Práctica No.

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MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
Madelyn Morales1 (201503676), María Samayoa1 (201516818), Lilian Pacay1 (201603903), Karen
Alvarez1 (201603939) 1Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia,
Universidad de San Carlos de Guatemala, Carrera de Química Farmacéutica.

INTRODUCCIÓN
En la separación de aminoácidos y proteínas la cromatografía es una de las técnicas más empleadas,
que permite separar mezclas, llevar un proceso de purificación, identificación y otras aplicaciones
más. La cromatografía en capa fina consta de un sistema de dos fases, una sólida (fase estacionaria)
a través de la cual transita un líquido o solvente (fase móvil o eluyente). Se utiliza para separar
moléculas relativamente pequeñas, entre éstas los aminoácidos y obtener así un valor de Rf (factor
de retención) para una posterior identificación de sustancias (Guarnizo y Martínez, 2004). La
cromatografía de exclusión molecular "es una modalidad de la cromatografía líquido-sólido, en la
que la fase estacionaria es un material poroso inerte, que permite la discriminación de solutos. Su
fundamento es el tamaño de las moléculas" (Cases y Hens, 1988). El objetivo de la práctica es que los
estudiantes tengan la capacidad de comprender los principios de separación de las distintas
cromatografías y su utilidad técnica del laboratorio, la separación de componentes de una mezcla de
aminoácidos como también la identificación y la desalación de proteínas. Se determinó que la
mezcla de aminoácidos contenía glicina, alanina, arginina, triptófano, ácido aspártico como también
una muestra desconocida de glicina y también se determinaron fracciones de eluido en la exclusión
molecular en donde se encontraba la proteína y en algunas la sal NaCl.
METODOLOGÍA
Se llevó a cabo la separación de gelatina y RESULTADOS
cloruro de sodio por medio del método Figura No. 1 Identificación de aminoácidos
cromatográfico de exclusión molecular; por medio de cromatografía en capa fina
utilizando como fase estacionaria gel
Sephadex G-25 . Esta técnica está definida
por fraccionamientos de volumen: el
volumen total, volumen de fase móvil
necesario para que eluyan todas las
partículas de mayor tamaño, volumen
ocupado por el gel y el volumen de elución
(Yúfera, 2007), para la identificación
diferencial de la proteína y la sal se utilizó
Reactivo de Biuret y Nitrato de Plata,
respectivamente. La cromatografía en
capa fina requiere de ciertas afinidades
para poderse realizar en forma correcta, se
basa principalmente en características de
1= Glicina 2 =Arginina 3= Triptófano 4=
polaridad. Se llevó a cabo una separación
Ácido Aspártico 5=Alanina 6= Glicina (muestra
de componentes en una mezcla de desconocida).
aminoácidos que fueron determinados a Fuente: Datos experimentales, obtenidos en el
partir del Rf de cada sustancia separada. Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, USAC

Gráfica No.1 Absorbancia y precipitado en
fracciones del eluído de la proteína de
gelatina.
*%= porcentaje
Fuente: Resultados experimentales, obtenidos en el
Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, USAC.
En la figura No.1 se observan los valores
obtenidos de Rf de aminoácidos en una
mezcla para ser comparados con una
muestra desconocida identificada.
En la gráfica No.1 se muestran rangos de
absorbancia para 20 fracciones de elución
de gelatina como la intensidad de
precipitado de estas fracciones. Para
determinar a partir de esto la presencia de
la proteína dando una mayor absorbancia y
bien del Cloruro de Sodio (NaCl) por medio
de la mayor intensidad de porcentaje
insolubilidad
Los datos para la obtención de resultados
se obtuvieron de forma directa.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Al hacer la separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina los aminoácidos
que ascendieron en la capa de silicagel
fueron glicina, triptófano, ácido aspártico y
alanina, el aminoácido que no ascendió y
presentó un Rf de cero fue la Arginina (ver
figura No.1) debido a que, este
aminoácido en su cadena lateral R es polar
básico que posee carga positiva por lo que
será retenido en la fase estacionaria
(Stryer, Berg y Tymoczko,2003).
Así como la glicina y la alanina los cuales
ascendieron por la capa de sílica gel (ver
figura No.1), fue debido a que estos son
aminoácidos que presentan un carácter
apolar por su cadena lateral, lo cual hace
que eluyan con mayor facilidad y no se
queden retenidos en la fase estacionaria
como lo hace un aminoácido de cadena
lateral polar, ya que estos absorben más
firmemente a los centros activos de la fase
estacionaria (UAM, s.f) esto no sucede de
igual manera con un aminoácido de cadena
lateral R apolar como la glicina y la alanina
que presentaron un Rf de 0.55 y 0.69
respectivamente (ver anexo No.1) lo cual
fue debido a que se tuvo un eluyente (n-
propanol-agua) para compuestos con
polaridad media, ya que el orden de
elución de un compuesto se incrementa al
aumentar la polaridad de la fase móvil o
eluyente (UAM, s.f.). En el caso del el ácido
aspártico y el triptófano la distancia
recorrida de cada uno de ellos en la capa
de sílica gel fue de 5.2 cm y 6.5 cm,
respectivamente (ver anexo No.1) esto fue
porque el triptófano tiene en su cadena
lateral R un carácter relativamente apolar
en comparación al ácido aspártico que
presenta una cadena lateral R polar lo cual
hace que el triptófano tenga una mayor
afinidad a la fase móvil que fue n-propanol-
agua que la fase estacionaria (Plummer,
1981) y presentó un valor de Rf de 0.90
que indica la distancia por la cual recorrió
dicho aminoácido siendo afín al disolvente
de la fase móvil(Schlimme, 2007) y en el
ácido aspártico se observó que fue afín
con el disolvente (n-propanol-agua)
debido a su mayor grado de polaridad en
su cadena lateral.
La muestra desconocida se puede
determinar que sus valores de Rf son
0.55 (Ver figura 1) iguales al de la glicina
también, se puede observar que sus
características como su forma y color son
similares .
En el proceso de desalado en la
cromatografía de exclusión molecular, la
gelatina al ser una proteína compleja con
un peso molecular elevado a comparación
del peso molecular del cloruro de sodio
(sal); está proteína quedó excluida del
sephadex G25 y eluyó primero. (Cases y
Hens, 1988) (Ver gráfica No.1)
Para comprobar la veracidad del enunciado
anterior, por medio del reactivo de Biuret
se confirmó la presencia de proteínas, y
estas fueron verificadas a partir de la
absorbancia. Como se muestra en la gráfica
No.1 se tuvo una mayor absorbancia en las
fracciones del 5-8 donde los picos se
encuentran en posiciones mayores al haber
mantenido un rango de 0.50- 0.60 de
absorbancia; al aplicar la ley de Beer, que
establece que la concentración es
proporcional al número de moléculas
absorbentes del analito por las que pasa la
luz, (Universidad Nacional de la Plata, s.f)
se afirma que la mayor concentración de
proteína se encuentra en esas fracciones,
mientras que los valores de absorbancia
negativos nos indican la ausencia de
proteínas en las eluciones.
Como se observa en la gráfica No.1 la
elución del cloruro de sodio fue posterior
al de las moléculas de la gelatina (al
reaccionar con AgNO3 formando así un
precipitado blanco de AgCl) en donde las
fracciones 11-14 tuvieron un mayor
porcentaje de precipitación y una menor
absorbancia, por lo cual se comprueba que
estas pequeñas moléculas atravesaron la
malla formada por el Sephadex G25 y se
vieron atrasadas en su descenso, al
contrario que las moléculas de gelatina que
no atravesaron dicha malla y que eluyeron
más rápidamente.
El Kd fue de 0.17 (ver anexo No.2) este Kd
está en un rango ideal, ya que un valor
igual a 1 nos indicaría que las partículas no
salen del gel por lo que la cromatografía
no se podría llevar a cabo y un Kd igual a 0
nos indica que las partículas son excluidas
en su totalidad, por tanto está en un valor
donde existe retención de algunas
partículas y exclusión de otras a traves del
gel, un coeficiente de distribución es un
valor que indica la capacidad de un
sorbente para retener una sustancia y
controlar su movilidad (Porta, 2014)
CONCLUSIONES
La arginina no presentó una distancia
recorrida que los demás aminoácidos
porque este tiene mayor afinidad en la fase
estacionaria por el carácter polar de su
cadena R lateral.
Los aminoácidos como la glicina y la
alanina, que eluyeron a través de la capa
de silicagel fue debido al carácter apolar de
su cadena lateral, lo cual los hace menos
afín a la fase estacionaria y más a la fase
móvil.
La gelatina eluyó más rápidamente, cerca
de la fracción 5 a 8 ya que su absorbancia
con el reactivo de Biuret se encuentra de
alrededor de 0.50 a 0.60, mayor a las otras
fracciones que tiene una absorbancia
negativa por la ausencia de gelatina.
La fracciones de eluído con precipitación a
partir de AgNO3 por la presencia de sal
formando AgCl un precipitado blanco se
dió luego de la elución de la proteína,
cerca de la fracción 11 a la 14 donde se
observó mayor precipitado.
El Kd de la exclusión molecular fue de 0.17, ANEXOS:
lo cual indicó la retención de ciertas Anexo No.1
partículas y la exclusión de otras que son Tabla 1. Identificación de aminoácidos
diferentes en cuanto a su peso molecular y por medio de la cromatografía de capa
tamaño.
fina a partir de los valores Rf.
AA* Distancia Valor Rf
REFERENCIAS Recorrida (cm**)
Cases, M. V. y Hens, A. G. (1988). Técnicas 1 Glicina 4 0.55
Analíticas de Separación. España.
2 Arginina 0 0
Reverté S. A.
3 Triptófano 6.5 0.90
4 Ácido 5.2 0.72
Guarnizo, F. A. Y Martínez, P. N. (2004). Aspártico
Química Orgánica. Colombia. 5 Alanina 5 0.69
Elizcom.
Muestra Glicina 4 0.55
desconocida
Plummer, D. (1981). Introducción a la Distancia Recorrida por el 7.2
bioquímica práctica.Colombia: frente del disolvente (cm)
McGrawHill *AA= Aminoácido
**cm= centímetros.
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en el
Porta J., ( 2014), Edafología uso y
Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, USAC.
protección de adsorción . España:
Mundi- Prensa Anexo No.2: Cálculo de Kd
- Vt= 275 ml= Volumen total
Schlimme, E. (2007). Aminoácidos - Ve= 75 ml = Volumen eluente
propiedades químicas y - a= 3 g = Peso del gel
físicas.España: Acribia, S.A. - Wr=50 ml = Agua necesaria
- Vi= aWr= (3g) (50 ml)= 150 ml
Stryer, L., Berg, J. y Tmoczko T. (2003). - Vmatriz del gel= Vo
Bioquímica.Barcelona:Reverté, S.A. Vt= Vo + Ve + Vi
Vt-Ve- Vi= Vo= 275-75-150= 50
UAM, (s.f). Cromatografía en Placa fina. Kd= Ve- Vo/ Vi = 75-50/ 150 = 0.17
México: Universidad Autónoma
Metropolitana.

Universidad Nacional de la Plata. (S.f).

Determinación cuantitativa de
proteínas. Argentina. Recuperado
de:
http://catedras.quimica.unlp.edu.a
r/qo3/Apuntes/Proteinas.pdf