237, 1682–1690.
Nishio, S., Gibert, Y., Berekelya, L., Bernard, L., Brunet, F., Guillot, E., Le Bail, J.-C., Sa ́nchez, JA, Galzin, AM, Triqueneaux,
G., and Laudet, V. (2012). Fasting induces CART down-regulation in the zebrafish nervous system in a cannabinoid receptor 1-
dependent manner. Mol. Endocrinol. 26, 1316–1326.
Thisse, C., and Thisse, B. (2005). High throughput expression analysis of ZF-models consortium clones. ZFIN Direct Data
Submission (http://zfin.org). Thisse, B., Pflumio, S., F ü rthauer, M., Loppin, B., Heyer, V., Degrave, A., Woehl, R., Lux, A.,
Steffan, T., and Charbonnier, X. (2001). Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. ZFIN Direct Data
Submission (http://zfin.org).
Rauch, G., Lyons, D., Middendorf, I., Friedlander, B., Arana, N., Reyes, T., and Talbot, W. (2003). Submission and curation of
gene expression data. ZFIN
Tontonoz, P., and Spiegelman, BM (2008). Fat and beyond: the diverse biology of PPARgamma. Annu. Rev. Biochem. 77, 289–
312.
Direct Data Submission (http://zfin.org).
Wallace, KN, Akhter, S., Smith, EM, Lorent, K., and Pack, M. (2005). Intes-
Ravaux, L., Denoyelle, C., Monne, C., Limon, I., Raymondjean, M., and El Ha-
tinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157–173.
dri, K. (2007). Inhibition of interleukin-1b-induced group IIA secretory phos-
Wang, N., Silver, DL, Thiele, C., and Tall, AR (2001). ATP-binding cassette
pholipase A2 expression by peroxisome proliferator-activated receptors
transporter A1 (ABCA1) functions as a cholesterol efflux regulatory protein.
(PPARs) in rat vascular smooth muscle cells: cooperation between PPARbeta
J. Biol. Chem. 276, 23742–23747.
and the proto-oncogene BCL-6. Mol. Sel. Biol. 27, 8374–8387.
Wang, F., Pearson, KJ, Davidson, WS, and Tso, P. (2013). Specific
Rigotti, A., Trigatti, BL, Penman, M., Rayburn, H., Herz, J., and Krieger, M.
sequences in N termini of apolipoprotein A-IV modulate its anorectic effect.
(1997). A targeted mutation in the murine gene encoding the high density lipo-
Physiol. Behav. 120, 136–142.
protein (HDL) receptor scavenger receptor class B type I reveals its key role in
Waterham, HR, Koster, J., Romeijn, GJ, Hennekam, RC,
Vreken, P., HDL metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12610–12615.
Andersson, HC, FitzPatrick, DR, Kelley, RI, and Wanders, RJ (2001).
1328 Cell Reports 14, 1317–1329, February 16, 2016 ©2016 The Authors
peroxisome Mutations in the 3b-hydroxysterol D24-reductase gene cause desmosterolo-
proliferator-activated receptor g inhibits
adipocyte differentiation. sis, an autosomal recessive disorder of cholesterol biosynthesis. Saya. J.
J. Biol. Chem. 275, 1873–1877. Bersenandung. Genet. 69,
685–694.
Zhang, T., Yao, S., Wang, P., Yin, C., Xiao, C., Qian, M., Liu, D., Zheng, L.,
Wiegand, MD (1996). Composition, accumulation in teleost fish. Rev. Ikan Biol. Ikan. 6, 259–286.
and utilization of yolk lipids
Meng, W., Zhu, H., et al. (2011). ApoA-II directs morphogenetic movements of zebrafish embryo by preventing chromosome
fusion during nuclear division in yolk syncytial layer. J. Biol. Chem. 286, 9514–9525.
Wright, HM, Clish, CB, Mikami, T., Hauser, S., Yanagi, K., Hiramatsu, R.,
Zon, LI (1999). Zebrafish: a new model for human disease.
Genome Res. 9, Serhan, CN, and Spiegelman, BM (2000). A synthetic antagonist for the
99–100.
Cell Reports 14, 1317–1329, February 16, 2016 ©2016 The Authors 1329