I. Tujuan Percobaan
Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga
jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak.
Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri
(Fardiaz, 1992).
Sterilisasai adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi. Sterilisasi
adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada
5 metode umum sterilisasi yaitu :
Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian
mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembap) dan metode sterilisasi panas kering.
A. Sterilisasi Uap
Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai
pensterilnya. Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada
temperature yang lebih rendah dibandingkan bila tidak ada kelembapan. Mekanisme
penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi dan koagulasi
beberapa protein esensial dari organism tersebut.:
Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf adalah alat
untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm)
dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan
tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan
yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk
mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15
menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu
tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut
(sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di
ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat
kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu,
maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian
2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk
mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan
tekanan 15 psi selama 15 menit.
Sterilisasi panas kering biasanya dilakukan dengan menggunakan oven pensteril. Karena
panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan uap air panas maka
metode ini memerlukan temperature yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi
panas kering biasanya ditetapkan pada temperature 160-170oC dengan waktu 1-2 jam.
Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif
untuk disterilkan dengan uap air panas, karena sifatnya yang tidak dapat ditembus atau tidak
tahan dengan uap air. Senyawa-senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis
minyak), dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga efektif untuk mensterilkan
alat-alat gelas dan bedah.
Karena suhunya sterilisasi yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan
untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh:alat ukur) dan penutup karet atau
plastik.
Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah rusak
jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu
saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter
yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.
D. Sterilisasi gas
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh
mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan
serbuk padat. Sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan
dibunuh. Sterilisasi gas biasanya digunakan untuk bahan yang tidak bisa difiltrasi, tidak tahan
panas dan tidak tahan radiasi atau cahaya.
Radiasi sinar gama atau partikel elektron dapat digunakan untuk mensterilkan jaringan
yang telah diawetkan maupun jaringan segar. Untuk jaringan yang dikeringkan secara liofilisasi,
sterilisasi radiasi dilakukan pada temperatur kamar (proses dingin) dan tidak mengubah struktur
jaringan, tidak meninggalkan residu dan sangat efektif untuk membunuh mikroba dan virus
sampai batas tertentu. Sterilisasi jaringan beku dilakukan pada suhu -40 derajat Celsius.
Teknologi ini sangat aman untuk diaplikasikan pada jaringan biologi.
Alat :
- Oven - Spatel
- Erlenmeyer - Gunting
- Kaki tiga
Bahan :
- Nutrient Agar
- Nutrient Broth
Nutrien Agar
Nutrien Broth
nutrien broth ditimbang unutk
pembuatan 200 mL
Data Pengamatan
Gambar ini merupakan madia Nutrien Broth setelah disterilisasi menggunakan autoklaf dan
sudah didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Broth tetap berwarna kuning bening
atau jernih.
Alat-alat yang disterilisasi adalah labu Erlenmeyer, labu takar, pipet volume, gelas ukur,
tabung reaksi dan cawan petri. Semua alat yang sudah disterilisasi tidak mengalami perubahan
dan dapat dikatakan semua alat dalam keadaan steril.
Perhitungan
Dit : berat Nutrien Agar yang dibutuhkan untuk pembuatan 200 mL dan berat Nutrien Broth
yang dibutuhkan untuk pembuatan 100 mL.
Dik : Nutrien Agar : 28 gram untuk 1000 mL, Nutrien Broth : 8 gram untuk 1000 mL
Jawab :
Nutrien Agar yang dibutuhkan = 200 mL/1000 mL x 28 gram
= 0,2 x 28
= 5,6 gram
= 0,1 x 8
= 0,8 gram
VI. Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasai alat-alat yang berada di laboratorium
mikrobiologi. Tujuan dilakukannya sterilisasi alat ialah agar alat-alat yang berada di
laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alat-
alat yang disterilisasi adalah tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume,
dan cawan petri. Alat-alat disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Alat-alat yang disterilisasi menggunakan autoklaf merupakan alat-alat gelas yang presisi. Alasan
menggunakan autoklaf ialah waktu yang dibutuhkan untuk mensterilkan alat sangkat singkat dan
pada suhu 1210C alat gelas tidak akan memuai sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Alasan
tidak menggunakan oven untuk mensterilkan alat gelas ini karena oven membutuhkan waktu
yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170oC. Pada suhu 160-170oC,
alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat. Sebelum disterilisasi menggunakan
autoklaf,semua alat ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil.
Tujuannya agar semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba.
Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer.
Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Pembuatan media Nutrien Broth
dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah
larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.
Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 0,8 gram Nutrien Broth dan 100 mL
aquades. Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna
kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien
Broth dipanaskan menggunakan hot plate stirrer. Pemanasan dilakukan sambil diaduk
menggunakan magnetic stirrer yang bertujuan agar Nutrien Broth larut sempurna dan
menghasilkan larutan yang jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup
dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil.
Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil ialah agar proses sterilisasi media Nutrien Broth
berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang benar-benar steril. Setelah itu labu
Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15
menit, labu dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Broth yang berwarna
kuning bening atau jernih sama dengan warna larutan Nutrien Broth sebelum dimasukkan
kedalam autoklaf. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di laboratorium.
Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak dengan cepat
dalam waktu 24 jam. Setelah 24 jam didiamkan, larutan tetap berwarna kuning bening atau
jernih.
Media Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dibandingkan dengan Nutrien Broth control.
Ini merupakan gambar Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien Broth control. Dari
gambar terlihat sekali perbedaan warna antara Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien
Broth control. Warna larutan Nutrien Broth control adalah kuning keruh. Warna kuning keruh
ini disebabkan larutan Nutrien Broth ini tidak disterilisasi dan warna kuning keruh ini
menandakan bahwa terdapat banyak bakteri didalam larutan Nutrien Broth control dan dapat
dikatan tidak steril. Tetapi warna larutan Nutrien Broth adalah kuning bening atau jernih. Warna
kuning bening ini menandakan bahwa larutan Nutrien Broth yang sudah disterilisasi ini tidak
terdapat bakteri atau mikroba didalam larutan Nutrien Broth atau dapat dikatakan bahwa larutan
Nutrien Broth ini sudah steril.
Untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 5,6 gram Nutrien Agar dan 200 mL
aquades. Langkah kerja pembuatan media Nutrien Agar ini sama seperti pembuatan media
Nutrien Broth. Proses pemanasan larutan Nutrien Agar dibutuhkan suhu 123-1250C. Hal ini
dilakukan agar larutan Nutrien Agar menjadi homogen dan tidak cepat memadat. Setelah
dilakukan pemanasan dihasilkan Nutrien Agar yang berwarna kuning muda. Lalu larutan Nutrien
Agar ini dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15 menit,
larutan Nutrien Agar dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Agar yang
berwarna kuning muda sama seperti warna larutan Nutrien Agar sebelum dimasukkan kedalam
autoklaf. Sama seperti larutan Nutrien Broth, larutan Nutrien Agar juga didiamkan selama 24
jam di laboratorium. Setelah didiamkan selama 24 jam, larutan Nutrien Agar berubah bentuk dari
larutan menjadi padatan yang menyerupai agar. Selain perubahan bentuk, terjadi juga perubahan
warna dari warna kuning muda menjadi warna kuning agak keruh.
VII. Kesimpulan
1. Sterilisasi merupakan suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup
dan spora-sporanya.
2. Terdapat 5 metode umum sterilisasi yaitu sterilisasi uap, sterilisasi panas kering,
sterilisasi dengan penyaringan, sterilisasi gas dan sterilisasi dengan radiasi.
3. Metode sterilisasi uap digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan
lainnya yang tahan terhadap temperature yang digunakan dan tahan terhadap penembusan
uap air.
4. Larutan Nutrien Agar setelah disterilisasi memadat seperti agar dan berwarna kuning.
5. Larutan Nutrien Broth setelah disterilisasi berwarna kuning bening yang menandakan
larutan tidak terkontaminasi dan sudah steril.
6. Prinsip penggunaan autoclave didasarkan pada mikroorganisme, termasuk spora yang
tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada tempratur sedikit di atas titik
didih air.
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-2-media-pertumbuhan.html
http://www.scribd.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar