Acetaminofenul (sau paracetamolul, PAR) și aspirina (acidul acetilsalicilic, ASA) se numără

printre produsele farmaceutice care se utilizează cel mai frecvent ca bază de prescripție
medicală și se combină frecvent în preparate fără prescripție medicală. În tratamentul clinic,
aceștia acționează prin același mecanism, inhibând sinteza prostaglandinelor și prezintă
diferite niveluri analgezice, antipiretice, antiinflamatorii și antiplachetare. PAR este, de
asemenea, unul dintre medicamentele care se eliberează cel mai frecvent la supradoze. Ca
intermediar sintetic sau produs de degradare hidrolitică primară a PAR, 4-aminofenolul (AP,
fig.1) a fost detectat de obicei în prepararea farmaceutică a PAR. Datorită nefrotoxicității
semnificative, efectului teratogen și potențial carcinogenic [1], conținutul maxim de 4-AP în
medicamente este limitat de Farmacopeea Europeană și Statele Unite [2, 3]. PAR este
metabolizat în principal în ficat în produse nontoxice când se utilizează dozele recomandate.
Cu toate acestea, hepatotoxicitatea și nefrotoxicitatea supradozajului PAR sunt principala
cauză a insuficienței hepatice acute în Occident și reprezintă cea mai mare morbiditate și
mortalitate în cazurile de otrăvire cu medicamente

Din punct de vedere clinic, ASA și PAR sunt formulate în general în medicamente analgezice
în raport de 3: 2. Această combinație este utilizată pe scară largă pentru tratarea febrei și
durerii [5]. Studiile recente au arătat că aspirina poate bloca hepatotoxicitatea indusă de PAR
[6], iar co-formularea ASA cu PAR poate reduce insuficiența hepatică indusă de PAR. În
ficat, ASA se metabolizează rapid și se hidrolizează pentru a produce acid salicilic (salicilat,
SA) și alți compuși, cum ar fi acidul gentisic (GA), acidul saliciluric (SUA) și acidul 2,3-
dihidroxibenzoic (2,3- (Figura 1). Concentrația serică a SA este un indice cheie al intoxicației
cu supradozaj cu aspirină [4], care este clinic
caracterizată prin tetanie și acidoză. Unii cercetători au constatat, de asemenea, că utilizarea
excesivă a ASA sau PAR a fost legată de afectarea rinichiului [7]. Monitorizarea
concentrațiilor serice ale acestor medicamente de coformulare și a produselor lor de degradare
și metabolice este esențială pentru înțelegerea farmacodinamicii și a toxicologiei acestora,
precum și a posibilelor interacțiuni. O metodă analitică sensibilă și selectivă este necesară în
mod urgent datorită complexității matricelor biologice și a concentrațiilor scăzute ale acestor
compuși
Deși unele dintre medicamentele nesteroidiene (PAR, AP, ASA) au fost analizate individual
prin cromatografie în fază gazoasă (GC) [8-10], detecție electrochimică [11-13],
cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) [14-17] LC-MS [18], foarte puține
metode analitice s-au concentrat pe determinarea simultană a acestor coformulări și a
produselor lor de degradare sau metabolice [4, 5]. În ceea ce privește cele mai utilizate
metode de separare prin HPLC, schimbarea ionilor sau modurile de interacțiune hidrofilă sunt
mai preferate decât modul de infuzie de rutină aplicat în mod curent, datorită polarității relativ
ridicate a acestor compuși [19].
În ultimele decenii, tehnicile de microseparare pe bază de capilare au fost introduse ca o
metodă alternativă de separare în analiza farmaceutică [20-22], datorită eficienței lor ridicate,
vitezei și costului redus. Cu toate acestea, există încă o dificultate în separarea eficientă a
medicamentelor acide prin electroforeză capilară (CE), deoarece direcția fluxului
electroosmotic este opusă direcției electroforetice a analitilor acidi. Ca urmare, timpul de
analiză ar fi prea lung sau chiar nu poate fi detectat. Distins de CE, cromatografia lichidă
capilară este o altă tehnică de microseparare bazată pe miniaturizarea HPLC convențional.
Prin urmare, selectivitatea și timpul de analiză a separării cromatografiei lichide capilare
(cLC) pot fi ușor îmbunătățite prin modificarea grupului funcțional al coloanei și fazei mobile.
Unele formate noi de faze staționare, cum ar fi coloana monolitară care și-au demonstrat deja
capacitatea excelentă de separare în LC [23, 24], oferă un mare potențial pentru aplicarea la
cLC. Sensibilitatea scăzută la detectare, care a provenit din foarte mult
volumul mic de injecție va crește cu siguranță prin cuplarea cLC la detectoarele sensibile,
cum ar fi detectoarele electrochimice. Fiind una dintre cele mai cunoscute metode de detecție
electrochimică, detecția amperometrică se dovedește a fi extrem de sensibilă, ieftină, selectivă
și rapidă. Se poate anticipa că cuplarea cLC la detecția amperometrică oferă o abordare ideală
pentru analiza conținutului scăzut de analiți în matricele biologice
În această lucrare am propus combinarea cLC cu detecție amperometrică și utilizarea fazei
staționare monolitice de interacțiune hidrofilă / schimb puternic de anioni (SAX), pentru
rezolvarea problemei de separare și detectare a produselor farmaceutice și metaboliților polari
/ acizi, inclusiv acetaminofen, p-aminofenol, acid salicilic, GA, SUA și 2,3-DBA. Adecvarea
acestei metode pentru evaluarea acestor medicamente în probele biologice a fost demonstrată
prin analiza serului uman spicat

Acetaminofenul, acidul salicilic, GA, SUA, standardul 2,3-DBA și p-aminofenol au fost

furnizate de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). S-au preparat soluții stoc standard de toți
analiții în acetonitril (ACN) la o concentrație de 1 mg / ml și au fost păstrate la 41 ° C.
Soluțiile de lucru la diferite concentrații s-au preparat săptămânal prin diluarea
corespunzătoare a alicoturilor soluției stoc în acetonitril. 3-Trimetoxisilil propilmetacrilat (g-
MAPS), triacetat de pentaeritritol (PETA), metilsulfat de 2- (acriloiloxi) etil trimetilamoniu
(AETA) și N-metil- au fost obținute de la Acros (NJ, USA). 2,20-diciano-2,20-azopropan
(AIBN) a fost obținut de la cea de-a patra fabrică de reactivi chimici (Shanghai, China).
HPLC-ul ACGN a fost achiziționat de la Sinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China).
Tris (1,1,1-tris (hidroximetil) aminometan) a fost achiziționat de la NoVoN. Celelalte
substanțe chimice folosite au fost de calitate analitică. Apoi apa deionizată foarte pură a fost
preparată utilizând un sistem de puricație Millipore Milli-Q (Milford, MA, USA). Toate
soluțiile s-au filtrat printr-o membrană de 0,22 mm și s-au degazat într-o baie ultrasonică timp
de 30 de minute înainte de utilizare.

Un sistem cLC (Trisep-2100, Unimicro Technologies, Pleasanton, CA, SUA) cuplat la

detectarea amperometrică a coloanei finale a fost utilizat în experimente. Detaliile acestui
sistem au fost descrise în lucrările noastre anterioare [26]. Se compune dintr-o pompă HPLC,
o parte de injectare, o coloană de separare și partea de detectare. Probele au fost introduse cu
seringi de microliter (Shanghai GaoGe Industrial and Trading) la bucla de probă internă de 2
mL din șase porturi

injector, și apoi au fost transportate la supapa cu patru porturi (splitter) prin faza mobilă prin
intermediul pompei. După despicarea în supapa cu patru porturi, debitul a fost descărcat de la
a treia ieșire a separatorului și a intrat într-o coloană de separare sub presiune constantă,
controlată de un regulator de presiune de spate, al cărui capăt a fost conectat la al doilea
orificiu al separatorului și celălalt capăt a fost introdus în flaconul de solvent pentru deșeuri
prin tubul PEEK. Ieșirea coloanei de separare a fost introdusă în celula electrochimică prin
suportul electrodului și legată la pământ. A fost utilizată o celulă electrochimică prealiniată,
compusă din trei electrozi (electrod de lucru cu diametru de 300 mm, electrod auxiliar platină
și electrod de referință Ag / AgCl), în combinație cu un detector amperometric potențial de
LC-4C (BAS, West Lafayette , ÎN SUA). Colectarea datelor a fost efectuată utilizând o stație
de lucru cromatografică (Qianpu Software, Shanghai, China). Coloana de separare a fost o
coloană monolitată poli (PETA-co-DMMSA-co-AETA) (50mm id 375mm od cu o lungime
de 28 cm). Experimentele voltametrice ciclice au fost efectuate pe o stație de lucru
electrochimică CHI 660 (Shanghai CH Instruments, China) constând din trei electrozi identici
cu cei utilizați în detecția amperometrică. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura
camerei (251 ° C).

Înainte de utilizare, capilarele (50 mm id 375 mm od, achiziționate de la Yongnian Optic

Fiber Plant (Hebei, China)) au fost tratate cu g-MAPS folosind o metodă descrisă în altă parte
[27]. Soluțiile de polimerizare cu greutatea de 3,0 g fiecare s-au preparat din monomeri
(49,5% în greutate PETA, 49,5% în greutate DMMSA și 1,0% în greutate AETA) și solvenți
porogeni în raporturi de monomeri / solvenți 20:80 g / g [28]. Amestecul de monomeri a fost
dizolvat în solvenții binari porogeni conținând 50% în greutate ciclohexanol și 50% în
greutate etilenglicol. AIBN (6,0 mg, 1,0% în greutate față de monomeri) a fost adăugat la
soluție ca inițiator. Soluția a fost apoi sonicată pentru a obține o soluție limpede și a fost
purjată cu azot timp de 10 minute și apoi a fost introdusă într-o capilară de 55 cm pre-tratată
pentru o lungime de 35 cm. Capilarul a fost etanșat la ambele capete și a fost scufundat într-o
baie de apă la 60 ° C timp de 20 ore. Coloana capilară monolitică rezultată a fost spălată cu
metanol timp de 2 ore folosind o pompă de microvolum pentru a îndepărta porogenii și
monomerii nereacționați. Înainte de prima utilizare în cLC, coloana monolit capilar a fost
condiționată de metanol, amestec de metanol și apă fi ltrate și fază mobilă timp de 1 h.

out utilizând sistemul cLC și s-a utilizat un mod de eluare izocratic. Fazele mobile au fost
preparate prin amestecarea unui volum adecvat de tampon ACN și Tris (20 mmol / L, pH 8,5)
și au fost livrate de pompă la o rată constantă de flux de 0,05 ml / min. Soluțiile standard de
analiți au fost injectate într-o supapă cu șase porturi și apoi au fost livrate în coloana de
separare prin fază mobilă după despicare. O presiune suplimentară (500 psi, 3,1 MPa) a fost
aplicată la intrarea în coloană. Potențialul de lucru al electrodului cu disc de carbon a fost
stabilit la 10,9 V (față de Ag / AgCl).

Eșantioanele serice au fost obținute de la pacienți cu vârste cuprinse între 74-81 ani cu boală
cardiacă coronariană (furnizată de Departamentul de Laborator Clinic, Spitalul General
Fuzhou). O sută de microlitri de ser s-au amestecat cu 10 ml de soluție stoc de 1 mg / ml și s-
au amestecat bine cu un amestecător turboreact cu miniatură. Înainte de analiză, proteinele au
fost precipitate prin adăugarea a 200 ml de ACN și 30 s de turburare. Probele au fost apoi
centrifugate la aproximativ 13 000 rpm timp de 5 minute la temperatura camerei. În final,
supernatanții au fost colectați, diluați cu ACN și apoi au fost analizați prin cLC cu detecție
amperometrică

3.1.1 Optimizarea detecției electrochimice

Testele de voltammetrie ciclică au arătat că toți analiții selectați ar putea fi oxidați
electrochimic în intervalul potențial de 10,08 până la 10,92 V (comparativ cu Ag / AgCl)
(vezi informația de susținere Fig. S1), care se caracterizează prin prezența grupărilor fenolice.
Se pare că cLC cu detecție amperometrică ar trebui să fie o tehnică fezabilă pentru analiza
directă a acestor medicamente. De asemenea, am înregistrat voltamogramele hidrodinamice
de la 10,7 la 11,0 V pentru a investiga efectul potențialului de detecție asupra curentului de
vârf (Informații de susținere Fig. 2). Aproape toate analizele au o magnitudine maximă a
semnalului la un potențial de 10,85 V, cu excepția SA, care atinge răspunsul său mai mare la
un potențial de 11,0 V. Între timp, zgomotul de bază a crescut treptat odată cu creșterea
potențialului de detecție și va interfera cu îmbunătățirea raportului semnal-zgomot. Pentru a
atinge o sensibilitate de detecție mai ridicată pentru toți analiții, a fost folosit ca potențial de
lucru 10,9 V.

3.1.2 Efectul conținutului modificatorului organic

ACN este de obicei selectat ca modificator organic în HPLC pentru vâscozitatea sa scăzută.
Pentru a examina efectul conținutului de ACN asupra selectivității de separare și reținerea
analiților selectați, conținutul ACN în faza mobilă (20 mmol / L, pH 8,5) a fost variat de la 80
la 88% v / v
(Figura 2). S-a constatat că factorii de retenție (k) ai metaboliților aspirinei înalți polari au
crescut cu creșterea conținutului de ACN în faza mobilă, ceea ce a demonstrat un mecanism
tipic de reținere a interacțiunii hidrofilice între substanțele dizolvate și faza staționară, în timp
ce nu a existat un efect evident al ACN conținutul pe k de analiți polari moderați, AP și PAR.
Când concentrația de ACN a crescut, polaritatea fazei mobile a scăzut, iar interacțiunile
hidrofilice și SAX dintre analizele polar și faza staționară au fost întărite; prin urmare,
ameliorarea atât a retenției, cât și a separării acestor analiti. Cu toate acestea, timpul de
analiză mai lung a fost de asemenea necesar în cazul utilizării unui conținut mai mare de
ACN. Pentru a obține cel mai bun compromis în timpul rezoluției și analizei, a fost selectat
84% v / v de ACN în faza mobilă.

3.1.3 Efectele concentrației și pH-ului tamponului

Trei tipuri de soluție tampon, acidul N-tris (hidroximetil) metil-3-aminopropan sulfonic

(robineți), borat și Tris, au fost utilizați ca tampoane în faza mobilă. Rezultatele au arătat că
tamponul Tris poate genera curent de separare scăzut datorită conductivității scăzute și, prin
urmare, a fost ales ca tampon în faza mobilă pentru separare. Efectul concentrației de tampon
Tris asupra separării a fost studiat în intervalul de la 5 la 40 mmol / L. După cum se arată în
figura 3, k și separarea metaboliților aspirinei foarte polari au crescut cu creșterea
concentrației de tampon, în special când concentrația tamponului este mai mică de 20 mmol /
l, în timp ce nu a existat o schimbare evidentă pentru reținerea AP mai neutru și PAR. În acest
caz, interacțiunea electrostatică sau legătura de hidrogen dintre ionul de sare și moleculele de
apă din solvenți a fost în creștere cu creșterea concentrației tampon; prin urmare, capacitatea
de eluare a dispozitivului mobil
retenția a fost crescută [29]. Aceasta a indicat că reținerea compușilor a fost determinată în
principal de un mecanism tipic de interacțiune hidrofilă (HI). Între timp, când concentrația de
Tris a devenit mai mare, a fost observat un curent de fond mai înalt cauzat de încălzirea Joule;
20 mmol / l de Tris a fost ales ca tampon în faza mobilă. Efectul pH-ului asupra retenției
analiților selectați a fost, de asemenea, investigat în intervalul pH-ului 3,0-9,0. Rezultatul a
arătat că timpul de retenție al substanțelor dizolvate încărcate negativ a crescut cu creșterea
pH-ului de 3,0-7,5 datorită gradului crescut de ionizare a substanțelor dizolvate acide, ceea ce
indică un mecanism al modului mixt de schimb de anioni și interacțiune hidrofilă. Creșterea
suplimentară a pH-ului va crește concentrația de ioni de hidroxil în tampon, care poate
concura cu substanțele dizolvate acide și poate slăbi interacțiunea lor SAX cu faza staționară
și
prin urmare, duce la o ușoară scădere a k. Între timp, capacitatea de separare (reprezentată de
rezoluția dintre SA și SUA) se îmbunătățea. Retenția AP și PAR nu a fost afectată în mod
fundamental în acest caz (figura 4). Cu toate acestea, o scădere evidentă a curenților de vârf a
fost observată când pH-ul a atins 9,0. A fost selectat un pH de 8,5 ca pH optim pentru analiză.
La pH 8,5, SA, SUA, 2,3-DBA și GA au fost încărcate negativ, deoarece pKas lor sunt 2,98,
3,54, 2,94 și, respectiv, 2,95. Ei au fost eluați mult în spatele timpului liber, indicând o
interacțiune puternică a acestor substanțe dizolvate polar cu încărcătură negativă cu grupările
amino cuaternare încărcate pe monolit poli (PETAco-DMMSA-co-AETA). Deoarece PAR
(pKa 9,51)
și AP (pKa1 5,48, pKa2 10,46) există în primul rând ca molecule neutre, a căror interacțiune
cu coloana a fost limitată într-o anumită măsură, au eluat îndeaproape în timpul vidului
3.1.4 Efectul presiunii suplimentare

A fost introdusă presiune suplimentară în acest sistem pentru a crește viteza fazei mobile,
pentru a evita formarea bulei și pentru a îmbunătăți repetabilitatea. Efectul de a varia
presiunea suplimentară asupra separării analitilor a fost studiată în intervalul de la 1,5 la 7,1
MPa prin modificarea regulatorului de contrapresiune de la 250 la 1000 psi. Odată cu
creșterea presiunii suplimentare, timpul de analiză pentru toate substanțele dizolvate a fost
dramatic redus la un sfert, adică de la 18 la 4 minute, iar curenții de vârf au fost mult
îmbunătățiți. Cu toate acestea, o presiune suplimentară prea mare va face ca separarea să fie
mai gravă. Pentru a obține o rezoluție mai bună și un timp de analiză mai scurt, 3.1 MPa a fost
selectată ca presiune suplimentară.
Pentru analiza cLC-AD a acetaminofenului, p-aminofenolului și a patru metaboliți ai
aspirinei, o coloană monolit poli (PETA-co-DMMSA-coAETA) ca fază staționară, o fază
mobilă constând din ACN 84% v / v și 16% / v Tampon Tris-HCI (20 mmol / l, pH 8,5) cu
viteză de curgere 0,05 ml / min, presiune suplimentară de 3,1 MPa (500 psi) și potențial de
lucru 10,9 V (față de Ag / AgCl) considerate ca fiind condițiile optime de separare și
detectare. Cromatograma cLC în condiții optime este prezentată în figura 5. Șase analiți pot fi
separați în timp de 8 minute, ceea ce este ușor mai rapid decât utilizarea HPLC [4] pentru
PAR și SA sau CE [30] pentru GA, SA și SUA. Datorită utilizării modului HI / SAX de
monolit și a unui detector AD foarte selectiv, care sunt potrivite pentru analiții polari
electroactivi, metoda propusă se îndepărtează de procedurile de curățare a probei
consumatoare de timp și de eluția cu gradient care sunt întotdeauna necesare prin HPLC- UV
sau MS [18] în testul matricei biologice complexe, reducând astfel foarte mult timpul total de
analiză. În plus, eficacitatea coloanelor variază de la

Au fost obținute 33 000 până la 53 000 plăci / m pentru toți analiții. În comparație cu
rezultatele obținute pe coloanele capilare cu schimb de anioni [31,32], este destul de evident
că eficacitatea de separare și forma de vârf a analitului anionic sunt mult îmbunătățite prin
utilizarea coloanei monolitice HI / SAX.

Validarea metodelor de analiză prin cCC cuplată cu detecția amperometrică folosind coloana
monolită a fost examinată în termeni de liniaritate, sensibilitate și repetabilitate în condiții
optime. Calibrarea externă a fost utilizată în acest experiment. Fiecare punct al graficului de
calibrare corespunde valorii medii a trei măsurători independente ale ariei vârfului. Valorile
analitice ale meritului sunt prezentate în Tabelul 1. În condițiile optimizate, s-au determinat
șase compuși până la 10-50 ng / ml (LOD, S / N53), care au fost mai mici decât cei ai HPLC-
UV SA au fost 36 și 107 ng / ml) [4] și CELIF (LOD din SA, SUA și GA au fost 160, 140 și
120 ng / ml) [30]. Metoda cLC-AD propusă a oferit o gamă liniară de concentrație largă de
trei ordine de mărime pentru fiecare analit care este superioară altor rapoarte și ar putea
satisface cerințele analizei clinice. Deviațiile standard relative intraday și intermediare (RSD)
(n55) ale timpului de retenție au fost în intervalul de 0,26-0,90 și, respectiv, 0,46-3,1%, în
timp ce valorile intra și intraday pentru vârf a fost cuprinsă între 2,4 și 8,9% (a se vedea
Tabelul informațiilor de susținere S1), care este relativ mai mare decât cel al HPLC-UV și
apropiat de cel al HPLC-MS-MS [15] sau CE. Reproductibilitatea mai puțin dorită în acest
caz ar putea fi datorată unui
volumul injecției la nivelul nanoliterului și influența poziției electrodului asupra detectorului
electrochimic.

Pentru a demonstra validitatea și aplicabilitatea metodei propuse, alicotele probelor serului

uman au fost împrăștiate cu două nivele de soluții standard de amestec ale acestor compuși și
apoi au fost pretratate prin proceduri simple și analizate prin cLC-AD așa cum este descris în
Secțiunea 2. Cantitatea fiecărui analit a fost calculată din suprafața măsurată a vârfului cu
curba de calibrare corespunzătoare. Recuperările au fost calculate pe baza formulei:
Recuperare ð% Þ ¼ Sumă estimată Suma inițială Suma spiked 100% ð1Þ Recuperările
majorității analizatelor au fost în intervalul 78-130%, iar RSD-urile au variat între 2,5 și 9,7%.
Recuperări reduse au fost obținute pentru PAR (53-65%), probabil datorită adsorbției
nespecifice a PAR la proteine și parțial precipitată înainte de analiză. Având în vedere
rezultatele, metoda propusă a arătat o procedură de pre-tratare a probelor în două etape destul
de simplă și o interferență mai mică a matricei și a fost de o precizie și precizie acceptabile
pentru aplicarea în farmacocinetică sau analiză clinică.