STERILISASI

I. Tujuan Percobaan

1. Memahami prinsip sterilisasi

2. Memahami dan melakukan metoda-metoda sterilisasi.
3. Mengetahui cara kerja autoklaf
4. Melakukan proses sterilisasi alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi
5. Membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi

II. Teori Dasar

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga
jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak.
Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri
(Fardiaz, 1992).
Sterilisasai adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi. Sterilisasi
adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada
5 metode umum sterilisasi yaitu :

 Sterilisasi uap (panas lembap)

 Sterilisasi panas kering
 Sterilisasi dengan penyaringan
 Sterilisasi gas
 Sterilisasi dengan radiasi

Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian
mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembap) dan metode sterilisasi panas kering.

A. Sterilisasi Uap

Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai
pensterilnya. Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada
temperature yang lebih rendah dibandingkan bila tidak ada kelembapan. Mekanisme
penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi dan koagulasi
beberapa protein esensial dari organism tersebut.:

Prinsip cara kerja autoklaf

Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf adalah alat
untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm)
dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan
tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan
yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk
mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15
menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu
tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut
(sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di
ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat
kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu,
maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian
2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk
mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan
tekanan 15 psi selama 15 menit.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama

kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara
yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti
dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara
dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang
sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung
waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas
dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh
dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.
 Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba
pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus,
lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini
dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada
media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
(http://www.scribd.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar).

B. Sterilisasi Panas Kering

Sterilisasi panas kering biasanya dilakukan dengan menggunakan oven pensteril. Karena
panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan uap air panas maka
metode ini memerlukan temperature yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi
panas kering biasanya ditetapkan pada temperature 160-170oC dengan waktu 1-2 jam.

Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif
untuk disterilkan dengan uap air panas, karena sifatnya yang tidak dapat ditembus atau tidak
tahan dengan uap air. Senyawa-senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis
minyak), dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga efektif untuk mensterilkan
alat-alat gelas dan bedah.

Karena suhunya sterilisasi yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan
untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh:alat ukur) dan penutup karet atau
plastik.

C. Sterilisasi dengan penyaringan

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah rusak
jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu
saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter
yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.

D. Sterilisasi gas

Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh
mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan
serbuk padat. Sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan
dibunuh. Sterilisasi gas biasanya digunakan untuk bahan yang tidak bisa difiltrasi, tidak tahan
panas dan tidak tahan radiasi atau cahaya.

E. Sterilisasi dengan radiasi

Radiasi sinar gama atau partikel elektron dapat digunakan untuk mensterilkan jaringan
yang telah diawetkan maupun jaringan segar. Untuk jaringan yang dikeringkan secara liofilisasi,
sterilisasi radiasi dilakukan pada temperatur kamar (proses dingin) dan tidak mengubah struktur
jaringan, tidak meninggalkan residu dan sangat efektif untuk membunuh mikroba dan virus
sampai batas tertentu. Sterilisasi jaringan beku dilakukan pada suhu -40 derajat Celsius.
Teknologi ini sangat aman untuk diaplikasikan pada jaringan biologi.

III. Alat dan Bahan

Alat :

- Autoclave - Batang pengaduk

- Oven - Spatel

- Erlenmeyer - Gunting

- Tabung reaksi - Kertas label

- Cawan petri - Benang kasur

- Botol media - Alumunium Foil

- Gelas ukur - Labu takar

- Kapas - Kasa asbes

- Kaki tiga

Bahan :
 - Nutrient Agar

- Nutrient Broth

IV. Prosedur Percobaan

Cara sterilisasi tabung reaksi dan gelas ukur:

Kapas di bungkus kain kasa dan di ikat dengan

benang kasur

bungkusan kapas di masukkan ke mulut tabung reaksi

dan labu ukur

kemudian permukaannya di tutup dengan

alumunium foil dan di ikat menggunakan benang
kasur agar tidak terlepas

selanjutnya tabung reaksi dan labu ukur di masukkan

ke dalam autoclave

Cara sterilisasi gelas kimia dan labu takar:

permukaan gelas kimia dan labu takar di tutup

dengan aluminium foil

selanjutkan gelas kimia dan labu takar di masukkan ke dalam

autoclave
Cara sterilisasi cawan petri:

seluruh permukaan cawan petri

di bungkus menggunakan kertas
hvs

Kemudian cawan petri yang telah dibungkus di masukkan ke dalam

autoclave

Cara sterilisasi pipet volume:

kapas dibungkus kain kasa dan di ikat manggunakan benang kasur

bungkusan kapas di masukkan ke dalam mulut pipet

volume

selanjutnya ujung mulut di tutup menggunakan

alumunium foil

kemudian pipet volume di bungkus dengan kertas hvs secara

menyeluruh

masukkan kedalam autoclave

 Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer

Nutrien Agar

nutrient agar di timbang untuk pembuatan 400ml

Nutrien agar dimasukkan kedalam labu

erlenmeyer dan ditambahkan aquades 400
mL

lalu dipanaskan mengunakan Hot plate stirrer dan

diaduk menggunakan magnetik stirrer sampai larutan
jernih

larutan dibagi menjadi 2 bagian kedalam

labu erlenmeyer dan mulut labu erlenmeyer
ditutup dengan gulungan kapas

kemudian dilapisi dengan alumunium foil

masukkan kedalam autoclave

Nutrien Broth
 nutrien broth ditimbang unutk
pembuatan 200 mL

nutrien broth dimasukkan kedalam labu

erlenmeyer dan ditambahkan aquades 200 mL

lalu dipanaskan mengunakan Hot plate stirrer

dan diaduk menggunakan magnetik stirrer
sampai larutan jernih.

larutan dibagi menjadi 2 bagian

kedalam labu erlenmeyer dan mulut
labu erlenmeyer ditutup dengan
gulungan kapas

kemudian dilapisi dengan alumunium foil

masukkan kedalam autoclave

V. Data Pengamatan dan Perhitungan

Data Pengamatan

No Media T=0 jam T=24 jam

1 Nutrien Agar  Nutrien Agar ditambahkan  Setelah didiamkan selama 24
dengan Aquades lalu jam di laboratorium, larutan
dipanaskan dan Nutrien Agar berubah bentuk
 menghasilkan larutan dari larutan menjadi padatan
Nutrien Agar yang seperti agar dan mengalami
berwarna kuning muda. perubahan warna dari kuning
 Setelah disterilisasi muda menjadi kuning keruh.
menggunakan autoklaf
larutan tetap berwarna
kuning muda.
2 Nutrien Broth  Nutrien Broth ditambahkan  Setelah didiamkan selama 24
Aquades lalu dipanaskan jam di laboratorium, larutan
dan menghasilkan larutan Nutrien Broth tidak mengalami
Nutrien Broth yang perubahan bentuk dan
berwarna kuning bening perubahan warna. Larutan
atau jernih. Nutrien Broth tetap berwarna
 Setelah disterilisasi kuning bening atau jernih.
menggunakan autoklaf
larutan tetap berwarna
kuning bening atau jernih.

Nutrien Agar setelah di sterilisasi

Gambar ini merupakan madia Nutrien Agar setelah disterilisasi menggunakan autoklaf dan sudah
didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Agar menjadi padatan seperti agar dan
berubah warna menjadi kuning agak keruh.

Nutrien broth setelah disterilisasi

Gambar ini merupakan madia Nutrien Broth setelah disterilisasi menggunakan autoklaf dan
sudah didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Broth tetap berwarna kuning bening
atau jernih.

Alat-alat yang disterilisasi adalah labu Erlenmeyer, labu takar, pipet volume, gelas ukur,
tabung reaksi dan cawan petri. Semua alat yang sudah disterilisasi tidak mengalami perubahan
dan dapat dikatakan semua alat dalam keadaan steril.

Perhitungan

Dit : berat Nutrien Agar yang dibutuhkan untuk pembuatan 200 mL dan berat Nutrien Broth
yang dibutuhkan untuk pembuatan 100 mL.

Dik : Nutrien Agar : 28 gram untuk 1000 mL, Nutrien Broth : 8 gram untuk 1000 mL

Jawab :
Nutrien Agar yang dibutuhkan = 200 mL/1000 mL x 28 gram

= 0,2 x 28

= 5,6 gram

Nutrien Broth yang dibutuhkan = 100 mL/1000 mL x 8 gram

= 0,1 x 8

= 0,8 gram

VI. Pembahasan

Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasai alat-alat yang berada di laboratorium
mikrobiologi. Tujuan dilakukannya sterilisasi alat ialah agar alat-alat yang berada di
laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alat-
alat yang disterilisasi adalah tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume,
dan cawan petri. Alat-alat disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Alat-alat yang disterilisasi menggunakan autoklaf merupakan alat-alat gelas yang presisi. Alasan
menggunakan autoklaf ialah waktu yang dibutuhkan untuk mensterilkan alat sangkat singkat dan
pada suhu 1210C alat gelas tidak akan memuai sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Alasan
tidak menggunakan oven untuk mensterilkan alat gelas ini karena oven membutuhkan waktu
yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170oC. Pada suhu 160-170oC,
alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat. Sebelum disterilisasi menggunakan
autoklaf,semua alat ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil.
Tujuannya agar semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba.

Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer.
Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Pembuatan media Nutrien Broth
dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah
larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.
 Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 0,8 gram Nutrien Broth dan 100 mL
aquades. Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna
kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien
Broth dipanaskan menggunakan hot plate stirrer. Pemanasan dilakukan sambil diaduk
menggunakan magnetic stirrer yang bertujuan agar Nutrien Broth larut sempurna dan
menghasilkan larutan yang jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup
dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil.
Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil ialah agar proses sterilisasi media Nutrien Broth
berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang benar-benar steril. Setelah itu labu
Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15
menit, labu dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Broth yang berwarna
kuning bening atau jernih sama dengan warna larutan Nutrien Broth sebelum dimasukkan
kedalam autoklaf. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di laboratorium.
Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak dengan cepat
dalam waktu 24 jam. Setelah 24 jam didiamkan, larutan tetap berwarna kuning bening atau
jernih.

Media Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dibandingkan dengan Nutrien Broth control.

Ini merupakan gambar Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien Broth control. Dari
gambar terlihat sekali perbedaan warna antara Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien
Broth control. Warna larutan Nutrien Broth control adalah kuning keruh. Warna kuning keruh
ini disebabkan larutan Nutrien Broth ini tidak disterilisasi dan warna kuning keruh ini
menandakan bahwa terdapat banyak bakteri didalam larutan Nutrien Broth control dan dapat
dikatan tidak steril. Tetapi warna larutan Nutrien Broth adalah kuning bening atau jernih. Warna
kuning bening ini menandakan bahwa larutan Nutrien Broth yang sudah disterilisasi ini tidak
terdapat bakteri atau mikroba didalam larutan Nutrien Broth atau dapat dikatakan bahwa larutan
Nutrien Broth ini sudah steril.

Untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 5,6 gram Nutrien Agar dan 200 mL
aquades. Langkah kerja pembuatan media Nutrien Agar ini sama seperti pembuatan media
Nutrien Broth. Proses pemanasan larutan Nutrien Agar dibutuhkan suhu 123-1250C. Hal ini
dilakukan agar larutan Nutrien Agar menjadi homogen dan tidak cepat memadat. Setelah
dilakukan pemanasan dihasilkan Nutrien Agar yang berwarna kuning muda. Lalu larutan Nutrien
Agar ini dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15 menit,
larutan Nutrien Agar dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Agar yang
berwarna kuning muda sama seperti warna larutan Nutrien Agar sebelum dimasukkan kedalam
autoklaf. Sama seperti larutan Nutrien Broth, larutan Nutrien Agar juga didiamkan selama 24
jam di laboratorium. Setelah didiamkan selama 24 jam, larutan Nutrien Agar berubah bentuk dari
larutan menjadi padatan yang menyerupai agar. Selain perubahan bentuk, terjadi juga perubahan
warna dari warna kuning muda menjadi warna kuning agak keruh.

VII. Kesimpulan

1. Sterilisasi merupakan suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup
dan spora-sporanya.
2. Terdapat 5 metode umum sterilisasi yaitu sterilisasi uap, sterilisasi panas kering,
sterilisasi dengan penyaringan, sterilisasi gas dan sterilisasi dengan radiasi.
3. Metode sterilisasi uap digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan
lainnya yang tahan terhadap temperature yang digunakan dan tahan terhadap penembusan
uap air.
4. Larutan Nutrien Agar setelah disterilisasi memadat seperti agar dan berwarna kuning.
5. Larutan Nutrien Broth setelah disterilisasi berwarna kuning bening yang menandakan
larutan tidak terkontaminasi dan sudah steril.
 6. Prinsip penggunaan autoclave didasarkan pada mikroorganisme, termasuk spora yang
tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada tempratur sedikit di atas titik
didih air.

VIII. Daftar Pustaka

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-2-media-pertumbuhan.html

http://www.scribd.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar

Fardiaz, Srikandi. 1992.Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan.

PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.

Hadioetomo,R.S.1993.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.Granedia,Jakarta.

Suriawiria,U.2005.Mikrobiologi Dasar.Papas Sinar Sinanti,Jakarta.

Lim,D.1998.Microbiology,2nd Edition,McGrow-hill book,New York.