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OBTENCION E IDENTIFICACION DE SACHAROYCES CEREVISAE

I. INTRODUCCIÓN

Desde la antigüedad diferentes civilizaciones de todo el mundo han utilizado las


levaduras para la preparación de panes y bebidas alcohólicas sin saberlo, a
mediados del siglo XIX gracias a Louis Pasteur se probó que la fermentación
alcohólica era hecha por levaduras y no por un catalizador químico. Entre todos los
microorganismos, las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae son las
protagonistas principales, influyendo significativamente en las características
organolépticas del producto final. La cepa de levadura involucrada en la
fermentación y su actividad metabólica específica contribuyen de manera
importante en el aroma, sabor y color del vino. El mosto de uva se caracteriza por
tener una elevada concentración de azúcares fermentables (entre 160 y 240 g/L),
repartidos entre glucosa y fructosa en cantidades equivalentes. La fermentación
alcohólica de las levaduras se inicia con la ruta conocida como gllicolisis, que
conduce a la obtención de dos moléculas de piruvato por cada molécula de azúcar
metabolizada. Posteriormente el piruvato se descarboxila y conduce a la producción
de etanol y CO2.1

La actividad metabólica de los diferentes géneros y especies de levaduras


presentes en la superficie de las uvas en el viñedo, y capaces de resistir las
condiciones de vinificación, influencian la calidad sensorial del vino obtenido. Siendo
estas las especies Hanseniaspora uvarum (y su forma anamorfa Kloeckera
apiculata) de 50-75% de la población total de levaduras aisladas, y en menor
población se han encontrado presentes los géneros Candida, Cryptococcus,
Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia y Rhodotorula.2

Su crecimiento se limita generalmente a los dos o tres primeros días de


fermentación, después de lo cual mueren. Posteriormente, la fermentación con más
fuerza y más especies tolerantes al etanol de Saccharomyces se hacen cargo de la
fermentación antes de la maduración, las uvas están casi libre de S. cerevisiae(~
0,05%), mientras que el 25% de las uvas maduras albergan tales levaduras. Por lo
que esto sugiere que S. cerevisiae no se encuentre en el aire, y que requiere un
vector para moverse como abejas y avispas. 3

Los estudios con S. cerevisae y su rol en la fermentación han sido la caracterización


por métodos moleculares, en relación a sus propiedades enzimáticas, modificación
genética para producir otras enzimas, detección rápida de los cambios en la
población durante los procesos, la detección de otras levaduras que actúan
contra S. cerevisae o en sinergia con ella para mejorar el aroma, evaluación de
factores nutricionales que afectan su comportamiento o de fracciones celulares que
protegen el proceso, etc.4

Tiene gran capacidad de crecer en el zumo de uva, que se caracteriza por un alto
contenido de azúcares y bajo contenido de sustancias de nitrógeno. La especie
produce altas cantidades de etanol a la vez que consume el contenido de azúcares
y baja el pH que inhiben el crecimiento de cepas no Saccharomyces.5
II. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

OBJETIVOS ESPECIFÍCOS:
III. METODOLOGÍA
3.1. MATERIALES:
 Uvas frescas 250g
 Medios de cultivo AEM
 Medio de cultivo ANDEL
 Medio de cultivo PDA
 Medio de cultivo con agar YPD
 Medio de cultivo con caldo YPD
 Medio de cultivo con galactosa 1%
 Medio de cultivo con glucosa 1%,
 Medio de cultivo con maltosa 1%
 Medio de cultivo con lactosa 1%
 Medio de cultivo con sacarosa 1%
 Medio de cultivo con rafinosa 1%;
 Metabisulfito de potasio
 Papel craft
 Matraz de 250 mL
 Asas de siembra.
 Autoclave
 Estufa
 Microscopio
3.2. PROCEDIMIENTO:
1° Se seleccionaron las uvas frescas y maduras, se estrujaron y se colocó 105 ml
de mosto y 35 mL del hollejo (3:1) en un matraz de 250 mL, dejando el resto del
volumen del matraz libre. Se agregó 15,75 mg de metabisulfito de potasio y se tapó
el matraz, con el cuidado que no se cierre herméticamente. Se dejó fermentando a
30 °C por 3 días. Luego se liberó la espuma, se agitó suavemente y se realizó la
siembra por superficie en 3 medios específicos, medio AEM, ANDEL y PDA, estos
se incubaron a 30 °C por 4 días.
2° Terminado el período de incubación se procedió a la descripción de las colonias
formadas en los 3 medios empleados: AEM, ANDEL y PDA. Se realizó una macro
identificación, que consistió en la descripción de la elevación, forma, consistencia,
color y olor de las colonias y una micro identificación la cual consistió en la
observación del borde y forma de las colonias en el microscopio, mediante la técnica
de coloración Gram.
3° Se aisló una de las colonias y se sembró por superficie en un medio con agar
YPD, se dejó incubar a 30 °C por 3 días. De la misma colonia se sembró en un
medio líquido con caldo YPD a 30°C por 2 días. Se realizó la prueba de
fermentación de carbohidratos, de la misma colonia se sembró en medios de
cultivos con purpura de bromocresol y el carbohidrato, que fueron para cada tubo:
galactosa 1%, glucosa 1%, maltosa 1%, lactosa 1%, sacarosa 1% y rafinosa 1%;
cada tubo contenía un tubo de Durham.

Fundamento: La microvinificación, es la elaboración del vino en pequeñas


cantidades. La transformación del mosto de uva en vino es un proceso complejo en
el que las levaduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae, juegan el papel
más destacado. Durante la vinificación, las levaduras utilizan los azúcares glucosa,
fructosa y otros componentes del mosto para su crecimiento. Los azúcares son
transformados principalmente en etanol y anhídrido carbónico y, en menor medida,
en otros compuestos que son responsables de la composición química y las
cualidades sensoriales del vino; estos compuestos reciben el nombre de productos
secundarios la incorporación del metabisulfito de potasio tiene como finalidad
proteger al mosto de la oxidación del oxígeno del aire, también actúa como
antimicrobiano, pues a través de la eliminación de ciertos números de
microorganismos no deseables, permite una selección eficaz del medio fermentativo
llevando a un mejor desarrollo de la fermentación alcohólica posterior. el
metabisulfito también permite decantar los materiales en suspensión, lo que
conduce a una clarificación natural. (6)
Fundamento: Los medios de cultivo son fuentes naturales o sintéticas, que
semejan el nicho ecológico en que se desarrollan los microorganismos. El Agar
extracto de Malta (MEA) presenta una composición comercial de maltosa 12,75 g;
dextrosa 2,75 g; glicerol 2,35 g; peptona 0,78 g y agar agar 15 g. Se utiliza para el
aislamiento, cultivo y enumeración de levaduras para alimentos. Provee el carbono,
proteínas y nutrientes requeridos para el crecimiento de microorganismos. Es
particularmente adecuado para levaduras y hongos ya que contienen una alta
concentración de maltosa y otros sácaridos como fuentes de energía. Dextrina y
Glicerina son la fuente de carbono, y la peptona es una fuente de nitrógeno. El pH
ácido es óptimo para el crecimiento de levaduras y hongos mientras restringe el
crecimiento bacteriano. El Agar Papa Dextrosa es un medio de propósito general
para levaduras y mohos que puede ser suplementado con ácidos o antibióticos para
inhibir el crecimiento bacteriano. Está compuesto por Infusión de Papa deshidratada
y Dextrosa que fomentan el crecimiento exuberante de los hongos. El agar es
adicionado como agente solidificante. Muchos procedimientos estándares usan una
cantidad específica de ácido tartárico estéril (10%) para reducir el pH de este medio
a 3,5 0.1, y así inhibir el crecimiento bacteriano. Las levaduras crecen como
colonias desde un color crema a un color blanco, por ejemplo Saccharomyces
cerevisiae se observan como colonias cremas y lisas. Los mohos crecen como
colonias filamentosas de variados colores. (7, 8)
Fundamento: El agar YPD y el caldo YPD contiene peptona como fuente de
carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales. El extracto de levadura suministra
vitaminas del complejo B que estimulan el crecimiento bacteriano. La dextrosa es la
fuente de carbohidratos. El agar YDP contiene agar como agente solidificante. Las
levaduras crecen bien en un medio mínimo que contiene solo dextrosa y sales. La
adición de proteínas y extractos de células de levadura hidrolizados permite un
crecimiento más rápido, de modo que durante el crecimiento exponencial o en fase
logarítmica, las células se dividen cada 90 minutos. (9, 10)

Fundamento: El medio base para la fermentación de carbohidratos está compuesto


de extracto de carne, peptona, cloruro de sodio, y púrpura de bromocresol como
indicador, ya que la mayoría de los productos del metabolismo son ácidos orgánicos
y con el indicador se da un cambio de color a amarillo. A este medio base,
esterilizado, se le añade la solución del carbohidrato para obtener una
concentración final entre 0,5 a 1% del carbohidrato. El tubo contiene un pequeño
tubo invertido y lleno del medio (tubo de fermentación o tubo de Durham). Una
fermentación positiva por formación de ácido estará indicada por viraje del indicador
del púrpura al amarillo. En caso de que se produzca gas, éste se acumulará en el
tubo de Durham. La observación de un cambio de color que denomina acidez está
influenciada por dos factores: el indicador del pH utilizado y las propiedades buffer
del medio. (11)

4. RESULTADOS
Fermentación de carbohidratos
5. DISCUSIÓN
6. CONCLUSIONES
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Escalante M., Ibarra J. Los cultivos mixtos y las fermentaciones


alcohólicas. BioTecnología 2007; 11 (3).
2. Carrau F M: Levaduras nativas para enología de mínima intervención.
Biodiversidad, selección y caracterización. Agrociencia 2005; 9 (1-2): 387-
399.
3. Vilanova M, Sieiro C. Contribution by Saccharomyces cerevisiae yeast to
fermentative Xavour compounds in wines from cv. Albariño. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology 2006; 33: 929-933.
4. Rojas R, Reyes E. Aseguramiento de la Calidad y Biotecnología en la
Industria del Vino.Ciencia & Trabajo 2005; 7 (17): 97-103.
5. Cocolin L, Pepe V, Comitini F, Comi G, Ciani M: Enological and genetic traits
ofSaccharomyces cerevisiae isolated from former and modern
wineries. FEMS Yeast Research 2004; 5: 37-245
6. Miño Valdés JE. Fundamentos para elaborar vino blanco común en un
desarrollo tecnológico. 1 era edición. Posadas: EDUNAM-Editorial
Universitaria de la Universidad Nacional de Misiones; 2012.
7. Narrea CM., Malpartida ZJ. Evaluación de medios de cultivo en la producción
de conidias y crecimiento diametral de cuatro cepas del hongo
entomopatógeno Beauveria brongniartii (Saccardo) Petch. Rev. perú.
Entomol, 2006. 45:145 -147.
8. DIBICO. Agar de dextrosa y papa. Medio de cultivo. Bacteriología General.
Probiotek. [Internet]. [Citado 14 de abril de 2018]. Disponible en:
http://www.probiotek.com/wp-content/uploads/2014/01/1059-E_AGAR-
DEXTROSA-Y-PAPA.pdf
9. Gonzáles C. Caracterización fenotípica de levaduras nativas durante el
proceso de fermentación de 11 variedades de uvas procedentes de
Cananea, Sonora. XVI Congreso Nacional de Biotecnología y bioingeniería.
Guadalajara; 2015.
10. DIFCO. Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) Agar and Yeast Extract-
Peptone-Dextrose (YPD) Broth. 2da ed. [citado 14 de abril de 2018].
Disponible en:
https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/242820.pdf
11. MacFaddin. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica.3era ed. Buenos Aires: Ed. Médica Panamericana; 2003.