TINCION GRAM

I. OBJETIVOS

 Aprender el proceso de la tinción Gram.

 Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización
e identificación de las bacterias.
 Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas
de acuerdo a la tinción de Gram.

II. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales:  Vasos
 Asa de col  Mechero bunsen
 Lamina portaobjetos  Aceite de cedro
 Microscopio óptico
 Algodón Muestras:
 Alcohol 96%  Yogurt probiotico Gloria
 Safranina  Yogurt probiotico Laive
 Lugol  Salmuera de aceitunas
 Cristal violeta  Levadura
 Agua destilada  Leche evaporada

III. FUNDAMENTO TEORICO

La tinción diferencial requiere más de un tipo de

colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos
de células bacterianas. Una tinción diferencial
típicamente consiste de tres pasos principales:
primero un colorante primario, el cual se utiliza para
teñir a todas las células en la tinción; enseguida un
paso de decoloración, el cual remueve el colorante
solo de ciertos tipos de células y finalmente un
colorante de contraste, el cual tiñe las células recién
decoloradas pero no tiene efecto sobre las células
que aún retienen el colorante primario.
La tinción propuesta por el médico danés Christian
Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales
más utilizadas en bacteriología, que clasifica los
cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram
positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción
de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano

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que se encuentra en las paredes celulares de estas
bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas
capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen
moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con
el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de
tinción. Un complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-
ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared
celular de las células Gram positivas retiene estos
compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram
positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de
la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol también
disuelve mucho de la capa exterior de lipopolisacáridos de la pared celular de la pared
Gram negativa, lo cual acelera la remoción del colorante primario cristal violeta de
estas células.
Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas
siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo
de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán
del color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del
color de la safranina que es el colorante de contraste.

Clásicamente los reactivos utilizados para la

realización de la tinción de Gram han sido el
cristal violeta como colorante inicial, la solución
de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o
acetona para la decoloración y la safranina o
fucsina básica como contracolorante.

Existen una serie de puntos con respecto a un

buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta
antes de su realización, a saber:

 Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la

solución de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso.
 La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o
fucsina básica es de 1 año y la de la solución de Lugol de 6 meses, todas ellas
conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad) a
temperatura ambiente.
 Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con
cepas de colección de E.coli, S.aureus o S.epidermidis para comprobar los
resultados esperados.
 Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación
microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado
gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados,

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 sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los
anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram.
 Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una
tinción pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes
consiguen ser recuperados en el cultivo.
 Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal
especializado, para confirmación de coincidencias y posibles discrepancias.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1) Fijar un frotis: Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y

esperar que enfríe un poco. Tomar el asa y
tomar un poco de muestra. Una vez obtenida
una pequeña cantidad de la muestra (con el
asa), hacer que ésta tenga contacto con una
lámina portaobjetos, la cual servirá para
depositar la muestra contenida en el asa. Con
el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina
portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos
mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal
forma que al terminar la extensión, tengamos
como producto una espiral en la parte media de la
lámina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse
con la llama de un mechero para fijar la muestra,
teniendo en cuenta que el calor no debe ser
directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el
calor excesivo puede cambiar la morfología celular
de las bacterias a observar. El calor deseable es
aquél en el que el portaobjetos sea apenas
demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

2) Tinción: Con cristal violeta, violeta de genciana, azul de

metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad
suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para
lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por
1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar
a una temperatura ambiente de 25 °C.

3) Enjuague: Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la

lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para
realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro
de agua NO debe caer directamente sobre la muestra,
ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que
no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro

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 delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el
enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada
hacia abajo... La solución de cristal violeta, se recomienda sea al 1%.

4) Mordiente: Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o

lugol durante 3 minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forma
compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias.

5) Decoloración: Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se

decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que
ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del
decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr
que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más
líquido azul.

6) Lavado y secado: Lavar con agua para quitar los

residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al
aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la
forma anteriormente descrita.

7) Tinción de contraste: Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir

nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por
ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

8) Nuevo enjuague: Pasado el minuto correspondiente, se

procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua
sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

9) De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación

microscópica con el objetivo de inmersión.

V. RESULTADOS

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 Muestra: leche evaporada gloria

Bacteria: streptococcus lactis, cocos y diplococos

Aumento: 100×

Descripción: cocos solos en pares y en cadenas

Gram: positivos

Muestra: levadura para pan

Bacteria: Sccharomyces cerevisiae

Aumento: 100×

Descripción: forma esférica de gran tamaño

Gram: positivos

Muestra: salmuera de aceitunas

Bacteria: cocos, diplococos y bacilos

Aumento: 100×

Descripción: cocos individuales, en pares y bacilos alargados

Gram: positivos, negativos (bacilos)

Muestra: yogurt probiotico laive

Nombre: bacilos, cocos

Aumento: 100×

Descripción: bacilos en cadenas largas, cocos de forma esférica

Gram: positivos (cloración roja)

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 Muestra: yogurt probiotico gloria

Bacteria: cocos, diplococos, estreptococos

Aumento: 100×

Descripción: cocos solos, en pares y en cadena

Gram: positivos
VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 En los resultados obtenidos se pudo apreciar ciertas

manchas azules que son restos de colorante que no permitían una buena
observación de las bacterias presentes.
 Habían bacterias Gram positivas que tenían una coloración
roja, esto se debió al tiempo que poseía la muestra, que era muy avanzado.
 Se observó que las levaduras poseen la misma forma que los cocos, pero
para diferenciarlos las levaduras tienen un mayor tamaño a diferencia de los
cocos.
 los yogures probioticos, como se cuenta, si contienen cultivos de bacterias
vivos como se demostró en los bacilos (lactobacilos) de largas cadenas.
 Se esperaba que la salmuera de aceitunas contuviera levaduras en la
superficie, pero no se formaron, en su lugar se pudo hallar bacterias Gram
negativas que bien pueden ser fuente de enfermedades y gotas de aceite.
 La mayoría presentó bacterias Gram positivas que comúnmente se usan para
la elaboración de alimentos, como yogurt, queso y pan.

VII. CONCLUSIONES

 La tinción Gram permite clasificar a las bacterias en Gram positivas y Gram

negativas, así como apreciar su morfología.
 Lo que permite la coloración de las bacterias (a rojo o azul) es la cantidad de
péptidoglucano en la pared celular de las bacterias que bien pueden retener el
colorante azul (cristal violeta) o el colorante rojo (safranina).
 Lo que nos permita obtener una mejor visión de la muestra bajo el microscopio
es realizar correctamente una buena fijación de muestra y decoloración.
 En el campo de la industria alimentaria se trabaja con esta tinción para
determinar si los alimentos elaborados contienen algún microorganismo
patógeno.

VIII. BIBLIOGRAFIA

 http://www.a14.san.gva.es/laboratorio/Web/gram.htm

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 http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClasePr
ocariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%203%20Tinci%C3%B3n%20de%20Gram.pdf
 es.wikipedia.org/wiki/Tinción_de_Gram

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