EXTRACCIÓN DE ADN

Miranda Jiménez Ma Camila1, Solorzano Lizarazo Jesús1, Vergara Martínez Oscar1.

1. Estudiantes de primer semestre de medicina, Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias de la Salud.

Mayo/30/ 2017.

RESUMEN
El ADN es una macromolécula química, ésta pertenece al grupo de los ácidos
nucleicos. Forma los cromosomas del núcleo presentes en las células y es portador
de la información genética de cada individuo. El código genético (formado por el
ADN) es un lenguaje basado en combinaciones que se pueden formar a partir de la
guanina, timina, citosina y adenina. Cualquier característica biológica está
determinada por su orden y forman un triplete; cada triplete es una palabra cifrada
o señal que conduce a un aminoácido. La extracción de ADN de las células donde
se halla confinado es un procedimiento analítico y diagnóstico emanado en
diferentes etapas y para lo cual existen en el estudio de la biología molecular
diversos protocolos; para el desarrollo de la práctica se utilizó una modificación del
protocolo “Salting-out” lo que permitió mediante la implementación de procesos de
centrifugación e incubación y el uso de algunas soluciones como buffer lisis,
proteinasa K, acetato de potasio, etanol absoluto frío y agua ultrapura, obtener 6.1
ng/µl de ácidos nucleicos, A260 = 0.121, A280 = 0.057, 260/280 = 2.13, 260/230 =
0.12. A partir de lo cual se desarrollaron y alcanzaron los objetivos planeados en la
experiencia práctica “extracción de ADN” con el fin de afianzar conocimientos de
futuros profesionales de la medicina.

Palabras claves: ADN, Extracción, Salting-out.

ABSTRACT
DNA is a chemical macromolecule, this belongs to the group of nucleic acids. It forms
the nucleus chromosomes present in the cells and carries the genetic information of
each individual. The genetic code (formed by DNA) is a language based on
combinations that can be formed from guanine, thymine, cytosine and adenine. Any
biological characteristic is determined by its order and forms a triplet; Each triplet is
an encrypted word or signal that leads to an amino acid. The extraction of DNA from
the cells where it is confined is an analytical and diagnostic procedure emanated in
different stages and for which several protocols exist in the study of molecular
biology; For the development of the practice, a modification of the "Salting-out"
protocol was used, which allowed the use of centrifugation and incubation processes
and the use of some solutions such as buffer lysis, proteinase K, potassium acetate,
cold absolute ethanol and Ultrapure water, obtain 6.1 ng / μl of nucleic acids, A260
= 0.121, A280 = 0.057, 260/280 = 2.13, 260/230 = 0.12. From there, the objectives
planned in practical experience "DNA extraction" were developed and achieved in
order to strengthen knowledge of future medical professionals.

Keywords: DNA, Extraction,

INTRODUCCIÓN Desde el punto de vista químico, el

El ácido desoxirribonucleico,
abreviado como ADN, es un ácido
nucleico que contiene instrucciones
genéticas usadas en el desarrollo y
funcionamiento de todos los
organismos vivos conocidos y algunos
virus, y es responsable de su
transmisión hereditaria. Fue aislado
por primera vez, durante el invierno de
1869, por el médico suizo Friedrich
Miescher.1
La función principal de la molécula de
ADN es el almacenamiento a largo
plazo de información. Muchas veces,
el ADN es comparado con un plano o
una receta, o un código, ya que
contiene las instrucciones necesarias
para construir otros componentes de
las células, como las proteínas y las
moléculas de ARN. Los segmentos de
ADN que llevan esta información
genética son llamados genes, pero las
otras secuencias de ADN tienen
propósitos estructurales o toman parte
en la regulación del uso de esta
información genética.2
ADN es un polímero de nucleótidos, es
decir, un polinucleótido. Un polímero
es un compuesto formado por muchas
unidades simples conectadas entre sí,
como si fuera un largo tren formado
por vagones. En el ADN, cada vagón
es un nucleótido, y cada nucleótido, a
su vez, está formado por un azúcar (la
desoxirribosa), una base nitrogenada
(que puede ser adenina A, timina T,
citosina C o guanina G) y un grupo
fosfato que actúa como enganche de
cada vagón con el siguiente. Lo que
distingue a un nucleótido de otro es,
entonces, la base nitrogenada, y por
ello la secuencia del ADN se
especifica nombrando sólo la
secuencia de sus bases. La
disposición secuencial de estas cuatro
bases a lo largo de la cadena es la que
codifica la información genética: por
ejemplo, una secuencia de ADN
puede ser ATGCTAGATCGC. En los
organismos vivos, el ADN se presenta
como una doble cadena de
nucleótidos, en la que las dos hebras
están unidas entre sí por unas
conexiones denominadas puentes de
hidrógeno.
Para que la información que contiene
el ADN pueda ser utilizada por la
maquinaria celular, debe copiarse en
primer lugar en unos trenes de
nucleótidos, más cortos y con unas
unidades diferentes, llamados ARN.
Las moléculas de ARN se copian
exactamente del ADN mediante un
proceso denominado transcripción.
Una vez procesadas en el núcleo
celular, las moléculas de ARN pueden
salir al citoplasma para su utilización
posterior. La información contenida en
el ARN se interpreta usando el código
genético, que especifica la secuencia
de los aminoácidos de las proteínas,
según una correspondencia de un
triplete de nucleótidos denominado
codón para cada aminoácido. Esto es,
la información genética,
esencialmente: qué proteínas se van a
producir en cada momento del ciclo de
vida de una célula, se halla codificada
en las secuencias de nucleótidos del
ADN y debe traducirse para poder
funcionar.
En los organismos celulares
desempeña diversas funciones. Es la
molécula que dirige las etapas
intermedias de la síntesis proteica; el
ADN no puede actuar solo, y se vale
del ARN para transferir esta
información vital durante la síntesis de
proteínas (producción de las proteínas
que necesita la célula para sus
actividades y su desarrollo). Varios
tipos de ARN regulan la expresión
génica, mientras que otros tienen
actividad catalítica. El ARN es, pues,
mucho más versátil que el ADN.
Como el ADN, el ARN está formado
por una cadena de monómeros
repetitivos llamados nucleótidos. Los
nucleótidos se unen uno tras otro
mediante enlaces fosfodiéster
cargados negativamente.
Cada nucleótido está formado por una
molécula de monosacárido de cinco
carbonos (pentosa) llamada ribosa
(desoxirribosa en el ADN), un grupo
fosfato, y uno de cuatro posibles
compuestos nitrogenados llamados
bases: adenina, guanina, uracilo
(timina en el ADN) y citosina.3
OBJETIVOS:
La práctica desarrollada bajo los
principios de la biología molecular tuvo
como objetivos:
 Conocer el protocolo de extracción
para la determinación y
cuantificación de ADN en el
laboratorio
 Aislar ADN
METODOLOGÍA
Para el desarrollo de la práctica se
utilizó una modificación del protocolo
“SALTING-OUT” y como material
fundamental las micropipetas para
medición de microvolúmenes,
siguiendo los pasos mencionados a
continuación:
1. Transferir un volumen de 500µl de
sangre total a un tubo de
eppendorf.
2. Centrifugar a 1200rpm durante 5 RESULTADOS
minutos.
3. Al pellet adicionar 500 µl de buffer
lisis y agitar y centrifugar a  Primera fase:
12000rpm durante 5 minutos.
4. Descartar el sobrenadante y al
Pellet adicionar 300µl de buffer
lisis, agitar.
5. Agregar 3 µl de proteinasa K,
incubar 30 minutos a 55 °C.
6. Inactivar la proteinasa K a 95°C x
1min.
7. Centrifugar a 12000 rpm por 10
minutos.
8. El sobrenadante se pasa a un
nuevo vial y se adicionan 500ml de
acetato de potasio 5M (precipitar).
Img N°1: Selección de la muestra, 500 µl de
9. Centrifugar a 12000rpm por 10 sangre.
minutos, tomar sobrenadante y
adicionar 0,6 volúmenes de etanol
absoluto frio.
10. Incubar en hielo durante 10
minutos.
11. Incubar a 20°C hasta la siguiente
semana.
12. Centrifugar a 12000 rpm durante
10 minutos.
13. Lavar el Pellet del ADN con 1000µl
de etanol al 70%.
14. Centrifugar a 12000 rpm por 10
minutos, descartar el etanol.
15. Dejar secar el ADN a temperatura
ambiente en un concentrador de
ADN a 45°C por 10 minutos.
16. Resuspender en 50 µl de agua
Img N°2: Adición al pellet del buffer lisis.
ultrapura (H2OUP).
Img N°3: Incubación de la proteinasa K a Img N°6: Incubación en hielo durante 10
55°C. minutos.

 Segunda fase: Transcurrida una

semana de iniciado el experimento

Img N°4: Inactivación de la proteinasa K a

Img N°7: Proceso de cuantificación del ADN,
95°C.
posterior a la centrifugación, lavado y descarte
del etanol, secado del ADN y resuspensión
con agua ultrapura.

Img N°8: Cuantificación del ADN, 6.1 ng/µl de

ácidos nucleicos, A260 = 0.121, A280 =
Img N°5: Centrifugación a 12000rpm. 0.057, relación 260/280 = 2.13, relación
Posterior a la adición del acetato de potasio. 260/230 = 0.12.
ANÁLISIS
La extracción de ADN de las células
donde se halla confinado es un
procedimiento analítico y diagnóstico
emanado en diferentes etapas y para
lo cual existen en el mercado de la
biología molecular diversos protocolos
aplicados como se explica en la
sección anexos de este artículo, pero
a continuación se discutirá cada uno
de los pasos utilizados en la práctica
de laboratorio donde se obtuvo ADN a
partir de una modificación del
protocolo “SALTING-OUT” y los
resultados.
Lo primero fue utilizar una muestra
adecuada para lo cual se seleccionó
una muestra de sangre. La sangre es
una fuente excelente de ADN, está
conformada por elementos formes
también llamados elementos figurados
que son aquellos elementos
semisólidos y particulados
representados por células y sus
derivados, donde se encuentran los
glóbulos blancos (o leucocitos) de los
cuales es posible obtener ADN y los
glóbulos rojos humanos (eritrocitos o
hematíes), de los cuales es imposible
obtener ADN pues carecen de núcleo
y el segundo componente constituye
el plasma sanguíneo.4 La muestra
seleccionada fue transferida al tubo
eppendorf fabricado a partir de
polipropileno ideal para facilitar la
micro centrifugación y el estudio de la
biología molecular y la química por su
resistencia y bajo costo. Al centrifugar
la muestra se buscó separar sólidos
de líquidos de diferente densidad por
medio de una fuerza giratoria. La
fuerza centrífuga fue provista de la
centrifugadora, la cual imprime a la
mezcla un movimiento de rotación que
origina una fuerza que produce la
sedimentación de los sólidos o de las
partículas de mayor densidad, esta
técnica permitió aislar el pellet
necesario para la extracción del ADN
porque constituye el conglomerado de
elementos de la sangre de donde es
posible hallar ADN (glóbulos blancos).
Al adicionar el buffer lisis este
ocasionó el lisamiento de las células
que consiste en romper las
membranas y estructuras que
confinan el citoplasma y liberar al
medio su contenido mediante las sales
del contenido del buffer (por ejemplo
Tris-HCl o EDTA) para regular la
acidez y la osmolaridad del lisado.5 Se
procedió a agitar con el objetivo de
mezclar todo el contenido y a
centrifugación para continuar
separando los objetos no necesarios
para el análisis final de la muestra,
terminada la centrifugación
nuevamente se eliminó el
sobrenandante y se adicionó buffer
lisis ya para el aislamiento de
estructuras sintetizadas a partir del
material genético (proteínas) y
continuar aislando ADN libre esencial,
a este nivel del experimento fue
adicionada la proteinasa K que es una
serina proteasa de amplio espectro,
esta enzima lo que hizo fue actuar
predominante en el sitio de escisión de
proteínas, el enlace peptídico
adyacente al grupo carboxilo de
aminoácidos alifáticos y aromáticos
con grupos alfa-amino bloqueados y
se procedió a incubar durante media
hora para que la enzima activamente
cumpliera su objetivo. Luego se
incubó a 95 ºC para inactivar la este proceso, el etanol hace que el
proteinasa K y prevenir así la ADN se deshidrate, es decir, pierda
presencia de inhibidores de la PCR contacto con las moléculas de agua
por sus siglas en inglés (reacción en que lo rodean, y lo aísla de la solución
cadena de la polimerasa).6 acuosa para dejarlo libre de impurezas
Nuevamente se centrifugó para la y precipitado.
eliminación de las proteínas
La segunda fase, transcurrida una
degradadas, el sobrenadante
semana de iniciado el experimento, la
resultante se transfirió a otro vial y se
centrifugación se realizó con el
adicionó acetato de potasio que es
objetivo de concentrar el precipitado a
una sal neutra del ácido acético y el
partir del etanol absoluto frio, y se
Hidróxido de potasio utilizado para
adicionó nuevamente etanol en esta
separar el ADN plásmido del ADN
ocasión fue a una concentración del
cromosómico, las cadenas simples del
70% para terminar el proceso de
ADN lineal son insolubles en sales
filtración y precipitación; luego se dejó
altas. Se precipitan y forman un sólido,
secar el ADN en un concentrador de
mientras que el ADN plásmido circular
ADN, finalmente se adicionó agua
no es insoluble en sales. El ADN
ultrapura para rehidratar el ADN
plásmido permanecerá en la solución,
dispuesto para ser cuantificado,
y de esa forma separa el ADN
determinándose la existencia de 6,1
plásmido deseado del resto del ADN
ng/µl de ácidos nucleicos, en tanto que
en la célula. El hidróxido de potasio
en 260 se obtuvo 0,121 la cantidad de
provee la solución básica para
ácido nucleico contenida en 1 mL, en
denaturar y abrir las cadenas de ADN,
tanto, la relación de absorbancias
tanto el plásmido como el
7 A260/280 y A260/230 se utilizan para
cromosómico. Una vez que el ADN ya
evaluar la pureza de las muestras. La
no es una solución alcalina, sólo el
relación A260/280 es muy estable y se
ADN plásmido puede volver a
considera que un ADN de pureza
cerrarse. Para poder separar el ADN
óptima tiene un valor entre 1.8-2.0, un
cromosómico abierto del ADN
ADN de pureza aceptable debe tener
plásmido cerrado, se usa acetato de
al menos una relación A260/280 > 1.6.
potasio para precipitar selectivamente
Un valor A260/280 < 1.6 indica una
el ADN cromosomal y alejar otros
posible contaminación por
restos celulares del ADN plásmido de
compuestos aromáticos como fenoles
la doble cadena deseada. Para
y proteínas, un radio A260/280 > 2.1
terminar la primera fase de la
podría deberse a la presencia de ARN
extracción de ADN se adicionó etanol
en la muestra lo que ocurrió en el
absoluto frio, para precipitación del
experimento, ya que se obtuvo un
ADN, el ADN es insoluble en alcohol,
resultado de 2,13 para esta relación.
por lo que se puede precipitar en
Por su parte, A 230 nm absorben
etanol frío el cual además limpia el
contaminantes como sales
ADN de otras biomoléculas por un
caotrópicas, fenoles o carbohidratos,
proceso llamado "precipitación". En
en general, se considera que el ADN
es puro cuando el ratio A260/230 se
sitúa en torno 1.5-2.2 y en el
experimento se encontró relación de
0.12 estando bajo el umbral
establecido indicaría presencia de
contaminantes en la muestra. No
obstante, esta relación resulta mucho
más variable que la relación A260/280
dependiendo de factores como la
concentración de ADN o de la
composición del tampón de
resuspensión de la muestra. 8
CONCLUSIONES
Se cumplió cabalmente con los
objetivos planteados, extraer
nítidamente DNA de una muestra de
sangre periférica. Se comprendió la
utilización del método de aislamiento
de DNA a partir de una modificación
del protocolo “Salting-out”, como
también el manejo de instrumental
para esta clase de prácticas como
micro-pipetas las cuales nos permiten
obtener cantidades exactas. Los
conceptos aprendidos en clase fueron
afianzados y aclarados, tales como los
de lisis celular (ruptura de
membranas), utilización de buffers y
microcentrifugación entre otros.
ANEXOS
 Cuestionario
1. ¿Qué es TES?
Es una solución tampón usada con el
propósito de romper células abiertas
para uso en experimentos de biología
molecular que analizan los
compuestos de las células (por
ejemplo, Western Blot). La mayoría de
los tampones de lisis contienen sales
(por ejemplo Tris-HCl o EDTA) para
regular la acidez y la osmolaridad del
lisado. A veces se añaden detergentes
(tales como Triton X-100 o SDS ) para
romper las estructuras de membrana.
El tampón de lisis puede usarse tanto
en células de tejidos animales como
en células de plantas.
2. ¿Qué es TRIS-HCL?
Tris es el nombre abreviado del
compuesto orgánico conocido como
tris(hidroximetil)aminometano, de
fórmula (HOCH2)3CNH2. Se utiliza
ampliamente en bioquímica y biología
molecular, en particular para preparar
disoluciones tampón (por ejemplo,
tampones Tris-HCl, Tris-Gly, TAE y
TBE). Es una amina primaria, con la
reactividad típica, por ejemplo la
condensación con aldehídos y el
establecimiento de un equilibrio ácido-
base (responsable de su capacidad
tamponante).9
3. ¿Qué es EDTA?
El ácido etilendiaminotetraacético,
también denominado EDTA o con
menor frecuencia AEDT, es una
sustancia utilizada como agente
quelante que puede crear complejos
con un metal que tenga una estructura
de coordinación octaédrica. Coordina
a metales pesados de forma reversible
por cuatro posiciones acetato y dos
amino, lo que lo convierte en un
ligando hexadentado, y el más
importante de los ligandos quelatos.10
4. ¿Qué es SDS?
El dodecilsulfato sódico (SDS o NaDS)
(C12H25NaO4S), también conocido
como laurilsulfato sódico (SLS), es un
compuesto tensioactivo aniónico,
empleado en diversos productos de
higiene personal, como pasta de
dientes, champú y jabones de baño.
La molécula posee una cola de 12
átomos de carbono, adosada a un
grupo sulfato, dotando a la molécula
de las propiedades anfifílicas
requeridas para todo detergente.11
5. ¿Qué es el acetato de potasio?
¿Cuál es su estructura química?
El acetato de potasio es una sal neutra
del ácido acético y el Hidróxido de
potasio cuya fórmula es: CH3CO2K.
Se encuentra presente en la savia de
diversas plantas, al calcinarse la
madera el acetato de potasio se
descompone en ácido carbónico. Era
empleado en medicina como un
fármaco con propiedades diuréticas.
En las tecnologías de extinción de
incendios (de origen oleoso).
En altas concentraciones de acetato
de potasio el ADN cromosomal
precipita, obedeciendo a la
reasociación inespecifica de las largas
cadenas de ADN simple cadena, que
ocurre en diferentes sitios formando
una masa insoluble.12
6. ¿Qué es el fenol-cloroformo?
El cloroformo es un líquido incoloro de
fórmula química CHCl3, dulcemente
perfumado. Hoy en día, el cloroformo
se usa en una variedad de procesos
industriales, refrigerantes y
disolventes. al ser tóxico y debe ser
manejado con cuidado. La exposición
excesiva a cloroformo puede causar
daños a largo plazo para la salud. El
cloroformo es un líquido transparente,
incoloro, de olor agradable y sabor
dulce pero produce ardor en la boca y
la garganta. Es volátil y no es
inflamable.
Uso industrial
El cloroformo se utiliza en la industria
química, para fabricar plásticos o
teflón o en la síntesis orgánica.
Antiguamente se usó como anestésico
y como arma.
Empleado en la industria para la
limpieza como desengrasante de
metales.
En química se utiliza en la separación
orgánica.
En la fabricación de plásticos que se
utiliza en el proceso de unión.
Se utiliza como un precursor en la
fabricación de teflón (antiadherente).
Como anestésico
El cloroformo es un anestésico eficaz
al inhalar su vapor. Deprime la
actividad del sistema nervioso central.
Fue sustituido por éter, que es menos
peligroso.
Cuando se utiliza fenol-cloroformo en
la extracción del ADN, el fenol:
desnaturaliza las proteínas
contaminantes de la muestra. Se usa
para eliminar la proteínas (proteasas,
nucleasas...); disminuye el
rendimiento de la PCR a puede extraer con cloroformo, alcohol
concentraciones del 0,2% y al 0,5% la
inhibe completamente. Y el
Cloroformo: permite la separación de
2 fases; el ADN queda en la fase
acuosa y en la fase orgánica quedan
las proteínas y otros contaminantes.13
7. ¿Qué otros métodos de extracción
existen?
Incubación del lisado para su uso.
Una posible forma de aislar el ADN
genómico es incubar el lisado crudo a
temperaturas entre 90 – 100 ºC y
luego usarlo directamente. Es
evidente que mediante este método el
ADN obtenido es de muy baja pureza
y con aplicaciones muy reducidas.
Otra desventaja de este método son
las pérdidas de ADN por acción de las
nucleasas y otros componentes de los
orgánulos que están en contacto con
el ADN y pueden destruirlo, por lo que
no es útil para almacenar el ADN pues
los contaminantes pueden degradar
las moléculas de ADN.
Lisis por ruptura mecánica y
extracción con disolventes orgánicos
Si se opta por realizar el lisado de las
células mediante un proceso
mecánico hay que tener en cuenta la
posibilidad de ruptura de las
moléculas de ADN que se intentan
separar, por lo que este debe bastar
para lograr la lisis de las células pero
no ser muy agresivo para proteger el
ADN. Este método puede ser usado
para extraer ADN de material crudo,
liofilizado o congelado, que puede
romperse con un mortero, por
congelación-descongelación o usando
ultrasonidos. El lisado de células se
isoamílico o fenol, siendo las proteínas
y otros componentes de la célula
solubles en el disolvente orgánico, por
lo que de esta forma se logra la
separación de los ácidos nucleicos.
Este método se puede usar para
moléculas de ADN de alto peso
molecular, obteniendo buenos
rendimientos de moléculas
relativamente puras, siempre teniendo
en cuenta que hay que controlar el pH
de la fase acuosa y la concentración
de sales, que son los factores que
aseguran una buena separación. Las
desventajas de este método son el uso
de disolventes orgánicos dañinos para
la salud humana y que pueden quedar
como trazas en la muestra de ADN y
luego actuar como interferentes en
técnicas como el PCR, que es largo,
en ocasiones puede dar rendimientos
poco reproducibles y requiere de
varios trasvases que aumentan la
posibilidad de contaminación de la
muestra.
Lisado y purificación con un
detergente iónico. Método del CTAB
Este es un procedimiento básico para
extraer ADN de vegetales, donde un
detergente aniónico puede romper la
pared celular y así se produce la lisis
de las células. El uso de detergentes
aniónicos no solo se restringe a la
extracción de ADN vegetal, puede ser
usado para ADN genómico de
bacterias y otros tipos de organismos.
Un ejemplo de este método, quizás el
más conocido, es el uso de CTAB
(bromuro de cetil trimetil amonio)
como detergente para lograr la lisis. El
CTAB además, en presencia de EDTA
como agente quelatante y TRIS-HCl
como tampón, forma complejos
insolubles con el ADN. Luego se
extraen los residuos orgánicos con
cloroformo, para separar
posteriormente el ADN por
precipitación con etanol. Si se quiere
evitar el uso de disolventes orgánicos
se puede llevar a cabo el método del
CTAB separando directamente los
complejos insolubles formados con el
ADN del sobrenadante donde han
quedado disueltos el resto de
componentes celulares. Estos
complejos se resuspenden en
disolución salina y se adiciona
posteriormente alcohol y RNAsa,
logrando que precipite el ADN con un
grado de pureza aceptable para
muchas aplicaciones.
Método de salting-out
A partir de un lisado celular se pueden
separar las moléculas de proteínas y
otros contaminantes del ADN
mediante la adición de altas
concentraciones de sal que hacen que
disminuya la solubilidad de las
moléculas orgánicas en la fase
acuosa. En este método se utiliza
frecuentemente la proteinasa K, el
TRIS-HCl para regular el pH y otros
reactivos químicos que aseguren la
total inactivación de las enzimas que
pueden actuar sobre las moléculas de
ADN. Para la extracción se utilizan
sales inorgánicas como el perclorato
de sodio y el cloruro de sodio en
concentraciones muy altas que hacen
precipitar a las moléculas orgánicas.
El precipitado formado se separa por
centrifugacón y luego se puede
extraer el ADN de la disolución acuosa
mediante la adición de alcohol, por
precipitación.
Este método es sencillo, pero no
siempre es eficaz, por lo que el ADN
obtenido en muchas ocasiones debe
ser purificado antes de ser usado en
posteriores aplicaciones. La ventaja
es que se elimina el uso de disolventes
orgánicos.
Uso de la proteinasa K y el
dodecilsulfato de sodio
El procedimiento conocido como PK-
SDS por sus siglas en inglés
proteinase K - sodium dodecyl sulfate,
es uno de los más usados para la
extracción de ADN ya que la digestión
de la muestra se puede realizar con
proteinasa K que es activada por el
dodecil sulfato de sodio. La proteinasa
K inactiva las DNAsas presentes en el
lisado celular usando detergente
aniónico el SDS. La proteinasa K
también es usada en otros de los
métodos descritos en este artículo
para la digestión de las proteínas y
otros contaminantes del lisado celular.
Método de extracción de ADN con
yoduro de sodio como agente
caotrópico en un único tubo
La compañía Wako pone a disposición
de los investigadores y empresas
varios kit de ADN que usan yoduro de
sodio como agente caotrópico, que
tienen la ventaja de que la extracción
se realiza en un único micro tubo de
centrifugado. El yoduro de sodio
además de provocar la lisis celular
rompe la capa de hidratación que
rodea el ADN y logra que las cargas
negativas de los grupos fosfatos del
ADN queden más expuestas. En estos
kits después del tratamiento de la
muestra con yoduro de sodio en el
mismo tubo se adicionan detergentes
aniónicos como es el caso del N-lauril
sarcosinato de sodio, proteinasa K y/o
otros reactivos que permiten separar
las proteínas y lípidos contenidos en
las muestras biológicas del ADN.
Extracción con gradientes de cloruro
de cesio – bromuro de etidio
El ADN genómico puede ser purificado
por centrifugación selectiva a través
de la generación de gradientes de
cloruro de cesio. Primeramente se
lleva a cabo el lisado celular por
métodos mecánicos o químicos y la
mezcla es centrifugada durante varias
horas en presencia de bromuro de
etidio. Como hay bromuro de etidio en
el medio, se pueden visualizar las
diferentes capas en las que se
agrupan los ácidos nucleicos según su
densidad con luz ultravioleta. Se
obtienen varias capas que pueden
separarse y recuperar el ADN
purificado.
Este método a pesar de dar como
resultado un ADN de alta calidad tiene
una serie de desventajas: es largo,
imposible de automatizar, caro,
requiere una ultracentrífuga y usa
compuestos químicos tóxicos.14
8. Realizar un esquema de los
componentes de la sangre
Composición de la sangre
El cuerpo humano adulto tiene entre
4,5 y 6 litros de sangre. El 55% es
plasma, que es la parte líquida,
compuesta por agua, sales minerales
y proteínas. El 45% restante se
compone de glóbulos rojos, glóbulos
blancos y plaquetas. La sangre
también transporta gases, hormonas,
vitaminas, glucosa, etc.
La sangre tiene la función de hacer
llegar el oxígeno y el alimento a todas
las células del cuerpo, y retirar el
anhídrido de carbono y las sustancias
de desecho.
Por la circulación sanguínea viajan
tres tipos de células:
1.- Los glóbulos rojos o hematíes.
También llamados eritrocitos.
Constituyen aproximadamente el 40%
del volumen sanguíneo. Se producen
en la médula ósea. Son células en
forma de disco bicóncavo que no
tienen núcleo. En la sangre hay
normalmente entre 4 y 5,5 millones por
milímetro cúbico (mm3). Viven unos
120 días. Su tamaño es de unas 8
micras (8 milésimas de milímetro). Su
función es transportar el oxígeno
desde los pulmones hasta las células
de todos los tejidos corporales. Para
ello utilizan una proteína llamada
hemoglobina, que contiene hierro y es
capaz de trasportar moléculas de
oxígeno. La hemoglobina es lo que da
el típico color rojo a los hematíes.
Cuando por alguna enfermedad hay
falta de hematíes en la sangre se
padece de anemia. El índice
hematocrito es un indicador sobre el
porcentaje de glóbulos rojos que hay
en la sangre por unidad de volumen; lo
normal esta entre 42% y 50% en
hombres y entre el 38% y 47% en
mujeres. Las características de la
membrana de los hematíes definen los
grupos sanguíneos.
2.- Glóbulos blancos o leucocitos. Son
células defensivas que forman parte
del sistema inmunológico. Tienen la
función de combatir los
microorganismos y cuerpos extraños.
Se producen en la médula ósea. En la
sangre hay entre 4.000 y 10.000
leucocitos por milímetro cúbico. Los
glóbulos blancos están dispersos por
todo el cuerpo, y muchos de ellos se
adhieren a las paredes de los vasos
sanguíneos o los traspasan para ir a
otros tejidos o allí donde sean
necesarios.
Hay varios tipos de leucocitos, que se
clasifican en:
- Granulocitos: Son células defensivas
que tienen un núcleo polimorfo con
numerosos gránulos en su citoplasma.
Se clasifican a su vez en 1) neutrófilos,
2) basófilos y 3) eosinófilos. Los
neutrófilos son los encargados de
fagocitar o "comerse" sustancias
extrañas, como las bacterias y los
agentes externos que entran en el
cuerpo; son los leucocitos más
numerosos y su cantidad aumenta
cuando hay una infección. Los
basófilos segregan sustancias
anticoagulantes y participan en el
control de la inflamación. Los
eosinófilos son células fagocitarias
que eliminan los complejos antígeno-
anticuerpo y que por su capacidad
citotóxica tienen una función de
defensa ante los microorganismos no
fagocitables, como los parásitos.
- Linfocitos: Son los leucocitos de
menor tamaño y las células del
sistema inmunológico especializadas
en regular la inmunidad adquirida. Se
localizan en los ganglios linfáticos. Los
linfocitos son los encargados de la
producción de anticuerpos y de la
destrucción de células defectuosas.
Hay dos tipos: 1) los linfocitos T tienen
una función inmunológica celular; 2)
los linfocitos B se encargan de fabricar
los anticuerpos.
- Monocitos: Son las células
sanguíneas de mayor tamaño.
Después de viajar por la sangre llegan
al tejido conectivo, donde se
convierten en macrófagos. Su función
consiste en fagocitar microorganismos
y restos celulares, rodeándolos con
sus pseudópodos.
3.- Las plaquetas o trombocitos. Son
partículas (no propiamente células)
que participan en la coagulación de la
sangre. Son necesarias para taponar
rápidamente las heridas e impedir
hemorragias. Se fabrican en la médula
ósea. Tienen un tamaño de 3 o 4
micras, son de forma oval y no tienen
núcleo. Suele haber entre 140.000 y
450.000 plaquetas por milímetro
cúbico. Hay una enfermedad
hereditaria llamada hemofilia que
consiste en un déficit en la
coagulación de la sangre.15
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