Sustentante:
DIRECTOR
DR. ORLANDO LÓPEZ BÁEZ
Universidad Nacional
Heredia, Costa Rica
2013
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA
INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA
UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA
Sustentante:
TRIBUNAL EXAMINADOR:
_____________________________________
Dr. Orlando López Báez
Universidad Autónoma de Chiapas – México
Director de Tesis
____________________________________
Dr. Tomás de Jesús Guzmán
Instituto Tecnológico de Costa Rica
Asesor
___________________________________
Dra. Sayra Munguía Ulloa
Universidad Nacional de Costa Rica
Asesora
___________________________________
Dr. Willy Soto Acosta
Representante del SEPUNA
___________________________________
Dr. Freddy Araya Rodríguez
Coordinador General del DOCINADE
2
DEDICATORIA
A Dios ….
por que sin él nada puede pasar en mi vida.
A mi familia …..
por su apoyo, paciencia y todo el cariño que me dan.
3
AGRADECIMIENTOS
A mis Profesores del DOCINADE, gracias por sus enseñanzas y los grandes
aportes que me brindaron en mi formación.
Al Dr. Orlando López Báez, Director de la Tesis, gracias por su apoyo y sus
grandes enseñanzas, las cuales me han permitido lograr esta meta tan
importante en mi vida.
4
INDICE GENERAL
Página
DEDICATORIA iii
AGRADECIMIENTO iv
ÍNDICE GENERAL v
ÍNDICE DE CUADROS viii
ÍNDICE DE FIGURAS x
ÍNDICE DE ANEXOS xii
RESUMEN xv
SUMMARY xvi
INTRODUCCIÓN xvii
CAPITULO 3. METODOLOGIA 32
3.1. Diseño de la investigación 33
5
3.2. Ubicación geográfica 34
3.3. Materiales 34
3.3.1. Material biológico 34
3.3.2. Material de Laboratorio 34
3.4. Métodos 35
3.4.1. Obtención de extractos vegetales 35
3.4.1.1. Presurizado 35
3.4.1.2. Hidrolato por destilación 35
3.4.1.3. Fermentado aeróbico 35
3.4.1.4. Fermentado anaeróbico 35
3.4.2. Aislamiento del patógeno 36
3.4.3. Trabajo en condiciones de laboratorio 36
3.4.3.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión
en Agar 36
3.4.3.2. Método de discos de papel 38
3.4.3.3. Método de disco de papel Kirby-Bauer 39
3.4.3.4. Determinación del medio para la formación y
germinación de conidias de monilia 40
3.4.3.5. Evaluación de tratamientos sobre la formación y
germinación de conidias de M. roreri 40
3.4.4. Trabajo en condiciones de campo 42
3.4.4.1. Determinación del ciclo de la enfermedad 42
3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación 45
3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la
enfermedad en árboles de cacao 47
3.4.5. Caracterización fitoquímica de los extractos 49
6
4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M.
Roreri 77
4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación 81
4.2.2.1. Incidencia de M. roreri 81
4.2.2.2. Severidad externa ocasionada por la inoculación de M.
Roreri 82
4.2.2.3. Severidad interna ocasionada por la inoculación de M.
Roreri 84
4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad
en árboles de cacao 87
4.2.3.1. Incidencia de la enfermedad 87
4.2.3.2. Producción de cacao 92
4.3. Análisis económico 94
4.4. Análisis de los compuestos de los extractos 99
CONCLUSIONES 111
RECOMENDACIONES 113
BIBLIOGRAFÍA 114
ANEXOS 124
7
INDICE DE CUADROS
Página
8
Cuadro 16. Comparación de los tiempos de retención (TR) y
porcentaje de abundancia obtenidos en GC-MS de los
extractos de canela y clavo. 100
Cuadro 17. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del
compuesto dada por el equipo de GC-MS del hidrolato de
canela. 100
Cuadro 18. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del
compuesto dada por el equipo de GC-MS del Hidrolato de
clavo. 102
9
INDICE DE FIGURAS
Página
10
pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de
incidencia de M. roreri en chilillos de cacao. 88
Figura 23. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M.
roreri sobre mazorcas de cacao. 88
Figura 24. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M.
roreri sobre frutos de cacao. 89
Figura 25. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y
pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de
incidencia de M. roreri en una plantación de cacao. 91
Figura 26. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre la producción de cacao. 93
Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes
solventes. 104
Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes
solventes. 105
Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del
hidrolato de canela: Aldehído cinámico. 107
Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del
hidrolato de clavo: Acetato de eugenol. 108
Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del 110
hidrolato de clavo.
11
INDICE DE ANEXOS
Página
Anexo 1. Produccion Mundial de cacao. 125
Anexo 2. Producción de cacao en México. 125
Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del
50% (v/v) sobre el crecimiento de M. roreri. 125
Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
concentración del 50% (v/v) sobre el crecimiento de M.
roreri. 126
Anexo 5. Análisis de varianza para extractos a concentración del
50% (v/v) sobre la formación de conidias de M. roreri. 127
Anexo 6. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
concentración del 50% (v/v) sobre la formación de
conidias de M. roreri. 127
Anexo 7. Análisis de varianza para extractos a cuatro
concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri. 128
Anexo 8. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
cuatro concentración sobre el crecimiento de M. roreri. 128
Anexo 9. Análisis de varianza para extractos de clavo, jengibre,
orégano y maguey, a cuatro concentraciones sobre el
crecimiento de M. roreri. 129
Anexo 10. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de clavo,
jengibre, orégano y maguey, evaluados a cuatro
concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri. 129
Anexo 11. Análisis de varianza para extractos de canela y
pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la
formación de conidias de M. roreri. 130
Anexo 12. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de canela y
pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la
producción de conidias de M. roreri. 130
Anexo 13. Análisis de varianza para extractos a cuatro
concentraciones sobre la formación de conidias de M.
roreri. 131
Anexo 14. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
cuatro concentraciones sobre la producción de conidias de
M. roreri. 132
Anexo 15. Análisis de varianza de productos de síntesis química
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de
disco de papel. 133
Anexo 16. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0,05) para productos de síntesis
química evaluados sobre la producción de conidias de M.
roreri mediante el Método de discos de papel. 133
12
Anexo 17. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el método de
Disco de papel. 133
Anexo 18. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0,05) de extractos vegetales sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de
papel. 134
Anexo 19. Análisis de varianza de productos de síntesis química
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de
Disco de papel Kirby-Bauer. 134
Anexo 20. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para productos de síntesis
química evaluados sobre la producción de conidias de M.
roreri mediante el Método de discos de papel Kirby-Bauer. 135
Anexo 21. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el método de
Disco de papel Kirby-Bauer. 135
Anexo 22. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) de extractos vegetales sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de
papel Kirby-Bauer modificado. 136
Anexo 23. Análisis de varianza (Anova), del efecto de medios
con sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número
de conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 72 horas. 137
Anexo 24. Análisis de varianza (Anova), del efecto medios con
sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número de
conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 72
horas. 138
Anexo 25. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de
conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 96 horas. 139
Anexo 26. Comparación de medias por la prueba de Rango
múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los
hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de
conidias de M. roreri. 140
Anexo 27. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de
conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 96
horas. 140
Anexo 28. Comparación de medias por la prueba de Rango
múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los
hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de
conidias germinadas de M. roreri. 141
Anexo 29. Análisis de varianza (Anova), del Porcentaje de
incidencia de M. roreri del efecto de la aspersión de
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao
inoculados. 141
Anexo 30. Comparación de medias por la prueba de Rango
múltiple de Tukey del Porcentaje de Incidencia de M.
roreri en frutos de cacao asperjados con hidrolatos de
13
clavo, canela y pimienta. 141
Anexo 31. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad
Externa (ISE) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo
y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri. 142
Anexo 32. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad
Interna (ISI) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y
pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri. 142
Anexo 33. Porcentaje de mazorcas afectadas con M. roreri por
tratamiento y sus índices de severidad interna (ISI) y
externa (ISE) luego de 60 días de la inoculación artificial
con 9 x 104 conidias*mL-1. Tapachula, Chiapas – México. 142
Anexo 34. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en la incidencia de
M. roreri, en una plantación de cacao. 143
Anexo 35. Análisis de varianza (Anova), del efecto en la
producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos
de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri,
en una plantación comercial. 143
Anexo 36. Análisis de sensibilidad de los tratamientos para
diferentes niveles de rendimiento de cacao. 144
14
RESUMEN
15
SUMMARY
Monilia pod rot caused by Moniliophthora roreri, is the most devastating disease
affecting cocoa (Theobroma cacao L.), is present in 11 countries in South and
Central America, It’s arrived in Mexico in 2005, causing losses exceeding 50%
of harvest, abandonment and deforestation by demolition of plantations. Among
the alternative studied for the monilia control are the cultural practice, chemical
fungicide sprays, and the natural genetic resistance. The goal in this research
was, develop and characterize plant extracts effective against M. roreri, which
can be incorporated into a system of organic cocoa production in Mexico.In this
study investigated extracts obtained from Pimienta dioica L. Zingiber officinale
Roscoe, Syzygium aromaticum L. Origanum vulgar L. Tradescantia spathacea
Swartz and Cinnamomum zeylanicum Nees. The research was achieved on the
2008- 2012 period, in three phases: the first on in vitro assays, in order to make
a screening and determination the minimum inhibitory concentration (MIC) of
the best extracts and the extraction method. The selection criterion was the
regulation of the growth and sporulation of M. roreri. The second phase consist
of field test of the selected extracts, using a clonal commercial plantation of
cacao, the criterion for evaluation was the effectiveness and the economic
analysis of the treatments with plant extracts performed as foliar application.
The third phase with chromatography and spectrophotometric analysis (GC-MS)
identified possible compounds of those extracts that showed the best
effectiveness against the pathogen. With regard to the best way of obtaining
extracts, the hidrolato was the most efficient and best regulatory effect on M.
roreri, followed by pressurized and aerobic fermentation. The results showed
that all plants evaluated possess metabolites with ability to inhibit a greater or
lesser degree fungal growth. The hydrolato extracts of C. zeylanicum, S.
aromaticum and P. dioica showed the greatest inhibition of conidia germination
and multiplication of M. roreri in liquid medium. In field conditions, both fruits
with artificial inoculation of M. roreri as commercial plantation under natural
incidence of 69.6% of M. roreri, the S. aromaticum and C. zeylanicum
hodrolatos at 20% concentration showed high effectiveness in control of monilia
disease. Treatment with these products yielded 98% of healthy fruits and
increased cocoa production by 800% by 1000%, compared with the control.
Economic analysis, resulted in a rate benefit / cost greater than 2 and a return
tax of 127.95% and 138% of S. aromaticum and C. zeylanicum extracts
respectively, indicating a high technical and economic feasibility to incorporate
these treatments into a management plan of moniliasis on cocoa plantation, in
either a traditional or organic management. For the C. zeylanicum hidrolato 17
compounds have been identified to be the major cinnamic aldehyde with
74.08% with 6.8% eugenol and cinnamyl acetate with 5.18%, while the majority
compounds of hidrolato of S. aromaticum resulted eugenol acetate (58.95%)
and eugenol (15.96%).
16
INTRODUCCION
Por otra parte, las plantaciones de cacao constituyen agroecosistemas que por
su estructura y función se asemejan al ecosistema tropical húmedo, se
considera por lo tanto que en los estados de Chiapas y Tabasco el cacao
posee un alto valor ecológico, contribuyendo a la conservación de los recursos
naturales del trópico.
17
productores de cacao, ya que ocasiona pérdidas totales de la cosecha. Este
patógeno de reciente entrada a México, esta ocasionando que los productores
abandonen o derriben las plantaciones al no lograr producción alguna,
situación que pone en peligro la cacaocultura Mexicana.
18
CAPÍTULO 1.
INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO
19
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO
1.1. Antecedentes
20
Los bajos rendimientos que presenta la cacaocultura actual de México es
generada en gran medida por la presencia de plantaciones viejas de más de 40
años, material genético de bajos rendimientos y susceptible a plagas y
enfermedades, bajo o nulo manejo cultural y presencia de una gran diversidad
de problemas fitosanitarios.
21
El ingreso de la moniliasis al territorio azteca tambaleó la producción ya que
este hongo que ataca directamente a los frutos ocasionó pérdidas totales de la
producción en muchas de las regiones de producción en los estados de
Chiapas y Tabasco. En el Anexo A se pueden apreciar los datos de la
evolución del cultivo del cacao durante la última década, en la que se resalta
como antes del ingreso de la moniliasis (2004) el área sembrada era de
81964.11 ha, la cual se redujo en un 23,51% a un año de su ingreso y para el
año 2010 en un 25,15%. De la misma manera la producción antes del ingreso
de este patógeno a territorio mexicano era de 43974.52 toneladas, la cual se
redujo en un 17,30% a un año de su ingreso, en el año 2010 en un 38,20% y
en el 2011 se redujo en 50,95%; en tanto que el rendimiento por hectárea se ha
reducido en un 18,5% (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera
SIAP, 2011).
22
Las alternativas que se han estudiado para el manejo de la moniliasis han
demostrado que se requiere de un manejo cultural basado fundamentalmente
en bajar el porte de los árboles, así como podas de formación y saneamiento
permanentemente, recolección y manejo eficiente, oportuno y adecuado de
frutos enfermos, así como manejo de los árboles de sombra (López, 2006a;
Federación Nacional de Cacaoteros, 2004).
23
vulgare L., Tradescantia spathacea Swartz, Cinnamomum zeylanicum Nees se
reduzca la incidencia de la moniliasis en plantaciones de cacao de México?
1.3. Justificación
24
de ser afectadas por la enfermedad denominada moniliasis del cacao. Para el
año 2005 se realizó el primer reporte de la presencia de esta enfermedad en el
norte del estado de Chiapas y para el 2006 ya se dieron reportes de la
afectación de plantaciones en la región de la “Chontalpa”, principal área
productora del estado de Tabasco y para finales del mismo año se encontró la
enfermedad en el municipio de Tuzantán perteneciente a otra de las zonas más
importantes como lo es la del Soconusco en el estado de Chiapas. A la fecha el
hongo ya se encuentra disperso en las principales áreas de producción de
cacao en México, lo cual ha causado reducción del 25,15% en el área de
siembra, del 50,95% en la producción nacional y de 18,5%, en el rendimiento
por hectárea, después del ingreso de esta enfermedad a territorio mexicano
hace seis años.
25
de cacao de éstas regiones, las cuales poseen el legendario cacao criollo de
gran aceptación por parte del mercado chocolatero dada sus buenas
características organolépticas.
De otra parte, los bajos o nulos ingresos que tienen los productores con cacao
afectado por monilia, hacen que ellos salgan a buscar otras fuentes de
ingresos, incentivando así la migración de los pobladores rurales a otros
lugares del país o a Estados Unidos, generando el abandono de las zonas
rurales, desintegración familiar y escasez de mano de obra en etapa activa.
26
Científico: Los resultados de la investigación permitirán generar conocimiento
acerca del potencial de extractos de plantas en el manejo de fitoparásitos, uso
de extractos de plantas como alternativa al manejo de la moniliasis del cacao,
así como avanzar en el estudio de sistemas de producción orgánica y de
manejo ecológico de la moniliasis del cacao en México.
1.5. Objetivos
27
2. La implementación de un manejo orgánico integral incorporando
extractos vegetales resulta eficiente técnica, económica y
ambientalmente en el manejo orgánico de la moniliasis del cacao.
28
CAPÍTULO 2.
MARCO TEÓRICO
29
CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
El cacao (Theobroma cacao L.) es una planta ancestral que ha llegado a tener
gran importancia cultural, ecológica y económica. En la época precolombina la
semilla se utilizaba para obtener una bebida la cual fue considerada como
alimento de los dioses y de ahí su nombre genérico científico theo = dios y
broma = alimento; y fue usado por los Mayas, Aztecas y otros grupos como
moneda. Su centro de origen fue la cuenca del río Amazonas, dispersándose
hasta el sur de México donde en la actualidad se encuentra uno de las mayores
reservas de germoplasma y del legendario cacao criollo (Estrada, 2010).
30
Se estima que más de 20 millones de personas dependen directamente de
este cultivo para subsistir y que el 90% de la producción es cosechada de
minifundios (menor de 5 ha) (ICCO, 2011).
31
Lucía y Bolivia) tienen rendimientos reportados entre 0,73 y 1,0 t/ha en
promedio.
Por otra parte, las plantaciones de cacao constituyen agroecosistemas que por
su estructura y función se asemejan al ecosistema tropical húmedo, se
32
considera por lo tanto que el cacao posee un alto valor ecológico contribuyendo
a la conservación de los recursos naturales del trópico (Salgado, 2006).
2.2.1. Situación actual del cacao en México: El cultivo del cacao en México
ha sido manejado principalmente por pequeños productores, los cuales
dependen casi exclusivamente de la mano de obra familiar para atender las
plantaciones, quienes además tienen bajo nivel educativo y poca capacidad
económica de reinvertir en sus plantaciones.
33
baja calidad, realizan usualmente un inadecuado manejo de las plantaciones,
con plantas que van de los 6 a los 7 metros de altura, existe un alto número de
plantaciones viejas con más de 30 años y algunas de ellas están abandonadas.
34
de los bosques naturales y superior a la de los habitas agrícolas más
intervenidos (Salgado, 2006).
35
con las condiciones ambientales, el manejo del cultivo, las medidas de control
que se apliquen y las variedades cultivadas. En plantaciones ubicadas en
zonas húmedas, con poca tecnificación y sin control, es frecuente observar
pérdidas superiores al 90%. Sin embargo, bajo condiciones culturales óptima
de manejo, control y germoplasma mejorado, los daños disminuyen
considerablemente, y esta situación genera una alternativa para el desarrollo
del cultivo del cacao en áreas infestadas por la enfermedad.
36
el rendimiento se redujo en 1982 a 3,500 toneladas. Funcionarios del Centro
Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE) reportan que por
culpa de la enfermedad, de las 20.000 hectáreas sembradas en 1978 en ese
país centroamericano, quedan en la actualidad unas 1.200 ha, porque los
productores erradicaron los cultivos para sembrar plátano, banano y tubérculos.
Se tiene el reporte que en cinco años de ingresada la enfermedad la
producción cayó 72% y las exportaciones 96% (Programa Cooperativo en
Investigación y Tecnología Agrícola para la Región Norte, 2005).
37
mitospóricos, Clase: Hyfomycetes, Orden: Moniliales, Familia: Moniliacea,
Género: Moniliophthora y Especie: M. roreri (Cif. & Par).
38
coloración más clara y brillante que el resto de la mazorca. Después del
desarrollo de las protuberancias ocurre la muerte del chilillo.
2.3.6. Ciclo del hongo: Galindo y Enríquez (1983) indican que la fuente de
inóculo conocida capaz de producir infecciones son los conidios. El origen de
éstos para desarrollar una nueva infección define dos ciclos de vida del hongo:
Primario y secundario.
Una vez desarrollados, los conidios son diseminados por los animales, los
insectos, el viento, la lluvia o el movimiento de los frutos esporulando durante la
labor de cosecha.
39
La espora germina y penetra la mazorca en todos los estados de crecimiento.
La penetración ocurre directamente a través de la epidermis y ocasionalmente
a través de los estomas, sin que sea necesaria la presencia de heridas.
2.3.7. Epidemiología
40
La cantidad de inóculo que se forma en una mazorca esporulante es abundante
y su máxima intensidad ocurre entre los primeros días. Al respecto,
Campuzano (1980) indica que un cm2 de micelio esporulante puede producir un
total de 45 millones de esporas y una mazorca completamente infectada está
en capacidad de producir 700 millones de esporas infectivas. Porras (1984)
cuantificó que la capacidad de liberación de conidios de frutos esporulantes fue
máxima en el primer mes, con un promedio de 546 mil conidios por mazorca,
pero se redujo después de dos meses.
41
De acuerdo con Suárez (1979) una alta humedad relativa (mayor del 80%) y
temperaturas cercanas a los 22°C favorecen la germinación de los conidios, en
cambio Campuzano (1980) cuantificó la mayor germinación de esporas a una
temperatura de 20°C y una humedad relativa del 100%.
Dentro de las plantaciones, las condiciones que favorecen alta humedad y por
lo tanto el desarrollo de la moniliasis, son el drenaje deficiente del suelo,
plantas muy altas y con exceso de sombra y sin la ejecución de labores
culturales, especialmente la poda, la regulación de la sombra y el control de las
malas hierbas.
42
2.3.7.3. Diseminación de Moniliophthora roreri: Las esporas de M. roreri se
diseminan fácilmente; debido a que las esporas del hongo son secas, éstas se
desprenden fácilmente al golpear los frutos o por efecto del viento y de las
gotas de lluvia. Esto se repite continuamente, liberándose una gran cantidad de
esporas infectivas que al llegar a frutos sanos desarrollan la enfermedad.
De esta manera las prácticas culturales son hasta el momento las que han
brindado mejores resultados tanto en la reducción de la incidencia de la
enfermedad como en los costos del manejo de la misma, se recomienda el
remover del árbol los frutos afectados en cualquier estado de desarrollo y
dejarlos en el piso tapados con hojarasca.
43
sobrepasar el 50% y la realización de podas de los árboles del cacao bajando
el porte de los mismos a 3 m.
44
2.4. Los extractos de plantas y su poder para el manejo de problemas
fitosanitarios.
Para Vergara (1997), las especies de plantas que pueden ser utilizadas para
obtener extractos con poder plaguicida, deben poseer las siguientes
45
características: ser perennes, ocupar poco espacio y necesitar de poco agua y
fertilizantes; no destruirse cada que se obtienen sus partes para elaborar
extractos, que no se conviertan en maleza ni traigan plagas de cultivos y que
además posean usos complementarios. Los extractos crudos de estas
especies podrían obtenerse con tecnologías sencillas, ser de fácil consecución
y ambientalmente seguros sin que ocasionen problemas ecológicos.
46
5% (Álvarez et al., 2002). Se evaluaron 20 extractos hidroalcoholicos (hojas,
raíces, tallos, botones florares, frutos) pertenecientes a 13 familias para el
control de sigatoka (Mycosphaerrela fijiensis) en plátano, de los cuales ocho
presentaron buen nivel de control (Arciniegas et al., 2002).
47
La mayoría de los agentes alelopáticos son metabolitos secundarios derivados
de las rutas acetato- mevalonato o del ácido shikimico. Provienen de la ruta
metabólica del acetato- melovato: terpenos, esteroides, ácidos orgánicos
solubles en agua, alcoholes de cadena lineal, aldehídos alifáticos, cetonas,
ácidos grasos insaturados, insaturados simples, ácidos grasos de cadena
larga, poliacetilenos, naftoquinonas, antroquinonas, quinonas complejas y
floroglucidos. Provienen de la vía metabólica del shikímico: fenoles simples, el
ácido benzoico y sus derivados, el ácido cinámico y sus derivados, cumarinas,
sulfuros, glicósidos, alcaloides, cianhidrinas y algunos derivados de quinonas y
taninos hidrolizables y condensados. Existen también compuestos como los
flavonoides en cuya síntesis participan metabolitos de las dos rutas.
48
metabolitos secundarios, muchos de los cuales juegan un importante papel en
interacciones complejas entre organismos vivos (efectos aleloquímicos) en el
entorno natural.
49
CAPITULO 3.
METODOLOGÍA
50
CAPITULO 3. METODOLOGÍA
AISLAMIENTO DE
Moniliophthora roreri
RECOLECCIÓN DE
MATERIAL VEGETAL
MULTIPLICACIÓN In vitro
OBTENCIÓN DE de Moniliophthora roreri
EXTRACTOS
SCREENING DE LABORATORIO
SELECCIÓN DE MEJORES
EXTRACTOS
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN
MINIMA INHIBITORIA (CMI)
SELECCIÓN MEJORES
EXTRACTOS Y CMI
51
3.2. Ubicación geográfica
3.3. Materiales
Nombre Parte
Nombre Científico Familia
común utilizada
Semilla
Pimienta dioica L. Pimienta Myrtaceae
Hoja
Zingiber officinale Roscoe Jengibre Rizoma Zingiberáceas
Cinnamomum zeylanicum Hoja
Canela Lauraceae
Nees Astilla
Hoja
Syzygium aromaticum L Clavo Myrtaceae
Semilla
Origanum vulgare L. Orégano Parte aérea Labiateae
Tradescantia spathacea
Maguey Hojas Commelinaceae
Swartz
52
3.4. Métodos
53
3.4.2. Aislamiento del patógeno.
El hongo M. roreri se obtuvo de muestras de tejido enfermo colectado en
plantaciones de cacao de productores del municipio de Pichucalco del estado
de Chiapas, para lo cual se colectaron frutos enfermos de donde fue aislado el
hongo y cultivado en condiciones de laboratorio, en cajas de petri de plástico
estéril de 60 mm de diámetro en medio de cultivo compuesto por papa-
dextrosa-agar (PDA) marca Difco®.
54
zeylanicum Nees Presurizado T14
F. aeróbico T15
F. anaeróbico T16
Hidrolato T17
Presurizado T18
Astilla
F. aeróbico T19
F. anaeróbico T20
Hidrolato T21
Presurizado T22
Hoja
F. aeróbico T23
F. anaeróbico T24
Syzygium aromaticum L
Hidrolato T25
Presurizado T26
Semilla
F. aeróbico T27
F. anaeróbico T28
Hidrolato T29
Presurizado T30
Origanum vulgare L. Parte aérea
F. aeróbico T31
F. anaeróbico T32
Hidrolato T33
Tradescantia spathacea Presurizado T34
Hojas
Swartz F. aeróbico T35
F. anaeróbico T36
Testigo Absoluto PDA T37
Polisulfuro de
Testigo Mineral T38
calcio
La unidad experimental fue constituida por una caja de petri y los tratamientos
fueron distribuidos en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones.
Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, a los datos
obtenidos se realizó un análisis de varianza y la prueba de comparación de
medias de Tukey al 5%.
55
Determinación de la concentración mínima inhibitoria
Los extractos que presentaron inhibición total del crecimiento y desarrollo del
patógeno, se utilizaron para los ensayos correspondientes a la etapa en la
que se determinó la concentración mínima inhibitoria; estos productos fueron
evaluados a concentraciones del 40, 30, 20 y 10%.
Se preparó el medio de cultivo con PDA al cual se añadió cada uno de los
extractos a las concentraciones a estudiar, posteriormente se realizó la
inoculación del patógeno.
56
PRODUCTO COMERCIAL INGREDIENTE ACTIVO DOSIS DEL
FABRICANTE
Ziram granuflo® Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn 76% 5 g/L
Tamis® Carbamida 21% 5 mL/L
Eco 720® Clorotalonil 54% 5 mL/L
Barrida® Clorotalonil 72% 5 g/L
Ridomil gold Bravo 76.5
Clorotalonil + Metalaxil 1.5 g/L
PH®
Ranman® Cyanoimidazole 1 mL/L
Para el caso de las pruebas para determinación del control químico se usaron
discos de papel Whatman No. 2 de 7 mm de diámetro y cajas petri de 50 mm.
57
Para el desarrollo del método de disco de papel Kirby-Bauer también se
realizaron pruebas para la determinación del control químico, para este caso se
usaron discos de papel Whatman No. 2 de 7 mm de diámetro y cajas petri de
50 mm.
58
se homogenizó con un ayuda de agitador magnético por una hora. Una parte
se agregó en cuatro tubos de ensayo a los cuales previamente se les había
vertido la concentración correspondiente al tratamiento a evaluar y otra parte a
otros cuatro tubos con agua destilada que correspondieron al testigo absoluto.
Los tubos de ensayo que contenían estas suspensiones fueron incubados a
25ºC en oscuridad y cada 24 horas se realizó diluciones de 1x10-2 para poder
hacer la lectura en el microscopio con la ayuda de una cámara de Neubauer y
contabilizar el número de esporas totales y las germinadas de las 12, 24, 48, 72
y 96 horas.
Variables:
Tratamientos:
Diseño Experimental:
59
3.4.4. Trabajo en condiciones de campo
60
de la polinización se retiraron los frascos de plástico y se procedió a realizar el
embolsado de cada uno de los frutos, con bolsas de polietileno, esto para evitar
que los frutos se contaminaran con esporas del medio ambiente.
61
Variables cuantificadas:
Índice de severidad interna. A los seis meses de edad todos los frutos
fueron cosechados, se abrieron longitudinalmente, agrupado según cada
mes de inoculación y se evaluó el daño ocasionado en el interior de los
frutos, por M. roreri. Para determinar la severidad interna de los frutos se
utilizó la escala propuesta por Sánchez et al., (1987), donde mide el
porcentaje de área necrosada desarrollada por M. roreri, así: grado 0=
0%; 1=1-20%; 2= 21-40%; 3= 41-60%; 4= 61-80%; 5=100%. Esta
variable muestra la capacidad de daño interno que puede causar el
hongo en la mazorca afectando los granos.
62
3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación. Para
desarrollar este ensayo se realizó la polinización artificial de las flores del clon
UNACH 130, con la finalidad de obtener frutos de la misma edad y sin
incidencia de monilia, para lo cual se tomaron flores abiertas y se les quitaron
los pétalos y se unieron sus anteras con el estigma de la flor también abierta
que estaba en el árbol, luego se colocó un dispositivo plástico para aislar la flor
y se esperó a su desarrollo; posteriormente se preparó el inoculo de M. roreri
según la metodología descrita por Merchán, (1991).
Sobre frutos de una edad cercana a los 70 días se realizó la aspersión de cada
uno de los extractos y del polisulfuro de calcio y se cubrieron con una bolsa de
polietileno y se colocó una toalla húmeda por espacio de tres días, luego se
destapó y se realizó la inoculación de M. roreri, utilizando conidias secas
adheridas a punta de una aguja de disección (9 x 10 4 conidias/mL), las cuales
se depositaron en una zona de dos centímetros cuadrados de la zona
previamente marcada con esmalte y humedecida con agua estéril. Posterior a
la inoculación los chilillos fueron protegidos en una cámara húmeda constituida
por una bolsa de polietileno y una toalla de papel empapada con agua estéril,
con el propósito de humedecer el ambiente interno y favorecer la germinación
de las esporas; la toalla de papel se retiró dos días después cortando uno de
los extremos de la bolsa y con ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se
marcó para facilitar el seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la
aparición de los síntomas iniciales y finales en el ensayo.
Tratamientos:
63
Descripción de Tratamientos
Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación
Tratamiento Dosis
Aplicación Clavo semilla hidrolato 20%
antes Canela corteza hidrolato 30%
inoculación Pimienta semilla hidrolato 30%
Polisulfuro de calcio 10%
Aplicación Clavo semilla hidrolato 20%
después Canela corteza hidrolato 30%
inoculación Pimienta semilla hidrolato 30%
Polisulfuro de calcio 10%
Testigo sin inoculación (aplicación solo agua)
Testigo inoculado
64
Diseño experimental:
Análisis estadístico:
Aplicación de extractos: Cada uno de los extractos fue mezclado con agua
para completar el volumen correspondiente. Las aplicaciones se realizaron
cada 15 días con aspersora manual a todos los árboles de cada una de las
parcelas, en las horas de la mañana.
65
enfermedad en el lote de ensayo. Los tratamientos y sus dosis se describen a
continuación:
Tratamiento Dosis
Clavo hidrolato 20%
Canela hidrolato 30%
Pimienta hidrolato 30%
Polisulfuro de calcio 10%
Testigo manejo cultural (eliminación semanal de frutos enfermos)
Testigo absoluto
Diseño experimental:
Evaluación
Incidencia de la enfermedad
Utilizando la fórmula:
66
Severidad externa. Se contabilizó tanto en chilillos como en mazorcas
la apariencia externa del fruto y los signos del patógeno, utilizando la
escala: grado 0= fruto sano, 1= giba; 2= mosaico; 3= mancha
(necrosis); 4= micelio hasta un 25% de la mancha; 5= micelio en más
del 25% de la mancha. Esta variable mide el nivel de daño externo
causado por el hongo y su habilidad para producir propágalos.
Análisis estadístico:
67
slip/splitless (12:1). Columna Agilent 19091A-002, Methyl Siloxane, capilar, con
las siguientes características: largo 25,0 m, diámetro 200,0 µm con un tamaño
de partícula de 0,11 µm, gas de arrastre, Helio, con flujo inicial de 1 mL/min y
luego flujo constante. Volumen de inyección 1 µL. Temperatura inicial 60°C, a
temperatura final de 325°C, Tiempo de corrido 114.67 min.
68
CAPÍTULO 4.
69
CAPÍTULO 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
50
45
40
C
R
E 35
C
I 30
M Hidrolato
I
E 25 Presurizado
N F.aerobica
T 20
O F.anaeob
15
(mm)
10
0
Canela Hoja Canela Asti Pimienta Hoja Pimienta sem TESTIGOABS TESTQUIM
TRATAMIENTOS
70
EXTRACTOS DE CLAVO, OREGANO, MAGUEY Y JENGIBRE EN EL
CRECIMIENTO DE M. roreri
50
45
C
R 40
E
C 35
I
M
I
30
E
Hidrolato
N 25 Presurizado
T
O 20 F.aerobica
(mm) F.anaeob
15
10
5
0
Clavo Hoja Clavo sem Oregano Maguey Jengibre Testigo Abs Testigo
quim
TRATAMIENTOS
Para el caso de la pimienta tanto para los extractos obtenidos a partir de la hoja
como los de la semilla, las formas de hidrolato y presurizado inhibieron
totalmente al patógeno, mientras que las fermentaciones redujeron el
crecimiento entre un 55 y un 35%.
71
(P<0,05) separó los 16 mejores tratamientos que inhibieron completamente el
crecimiento (canela hoja hidrolato, canela hoja presurizado, canela hoja
fermentación aeróbica, canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato,
pimienta hoja presurizado, pimienta semilla hoja, pimienta semilla presurizado,
clavo hoja hidrolato, clavo semilla hidrolato, clavo semilla presurizado, clavo
semilla fermentación anaeróbica, orégano hidrolato, maguey hidrolato, jengibre
hidrolato) de otro grupo de extractos que permitieron cierta inhibición del hongo
y un tercer grupo que permitió el crecimiento total del patógeno como fueron el
maguey en fermentaciones aeróbica y anaeróbica, así como el testigo absoluto
(Anexo 4).
72
hoja anaeróbica, jengibre anaeróbica, maguey anaeróbica, clavo hoja aeróbica,
maguey aeróbica) (Anexo 6).
35
30
25
C 20
O Hidrolato
N
I 15
D Presurizado
I
A 10 F.aerobica
S
5 F.anaeob
(mL)
X 107
0
TRATAMIENTOS
45
40
35
30
C 25 Hidrolato
O
N Presurizado
I 20
D F.aerobica
I
A 15 F.anaeob
S
10
(mL)
X 107
5
0
Clavo Hoja Clavo sem Oregano Maguey Jengibre Testigo Abs Testigo
quim
TRATAMIENTOS
73
Los extractos de hoja de canela (hidrolato, presurizado, fermentación aeróbica),
corteza de canela (hidrolato), pimienta hoja (hidrolato y presurizado), pimienta
semilla (hidrolato y presurizado), clavo semilla (hidrolato, presurizado,
fermentación aeróbica y fermentación anaeróbica), y los hidrolato de orégano
maguey y jengibre que presentaron el mejor efecto regulador sobre M. roreri
pasaron a la siguiente prueba con el fin de determinarles la concentración
mínima inhibitoria.
50
45
40
C
35
R
E 30
C
I 40
M 25
I
30
E 20 20
N
T
15 10
O
(mm)
10
0
Canela hoja Canela hoja Canela hoja Canela astilla Testigo abs Testigo quim
hidrol Presu F. ae Hidrol
TRATAMIENTOS
74
50
45
40
C 35
R
E 30
C
I 40
M 25
I
30
E 20 20
N
T 10
O 15
(mm)
10
0
Pim hoja Pim hoja pres Pim sem Pim semilla Testigo abs Testigo quim
hidrol hidro presu
TRATAMIENTOS
75
concentraciones evaluadas permitió el desarrollo del hongo, por lo que su CMI
es del 50%.
50
45
40
C
R 35
E
C 30
I
M 40
I 25
E 30
N
T
20 20
O
15 10
(mm)
10
0
Clavo hoja Clavo sem Clavo sem Clavo sem Clavo sem Testigo abs Testigo
hidrol Hidrol pres F. aer F. anae quim
TRATAMIENTOS
76
50
45
40
C
R 35
E
C
I 30
M 40
I
E 25 30
N
T 20
O 20
10
(mm) 15
10
0
Oregano hidrol Maguey hidrol Jengibre hidrol Testigo abs Testigo quim
TRATAMIENTOS
77
45
40
35
C
O
30
N
I 25 40
D
I 30
20
A 20
S
15 10
(mL)
X 107 10
0
Canela hoja Canela hoja Canela hoja Canela astilla Testigo abs Testigo quim
hidrol Presu F. ae Hidrol
TRATAMIENTOS
45
40
35
C
O 30
N
I
D 25 40
I
A 30
20
S 20
(mL) 15 10
X 107
10
0
Pim hoja Pim hoja pres Pim sem Pim semilla Testigo abs Testigo quim
hidrol hidro presu
TRATAMIENTOS
78
Con respecto a los extractos obtenidos de pimienta ninguna concentración de
los cuatro extractos obtenidos de esta planta mostraron efecto de estimulación
en la producción de conidias, al contrario el hidrolato de la semilla registró al
20% una de las cantidades mas bajas de conidias/mL, aún a pesar que registro
crecimiento micelial, al igual que el presurizado de hoja, sin embargo la CMI
siguen siendo las mismas descritas para el crecimiento (Figura 11).
Los resultados de las CMI del clavo, se aprecian en la figura 12, en la cual se
muestra como el clavo semilla en hidrolato a concentraciones del 40, 30 y 20%
al no registrar crecimiento tampoco mostraron producción de conidias, sin
embargo al 10% presentó formación de conidias siendo un 92.75% más bajo
que el testigo absoluto. Con respecto al clavo botón floral presurizado es un
caso similar al anterior, sin embargo al 10% la reducción en la producción de
conidias fue del 75%; siendo estas dos CMI las más bajas en todos los
tratamientos. La CMI del clavo botón floral en fermentación aeróbica fue del
20%, la de la fermentación anaeróbica al 40% y el hidrolato elaborado de hojas
de canela presentó tanto crecimiento como formación de conidias a las cuatro
concentraciones evaluadas, siendo la del 50% considerada como su CMI.
79
(P<0,05), señala que las concentraciones de 40, 30 y 20% del hidrolato y del
presurizado de clavo, las concentraciones de 40 y 30% del hidrolato de jengibre
y el fermentado anaeróbico de clavo, así como el fermentado anaeróbico al
40%, presentaron inhibición total y mostraron diferencias estadísticas con los
demás tratamientos y todos los tratamientos mostraron diferencias con el
testigo absoluto que fue el tratamiento que registro la mayor cantidad de
conidias (Anexo 14).
45
40
C 35
O
N 30
I
D
I 25 40
A
S 20 30
(mL)
20
X 107 15 10
10
0
Clavo hoja Clavo sem Clavo sem Clavo sem Clavo sem Testigo abs Testigo
hidrol Hidrol pres F. aer F. anae quim
TRATAMIENTOS
80
45
40
35
C
O
N 30
I
D 25 40
I
A 30
S 20 20
10
(mL) 15
X 107
10
0
Oregano hidrol Maguey hidrol Jengibre hidrol Testigo abs Testigo quim
TRATAMIENTOS
81
cumarinas tienen efecto bactericida sobre Echerichia coli, Salmonella enteritidis
y Shigella flexneri.
Nychas (1995) citado por Moreira et al., (2005) reporta como el aceite esencial
de clavo ejerce efecto inhibitorio sobre bacterias y mohos y que los medios por
los cuales estos microorganismos son inhibidos parece que involucra diferentes
modos de acción. Los resultados reportados por Busquet et al., (2005),
sugieren que el aceite extraído de brotes de clavo puede inhibir la peptidolisis
de bacterias ruminales ya que encontraron gran cantidad de N peptídico en los
ensayos realizados in Vitro. Los componentes fenólicos presentes en los
aceites esenciales se conoce que poseen actividad antimicrobial y algunos son
clasificados como sustancias seguras. Dichos compuestos fenólicos de aceites
sensibilizan la bicapafosfolipídica de la membrana de las células, causando un
incremento de la permeabilidad y escape de constituyentes intracelulares
82
vitales o dañando el sistema enzimático bacterial (Singh, Bhunia, & Stroshine
(2002), citados por Moreira et al., (2005).
Estos resultados encontrados para jengibre, coinciden con los reportados por
Nguefack (2004), quien determinó el efecto inhibitorio de Zingiber officinale
sobre aislamientos de tres hongos procedentes de alimentos (Fusarium
moniliforme, Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus), extractos que al igual
fueron obtenidos por destilación y que mostraron inhibición en el crecimiento y
formación de conidias de los tres hongos pero a concentraciones superiores
que la de otras plantas como el Thymus vulgaris, datos similares a los
reportados por Sacchetti et al., (2005), quienes estudiaron el efecto
antimicrobial de 11 plantas sobre levaduras presentes en los alimentos
(Candida albicans, Rhodotorula glutinis, Schizosaccharomyces pombe,
Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lypolitica), los resultados reportados para
el jengibre indican efecto inhibidor de su aceite pero a concentraciones altas,
además referencian que la presencia de fenilpropaniodes en el jengibre podría
ser el compuesto que le de propiedades de control sobre dichas levaduras.
83
Los resultados de la prueba de los extractos de las seis plantas evaluadas
sobre el crecimiento del hongo M. roreri muestran como el orégano, maguey,
jengibre, hoja de pimienta, hoja de clavo y sus cuatro formas de extracción no
mostraron halos de inhibición, mientras que otro grupo conformado por canela
corteza en presurizado, canela hoja en presurizado y fermentado anaeróbico,
clavo botón floral en presurizado, fermentados aeróbico y anaeróbico y el
hidrolato de la semilla de pimenta mostraron actividad moderada con halos de
inhibición que van de 7 a 14,5 mm y el grupo que mostró actividad fuerte es el
conformado por los hidrolatos de corteza y hoja de canela y los botones florales
de clavo, así como el fermentado aeróbico de hojas de canela y el testigo
químico (i.a. Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn), con un rango de 16 a 22,5 mm.
84
El análisis de varianza practicado reporta diferencias altamente significativas
entre los productos (Anexo 19), la prueba de Tukey corrobora lo anterior ya que
el Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn a dosis de 50 µL muestra diferencias
estadísticas con los demás tratamientos (Anexo 20).
85
dilución y en los discos de papel modificado mientras que para el método de
Kirby Bauer no, situación similar se ve con los extractos elaborados de botones
florales de clavo en presurizado y en fermentados aeróbico y anaeróbico.
86
Maguey F. Anaeróbico C - -
Jengibre hidrolato I 30 - -
Jengibre presurizado C - -
Jengibre F. Aeróbico C - -
Jengibre F. Anaeróbico C - -
QUIMICOS
Barrida (clorotalonil 72%) 5g/L C + -
Ziram (ditiocarbamato de Zn) 5 g/L I ++ +
Ranman 1mL/L C - -
Tamis (carbamida 54%) 5 mL/L I + -
Eco 720 (Clorotalonil 54%) 5 mL/L C + -
Ridomil (clorotalonil +) 1.5 g/L C + -
C = Crecimiento del patógeno I= Inhibición del crecimiento + Inhibición leve ++ Moderada +++ Fuerte
Teniendo en cuenta las pruebas anteriores se considera que los extractos que
tienen mayor potencial para el control de M. roreri para ser evaluado en
condiciones de campo son los hidrolatos elaborados a partir de la corteza de la
canela, los botones florales de clavo y de las semillas de pimienta.
El efecto de los medios con sucrosa al 2%, extractos de cacao y agua sobre la
cantidad de conidias de M. roreri muestran como desde las 12 horas hasta las
72 el medio que contenía el extracto de cacao mostró la mayor cantidad de
conidias, seguido del medio con sucrosa al 2%. Es evidente la alta
especificidad de M. roreri por los nutrientes presentes en el cacao para su
multiplicación ya que desde las 12 horas de evaluación la cantidad de conidias
fue un 79% mayor que el tratamiento con agua destilada, mientras que con el
medio con sucrosa fue del 31%, porcentajes que aumentaron al pasar las horas
con 377,2%, 291,18% y 86,6%, para las 24, 48 y 72 horas respectivamente.
87
Cuadro 3. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre
la cantidad de conidias totales de M. roreri.
72
12 horas 24 horas 48 horas
horas
Tratamiento Conidias/mL Tukey* Conidias/mL Tukey* Conidias/mL Tukey* Tukey*
6 6 6 Conidias/mL
x10 x10 x10 6
x10
Testigo 3,17 C 2,07 C 5,22 C 9,05 C
agua
Sucrosa 4,18 B 3,89 B 11,2 B 13,52 B
Cacao 5,69 A 9,88 A 15,2 A 16,89 A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
72
12 horas 24 horas 48 horas
horas
Tratamiento Conidias/mL Tukey* Conidias/mL Tukey* Conidias/mL Tukey* Tukey*
6 6 6 Conidias/mL
x10 x10 x10 6
x10
Testigo
0,481 C 0,290 C 0,853 C 1,684 C
agua
Sucrosa 0,556 B 0,406 B 0,102 B 2,043 B
Cacao 0,900 A 0,750 A 0,127 A 2,090 A
88
4.1.5 Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de
conidias de M. roreri.
89
140
Clavo semilla
Hidrolato
120
c
Pimienta semilla
o
100 Hidrolato
n
i
d 80 Canela corteza
i Hidrolato
a
s 60
Ziram
X106 40
Polisulfuro de
20
calcio
0
Testigo absoluto
12 24 48 72 96
HORAS
90
C 80
o Clavo semilla
n Hidrolato
i 70
d
i
a 60 Pimienta semilla
s Hidrolato
G 50
e Canela corteza
r
m 40 Hidrolato
i
n
a 30 Testigo químico
d
a
s 20
Polisulfuro de
X106 10 calcio
0
Testigo absoluto
12 24 48 72 96
HORAS
91
El análisis de varianza efectuado registró diferencias altamente significativas
entre los tratamientos (Anexo 27) y la prueba de Rango múltiple de Tukey
realizada para los tratamientos sobre la cantidad de conidias germinadas
muestra diferencias entre todos los tratamientos en las diferentes horas
evaluadas, siendo el polisulfuro de calcio y los hidrolatos elaborados a partir de
clavo y de pimienta los tratamientos que a las 12 horas de evaluación
mostraron los menores valores y que presentaron diferencias estadísticas con
el testigo absoluto y con los demás tratamientos; sin embargo a las 96 horas de
evaluación los tratamientos de corteza de canela, clavo, el polisulfuro de calcio
y el testigo químico (Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn) registraron los valores
más bajos de germinación de conidias los cuales entre si no presentaron
diferencias estadísticas, pero si con los demás tratamientos incluido el testigo
absoluto que fue el que registró el valor más alto de conidias germinadas de M.
roreri (Anexo 28).
92
En el Cuadro 5 se muestra el promedio de días en que fueron visibles los
síntomas y signos ocasionados por la inoculación con M. roreri sobre frutos de
cacao de uno a cinco meses de edad. Se aprecia que los primeros estados de
desarrollo del fruto son más susceptibles a la infección y al desarrollo de
síntomas y signos del patógeno, mientras que a edades de cuatro y cinco
meses es menor.
4 - - 42±11 - - -
5 - - 30 - - -
93
En esta investigación el síntoma de mosaico no se manifestó a ninguna edad
de los frutos. Es probable que este síntoma haya sido enmascarado por el color
natural que presentan los frutos del clon utilizado, los cuales son de un rojo
intenso.
94
alcanza el 77,8% de frutos de un mes de edad mientras que para los frutos de
dos meses el porcentaje se reduce al 40%.
2 40 80 100 80 80 100
4 0 70 0 0 0 50
5 0 20 0 0 0 0
95
4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
96
La forma y secuencia como se presentan los síntomas de la moniliasis,
observados en esta investigación, son concordantes con la descripción
realizada por diversos investigadores (FHIA, 2003; Krauss et al., 2006;
Aranzazu, Martínez y Martínez, 2009) en los que se reporta que los frutos
jóvenes hasta de tres meses de edad, son los más susceptibles; y en estos el
patógeno logra desarrollar completamente su ciclo hasta la formación de
estroma esporulante.
97
El conocimiento de la forma y período en que ocurren los síntomas y signos
que provoca la moniliasis en frutos infectados, obtenidos en esta investigación
permiten comprender la importancia que tiene la edad del fruto al momento de
la infección y que indican que el período más importante para la
implementación de estrategias de protección de los frutos, ya sea por la
aplicación del control químico convencional, el biocontrol o aspersiones de
biofungicidas. Estos tratamientos deben de intensificarse durante los primeros
cuatro meses de edad de los frutos de cacao. Es en esta etapa en la que hay
que poner mayor énfasis en el manejo de las plantaciones y en la protección de
los frutos, ya que esto permitirá alcanzar una mayor cantidad de frutos sanos.
En la Figura 17 se presenta el ciclo de la enfermedad en condiciones de
Tapachula, Chiapas- México.
98
4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación.
99
120
100
%
80
I
N
C
I 60
D
E
N
C
40
I
A
20
0
A Clav A Can A Pim A D Clav D Can D Pim D Test sin Test In
SH20% AH30% SH30% Polisul SH20% AH30% SH30% Polisul In
Ca Ca
TRATAMIENTOS
100
120
100
INDICE
80
% Esporul
Inicio espor
F 60
Mancha
R Mosaico
U 40 Jibas
T
Sano
O
S 20
0
A Clav A Can A Pim A D Clav D Can D Pim D Test sin Test In
SH20% AH30% SH30% Polisul SH20% AH30% SH30% Polisul In
Ca Ca
TRATAMIENTOS
101
Cuadro 8. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del Índice de Severidad Externa del efecto de los hidrolatos de clavo,
canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
Estos datos indican que los extractos presentan dos tipos de acciones: la
principal es de tipo preventivo ya que al aplicarse antes de la inoculación de las
esporas de M. roreri en el fruto, las probabilidades de desarrollar infección
fueron de un 42% con el hidrolato de clavo, 28,6% para el hidrolato de canela,
15% para el hidrolato de pimienta y de 0% para el polisulfuro de calcio, frente al
100% del testigo inoculado. Sin embargo también tienen cierta acción curativa
es decir, aún con la inoculación del patógeno en los frutos de cacao los
102
extractos permitieron el desarrollo de frutos sin infección, con valores de frutos
sanos de 25% para el hidrolato de pimienta, 55,55% para el hidrolato de clavo,
66,7% en el hidrolato de canela, y del 100% para el polisulfuro de calcio, frente
a cero frutos sanos en el testigo inoculado.
120
% 100
F INDICE
R 80
U 5
T 4
O 60 3
S
2
40 1
0
20
0
A Clav A Can A Pim A Polisul D Clav D Can D Pim D Polisul Test sin Test In
SH20% AH30% SH30% Ca SH20% AH30% SH30% Ca In
TRATAMIENTOS
103
de canela con ISI de 0,45 y el de clavo con 0,5, y éstos registraron diferencias
con los aplicados después de la inoculación del patógeno, por lo que se
evidencia que el momento de la aplicación de los hidrolatos es determinante en
la maximización del buen efecto que puede ejercer en el control de M. roreri.
Sin embargo se aprecia que con la aplicación de los hidrolatos sea antes o
después de la inoculación y considerando los ISI registrados por éstos, este
material se comportaría como resistente ya que Phillips-Mora, 2005, cataloga a
los materiales como resistentes si su ISI está entre 0 y 1,25; de 1,26 a 2,5
como moderadamente resistentes.
104
4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles
de cacao
105
% CHILILLOS ENFERMOS
80
70
60
10
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
SEMANAS
% INCIDENCIA EN MAZORCAS
100
90
80
70
10
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
SEMANAS
106
transcurso de las 29 semanas de evaluación, registrándose para el hidrolato de
canela corteza en las semanas 19, 26 y 29, el 6,6; 2,2 y 9,9% de incidencia
respectivamente, mientras que para el hidrolato de clavo en las semanas 14 y
58 se registraron valores del 2 y 11% respectivamente; con respecto al
hidrolato de pimienta en las semanas 12 y 58 la incidencia sobre las mazorcas
fue del 6,6% y 4,4%, respectivamente y el polisulfuro de calcio en las semanas
con 22 con 2,5% y en el 52 con 6,6% de incidencia, siendo estos valores muy
bajos con respecto al testigo.
% INCIDENCIA EN FRUTOS
90
80
70
60
Clavo sem H 20%
50 Canela Ast H 30%
Pimien Sem H 30%
40
Sulfocalcico
30 Testigo relativo
Testigo Absoluto
20
10
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
SEMANAS
107
valores más bajos en el transcurso de las evaluaciones realizadas, seguido por
los hidrolatos de pimienta, canela y clavo.
108
70
60
%
I 50 %INCIDENCIA
N CHILILLOS
C
40 %INCIDENCIA
I
MAZORCAS
D
E %INCIDENCIA
N 30
TOTAL
C
I
A 20
10
0
Canela Clavo Pimienta Polisulfuro Testigo Testigo
Hidrolato Hidrolato Hidrolato de calcio cultural Absoluto
Los valores de reducción en la afectación de M. roreri fue del 98% para los
hidrolatos y del 99% para el polisulfuro de calcio, datos que muestran mayor
efectividad que los reportados por otros autores. En Venezuela Sánchez, et al.,
109
2003 reporta que con prácticas culturales la incidencia de M. roreri fue menor al
6% y mostró la mayor producción, aunque fue igual a tratamientos con
aspersiones de oxicloruro de cobre y Mancozeb cada 15 días en concentración
de 860 y 347 g i.a/ha, respectivamente solos o combinados con prácticas
culturales quincenalmente; sin embargo menciona que la incidencia de la
enfermedad fue baja para este período evaluado. Bateman, et al., 2005, indican
que el hidróxido de cobre 1500 g i.a ha (-1), ha mostrado ser consistentemente
el más eficaz en el control de M. roreri de una serie de ensayos realizados en
Costa Rica, con un promedio de incremento del 72-100% (es decir, a veces el
doble) en número de frutos sanos y que el fungicida sistémico flutolanil en una
dosis de 300 g de i.a ha-1, parece proteger los frutos sustancialmente al
principio de su etapa de desarrollo, pero con un control proporcionalmente
menor de M. roreri que el cobre en las etapas de desarrollo tardío de los frutos.
Reportes que indican que si bien el cobre actúa sobre M. roreri, no reportan
datos de incidencia tan bajos como los obtenidos en esta investigación con los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta y con el polisulfuro de calcio, respuestas
que se dan aún con incidencias naturales de la enfermedad elevadas (69,6%),
es decir que aún en alta presencia del inóculo natural se pueden reducir la
incidencia de la enfermedad con la aplicación de los hidrolatos y del polisulfuro
de calcio, es importante remarcar que en los reportes citados no se menciona
el tipo de material (clones, híbridos) utilizado en la realización de esos ensayos,
ya que como reporta Phillips-Mora, et al., 2005 existe un componente genético
de tolerancia del cacao al patógeno y según los datos para el clon en el que se
realizó el presente estudio es moderadamente resistente, factor que sumado al
buen manejo agronómico de la plantación y a la aspersión de los hidrolato y del
polisulfuro de calcio, permitió bajar substancialmente la incidencia de la
enfermedad.
110
comportamiento con 1485,36 kg de cacao seco por hectárea, seguido del
hidrolato de canela con 1468,64 kg, el de clavo con 1249,44 kg y 1216,56 kg
para el hidrolato pimienta, valores significativamente mayores a los mostrados
por los testigos ya que el testigo cultural registró 449,46 kg mientras que en el
testigo absoluto fue de 142,48 kg de cacao seco/ha.
1600
1400
1200
1000
800
g/planta
600
400
200
0
Canela Clavo Pimienta Polisulfuro Testigo Testigo
Hidrolato Hidrolato Hidrolato de calcio cultural absoluto
111
datos de producción, situación que puede ser similar a los hidrolatos de clavo,
canela y pimienta, ya que existen reportes de que el hidrolato de la hoja canela
al 50% tiene efecto insecticida sobre Selenothrips rubrocinctus (Aguilar, 2008),
y Zebadua, 2008 reporta efecto de repelencia del hidrolato de la semilla de
pimienta sobre Toxoptera aurantii. Es importante señalar que tampoco se
presentó marchitez o pérdida de los frutos por quemazón debida a una posible
fitotoxicidad de los productos.
Según los reportes dados por el SIAP, 2012 de la SAGARPA, los rendimientos
los rendimientos promedio de los años 2005 al 2011 han estado entre los 540 a
340 kg/ha, valor similar al registrado en el manejo de tipo cultural, pero
inferiores a los obtenidos con el uso de los hidrolatos, ya que para el caso de la
pimienta fue de 760 kg/ha, clavo con 780,9 kg/ha, canela 917,19 kg/ha y del
polisulfuro de calcio con 928,35 kg/ha.
112
dólares por hectárea. Además se contemplaron los costos variables para el
caso del testigo cultural, se cuantificó el valor por concepto de mano de obra
para la eliminación semanal de frutos enfermos con un valor de 325 dólares/ha,
que sumado al costo por labores culturales da un valor total para el tratamiento
del testigo cultural de USD 625 por hectárea (Cuadro 12).
Se incluyó el costo por mano de obra local requerida para la aspersión de los
productos, así como de la recolección y poscosecha de la producción obtenida
en cada uno de los tratamientos evaluados, de esta manera se sumaron a los
costos de mano de obra obtenidos anteriormente dando el total del costo para
cada tratamientos, siendo el más económico el testigo absoluto con USD
573,45, seguido por el testigo cultural con USD 868,65, el polisulfuro de calcio
con USD 1337,5, el hidrolato de clavo con USD 1537,5 y los de mayor costo
113
fueron los tratamientos con aplicación de los hidrolatos de canela y pimienta
con un valor de USD 1887,5.
Por concepto de ingresos por venta de las semillas de cacao secas obtenidas
en una hectárea (Cuadro 14), se tomó el valor promedio de venta en la zona el
cual fue de USD 4,6875, siendo el testigo absoluto el de menor ingreso con
USD 417,42, seguido por el testigo con manejo cultural USD 1316,48; los
tratamientos con los hidrolatos y el polisulfuro a pesar que fueron los de
mayores costos de producción son los generaron mayores ingresos, con
valores de USD de 3564,14, 3660,47 y de 4302,66, para los hidrolatos de
pimienta, clavo y canela respectivamente y el de mayor ingreso fue el
polisulfuro de calcio con USD 4351,64.
114
Cuadro 13. Costo de aplicación por hectárea de los tratamientos sobre el clon de cacao UNACH 130
Cuadro 14. Ingresos por hectárea por venta de semillas de cacao seco producido en cada uno de los tratamientos aplicados sobre
el Clon UNACH 130
Producción Precio venta Ingresos por
TRATAMIENTO cacao seco cacao venta
kg/ha/año USD/kg USD
Hidrolato canela 917,90 4,6875 4302,66
Hidrolato clavo 780,90 4,6875 3660,47
Hidrolato pimienta 760,35 4,6875 3564,14
Testigo polisulfuro de calcio 928,35 4,6875 4351,64
Testigo cultural 280,85 4,6875 1316,48
Testigo absoluto 89,05 4,6875 417,42
115
El análisis económico practicado para los tratamientos evaluados (Cuadro 15)
indica que la menor relación Beneficio: Costo (B/C) fue en el testigo absoluto con
0,8; es decir que por cada peso que se invierta no se recupera, ya que su valor es
menor de 1, por el contrario existen pérdidas de USD 126,33; con una rentabilidad
negativa de un 23,2%, situación que presentan en la actualidad los productores
quienes al tener baja producción no logran obtener ingresos ni siquiera para
reinvertir en sus plantaciones.
El Tratamiento del manejo cultural sigue siendo una alternativa para los
productores ya que su B/C fue de 1,5; es decir que por cada peso invertido
recuperan el peso más 0,5 y su rentabilidad fue de 51,5%; sin embargo esta
rentabilidad es inferior a la obtenida por los demás tratamientos, ya que con el
hidrolato de pimienta su B/C fue de 1,9, mientras su rentabilidad fue de 88,8%;
seguido por el hidrolato de canela con B/C de 2,3 y 127,95% de rentabilidad, las
mejores relaciones de B/C fueron de 2,4 y 3,3 y rentabilidades de 138,1% y
225,4% para el hidrolato de clavo y el polisulfuro de calcio respectivamente. Es
decir que la aplicación de cualquiera de los hidrolatos de pimienta, canela o clavo
o del polisulfuro de calcio permite reducir la incidencia de M. roreri y mejorar los
ingresos de los productores de cacao, siendo técnica y económicamente viable
este tipo de alternativas para el manejo de la moniliasis del cacao.
116
Según reportes de la SAGARPA el rendimiento promedio en México es de 350
kg/ha, sin embargo la Agencia para la Gestión de la Innovación (AGI, 2010), con
acciones en la Zona del soconusco, (región donde se realizó el presente ensayo)
reporta que los rendimientos actuales son de 167 kg/ha y que antes de la llegada
de la moniliasis eran de 350 kg/ha, datos que permiten apreciar que el problema
de la moniliasis solo agudizó la crisis presentada en el sector ya que los
rendimientos por hectárea son bajos al comparar los obtenidos por países como
Granada, Malasia, Indonesia (cercanos a 1 ton/ha) y Latino Americanos como El
Salvador, Bolivia, Guatemala, Perú y Colombia, con 1; 0,49; 0,48; 0,64 y 0,48
Ton/ha, respectivamente (ICCO, 2012).
Cuadro 15. Análisis económico de cada uno de los tratamientos aplicados sobre el
Clon UNACH 130.
117
Cuadro 16. Comparación de los Tiempos de Retención (TR) y porcentaje de
abundancia obtenidos en GC-MS de los extractos de canela y clavo
Benzofuran, 2-methyl
3 7.666 0.13332543 4265-25-2 C9H8O
Methylbenzofuran
118
3-Cyclohexen-1-ol, 4-
methyl-1(1-methylethyl)
4 8.149 0.15316138 562-74-3 C10H18O
Carvomenthenol
Terpinenol
3-Cyclohexene-1-
methanol, α,α, 4-trimethyl-,
5 8.527 0.26914739 (S) 10482-56-1 C10H18O
α-terpieol
2-Propanal, 3-phenyl
Aldehído cinámico
2-propen-1-ol, 3-phenyl
Alcohol cinámico
Eugenol
8 14.292 6.80477317 97-53-0 C10H12O2
Ácido carofilico
2-propen-1-ol, 3-phenyl-
,acetate
11 17.427 5.19400854 103-54-8 C11H12O2
Cinnamyl acetate
α –caryophyllene
12 18.274 0.40196693 6753-98-6 C15H24
humulene
2-propenal, 3-(2-
methoxyphenyl)
13 20.081 3.41242019 1504-74-1 C10H10O2
Cinnamaldehyde, o-
methoxy
Butylated hydroxytoluene
14 20.421 0.37842409 128-37-0 C15H24O
Ionol
119
15 22.565 0.35878054 Caryophyllene oxide 1139-30-6 C15H24O
Phenol, 2,6-dimethoxy-4-
(2-propenyl)
16 23.237 0.97234053 6627-88-9 C11H14O3
Methoxyeugenol
Benzyl Benzoate
17 28.686 3.26125845 120-51-4 C14H12O2
Ascabiol
Vanillin
2 15.148 0.39 121-33-5 C8H8O3
vanilla
Phenol, 2-methoxy-4-
(2-propenyl)-, acetate
3 20.376 2.271 93-28-7 C12H14O3
Eugenol acetato
Diethyl phthalate
4 22.758 9.16 84-66-2 C12H14O4
Anozol
2- propenal, 3-(4-
5 27.262 0.57 hydroxy-3- 458-36-6 C10H10O3
methoxyphenyl)
1,2-
benzenedicarboxylic
acid, mono (2-
6 96.911 86.97 4376-20-9 C16H22O4
ethylhexyl) ester
Mehp
120
Los cromatogramas de cada extracto se presentan en la Figuras 27 y 28.
Considerando la abundancia de picos en el caso del extracto de canela se realizó
el análisis con éter de petróleo y para clavo con cloroformo. Destacando las
siguientes observaciones: todos los picos no corresponden a compuestos
naturales, ya que para el caso del hidrolato de clavo el Diethyl phthalate es un
compuesto que esta presente en los plásticos y el 1,2- benzenedicarboxylic acido,
mono (2-ethylhxyl) ester, se encuentra en el PVC, por lo que se consideran
impurezas, éste último compuesto, se excluyó del porcentaje del total de los
compuestos del extracto, y mostrado así por el análisis del equipo en el cual se
analizó, el cual arrojo una suma de correlación del área de 999197900, y una
correlación del porcentaje del 100%. Mientras que para los otros cinco picos
incluido el Diethyl phthalate la suma de las áreas fue de 126110678, dando los
porcentajes mostrados en el Cuadro 18.
121
Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes solventes
122
Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes solventes
124
El hidrolato de canela también contiene acetato de cinamilo (5,19%), que según lo
reportado por Gupta, et al., 2008, potencializa la actividad de los demás
compuestos, además menciona que los mecanismos involucrados de estos tres
compuestos en la actividad fungistática o fungicida son a nivel del citoplasma, la
ruptura de la membrana citoplasmática y la inactivación y/o inhibición de enzimas
intra y extracelular. Estos eventos biológicos podrían tener lugar por separado o
simultáneamente, que culmina con la inhibición de germinación y el desarrollo del
micelio, también, pueden actuar sobre la pared celular fúngica, causando la
ruptura de b-1, 3 glucano, b-1, 6 glucano y polímeros de quitina (Cowan, 1999;
Brull y Coote, 1999 citados por Gupta, 2008).
Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de canela:
Aldehído cinámico.
Estos compuestos han sido reportados por varios autores como componentes del
aceite esencial del clavo, aunque en porcentajes diferentes ya que reportan al
eugenol como compuesto mayoritario con el 70 al 85%, y otros compuestos como
α y β cariofilenos, isoeugeno, acetato de eugenol y pequeñas cantidades de
ésteres, cetonas y alcoholes y se tienen reportes que el aceite esencial de clavo
de olor contiene 85 - 95% de eugenol y acetileugenol (Mazzafera, P. 2003,
Omidbeygi, 2007; Padrón, 2010; Matan y Matan, 2007; Kumar, et al., 2012).
Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de clavo:
Acetato de eugenol.
126
El efecto del hidrolato de clavo sobre M. roreri puede ser debido al Eugenol, que
es un compuesto fenólico de acción antiséptica con reconocido efecto inhibitorio
sobre diversos organismos, Lining Cai y Christine D. Wu (1996) comprobaron el
potencial como antimicrobiano de los extractos no polares del clavo contra
patógenos orales Gram negativos, bacterias como E. coli y Cepas de Salmonella
(Di Pascua et al., 2006) Dorman y Deans (2000) demostraron su efecto sobre 25
bacterias patógenas gram positivas y gam negativas a cultivos y al hombre,
también se tiene reporte de su efecto sobre microorganismos como nematodos,
insectos así como efecto antiviral (Mazzafera, 2003), Padrón, (2010) encontró que
los hongos fueron los microorganismos más susceptibles frente a la fracción con
actividad antimicrobiana del extracto hexánico del clavo, cuyo constituyente
principal fue el Eugenol. También se observó que los hongos más susceptibles
fueron los filamentosos, principalmente Trichophyton tonsurans y Sporotrix
schenckii; estas cualidades antifúngicas del clavo sobre cepas filamentosas
también han sido descritas por autores como Amiri A. et al., (2008) quienes
mencionan al eugenol como posible agente activo en formulaciones para evitar el
desarrollo de enfermedades posteriores a la cosecha de frutos como la manzana;
así mismo Costa (2011) reporta el efecto del clavo sobre F. oxysporum, y R.
solani, además cita a Amaral y Bara (2005) los que reportan efecto en la
reducción del crecimiento micelial del aceite esencial de clavo sobre Rhizopus
stolonifer. Ranasinghe et al., (2002), demuestra la acción inhibitoria del clavo
sobre Lasiodiplodia theobromae, C. musae y proliferatum, Fusarium y
Colletotrichum en banano.
127
soluble y fracturas que en última instancia exponer el contenido celular, incluyendo
el núcleo. Sin embargo Padrón (2010) reporta que en general, los aceites
esenciales poseen fuertes propiedades antibacterianas debido a que contienen un
alto porcentaje de compuestos fenólicos como el eugenol. Lo anterior sugiere que
su mecanismo de acción, sea similar al de otros compuestos fenólicos, por
alteración de la membrana citoplasmática, interrumpiendo la fuerza motriz de
protones (PMF), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación del
contenido celular. Se ha encontrado que a concentraciones subletales de eugenol
se inhibe la producción de amilasa y proteasas de B. cereus, deteriorando la pared
celular, lo que origina la lisis celular. Se cree que el grupo hidroxilo del eugenol al
que se unen ciertas proteínas, previene la acción enzimática en E. aerogenes
(Denyer y Hugo, 1991b; Sikkema et al., 1995.; Davidson, 1997; Wendakoon y
Sakaguchi, 1995 citados por Padrón).
Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del hidrolato de clavo.
128
CONCLUSIONES
El medio líquido preparado con extracto de cacao resultó ser el más eficiente para
promover la mayor al multiplicación y germinación de las conidias de M. roreri en
condiciones de laboratorio.
129
provocan la reducción de la incidencia y severidad externa e interna de la
enfermedad.
Aún con alta incidencia natural de M. roreri (69,6%) en una plantación monoclonal
de cacao los valores de reducción en la afectación de la enfermedad al aplicar en
campo los hidrolatos de clavo, canela y pimienta fueron del 98% y del 99% para el
polisulfuro de calcio, y el aumento en la producción de cacao entre un 800 y
1000% con respecto al testigo absoluto, lo que indica una alta viabilidad técnica de
estas alternativas dentro de un plan de manejo de la moniliasis del cacao.
130
RECOMENDACIONES
Efectuar evaluaciones in vitro de estos hidrolatos para las otras cepas de M. roreri,
las cuales aún no están presentes en México, pero que pueden igualmente
ingresar.
131
BIBLIOGRAFÍA
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141
ANEXOS
142
Anexo 1.Produccion Mundial de cacao
Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre
el crecimiento de M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 37 69548,86842 1879,69915 23041,5 0,0001
Error 152 12,40000 0,08158
Total 189 69561,26842
Coeficiente de Variación 1,521386
143
Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre
el crecimiento de M. roreri.
Crecimiento
TRATAMIENTOS mm Tukey*
Canela hoja hidrolato 0 O
Canela hoja presurizado 0 O
Canela hoja aeróbico 0 O
Canela corteza hidrolato 0 O
Pimienta hoja hidrolato 0 O
Pimienta hoja presurizado 0 O
Pimienta semilla hidrolato 0 O
Pimienta semilla presurizado 0 O
Clavo hoja hidrolato 0 O
Clavo flor hidrolato 0 O
Clavo flor presurizado 0 O
Clavo flor aeróbico 0 O
Clavo flor anaeróbico 0 O
Orégano hidrolato 0 O
Maguey hidrolato 0 O
Jengibre hidrolato 0 O
Testigo Químico 0 O
Canela hoja anaeróbica 11,40 N
Canela corteza presurizado 11,80 N
Clavo hoja presurizado 21,00 M
Pimienta hoja anaeróbica 22,20 L
Orégano aeróbica 22,80 KL
Canela corteza anaeróbica 23,20 K
Pimienta hoja aeróbica 26,20 J
Pimienta semilla anaeróbica 29,80 I
Jengibre presurizado 29,80 I
Pimienta semilla aeróbica 32,20 H
Orégano presurizado 33,00 G
Jengibre aeróbica 35,20 F
Clavo hoja anaeróbica 39,80 E
Maguey presurizado 43,60 D
Jengibre anaeróbica 44,60 C
Clavo hoja aeróbica 45,00 C
Orégano anaeróbica 45,00 C
Canela corteza aeróbica 46,80 B
Maguey aeróbica 50,00 A
Maguey anaeróbica 50,00 A
Testigo absoluto 50,00 A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
144
Anexo 5. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre
la formación de conidias de M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 37 3,5876493 9,6963495 46066,5 0,0001
Error 152 3,199389 2,1048612
Total 189 3,5879692
Coeficiente de Variación 1,833237
145
Anexo 7. Análisis de varianza para extractos a cuatro concentraciones sobre el
crecimiento de M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 33 76595.200 2321.067 554.187 0,0001
Error 136 6.40000 0.04706
Total 169 76601.60000
Coeficiente de Variación 0.881831
146
Anexo 9. Análisis de varianza para extractos de clavo, jengibre, orégano y
maguey, a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 33 76023.112 2303.731 242.573 0,0001
Error 136 1291.600 9.497
Total 169 77314.712
Coeficiente de variación 1,026308
147
Anexo 11. Análisis de varianza para extractos de canela y pimienta evaluados a
cuatro concentraciones sobre la formación de conidias de M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 33 2168724451892406000 65718922784618300 113.091 0,0001
Error 136 79031604559875000 581114739410845
Total 169 2247756056452281000
Coeficiente de variación 3,247439
148
Anexo 13. Análisis de varianza para extractos a cuatro concentraciones sobre la
formación de conidias de M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
33 2352164728993844000 71277719060419500 87.079 0,0001
Tratamiento
136 111321778279483300 818542487349142
Error
169 2463486507273327000
Total
Coeficiente de variación 5,643576
149
Anexo 14. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentraciones sobre la
producción de conidias de M. roreri.
150
Anexo 15. Análisis de varianza de productos de síntesis química sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de disco de papel.
FV GL SC CM F P>F
FV GL SC CM F P>F
151
Anexo 18. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0,05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante
el Método de discos de papel.
DIAMETRO DE
EXTRACTOS TUKEY*
INHIBICION (mm)
Orégano hidrolato 0,00 A
Orégano presurizado 0,00 A
Orégano F. Aeróbico 0,00 A
Orégano F. Anaeróbico 0,00 A
Maguey hidrolato 0,00 A
Maguey presurizado 0,00 A
Maguey F. Aeróbico 0,00 A
Maguey F. Anaeróbico 0,00 A
Jengibre hidrolato 0,00 A
Jengibre presurizado 0,00 A
Jengibre F. Aeróbico 0,00 A
Jengibre F. Anaeróbico 0,00 A
Clavo hoja hidrolato 0,00 A
Clavo hoja presurizado 0,00 A
Clavo hoja F. Aeróbico 0,00 A
Clavo hoja F. Anaeróbico 0,00 A
Canela corteza F. aeróbico 0,00 A
Canela corteza F. anaeróbico 0,00 A
Pimienta hoja hidrolato 0,00 A
Pimienta hoja presurizado 0,00 A
Pimienta hoja F. aeróbico 0,00 A
Pimienta hoja F. anaeróbico 0,00 A
Pimienta semilla presurizado 0,00 A
Pimienta semilla F. aeróbico 0,00 A
Pimienta semilla F. anaeróbico 0,00 A
Canela corteza presurizado 7,00 B
Canela hoja presurizado 9,50 C
Clavo flor F. aeróbico 11,00 CD
Canela hoja F. anaeróbico 11,50 D
Clavo flor presurizado 13,50 E
Clavo flor F. anaeróbico 14,50 EF
Pimienta semilla hidrolato 14,50 EF
Canela corteza hidrolato 16,00 F
Canela hoja F. aeróbico 21,50 G
Testigo quimico Ziram 22,00 G
Clavo flor hidrolato 22,50 G
Canela hoja hidrolato 22,50 G
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Total 47 706,313
Coeficiente de variación 0,056194
152
Anexo 20. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para productos de síntesis química evaluados sobre la
producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de
papel Kirby-Bauer.
Diámetro de
PRODUCTOS DE SINTESIS QUIMICA inhibición Tukey*
(mm)
Ranman 20 µL 0,00 A
Ranman 50 µL 0,00 A
Eco 720 20 µL 3,00 B
Eco 720 50 µL 4,50 BC
Barrida 20 µL 5,00 BCD
Tamis 20 µL 5,25 BCD
Tamis 50 µL 6,00 CD
Ridomil 20 µL 6,00 CD
Barrida 50 µL 7,25 D
Ridomil 50 µL 7,25 D
Ziram 20 µL 10,00 E
Ziram 50 µL 14,00 F
FV GL SC CM F P>F
153
Anexo 22. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante
el Método de discos de papel Kirby-Bauer modificado.
DIAMETRO DE
EXTRACTO TUKEY*
INHIBICION (mm)
Orégano hidrolato 0,00 A
Orégano presurizado 0,00 A
Orégano F. Aeróbico 0,00 A
Orégano F. Anaeróbico 0,00 A
Maguey hidrolato 0,00 A
Maguey presurizado 0,00 A
Maguey F. Aeróbico 0,00 A
Maguey F. Anaeróbico 0,00 A
Jengibre hidrolato 0,00 A
Jengibre presurizado 0,00 A
Jengibre F. Aeróbico 0,00 A
Jengibre F. Anaeróbico 0,00 A
Clavo hoja hidrolato 0,00 A
Clavo hoja presurizado 0,00 A
Clavo hoja F. Aeróbico 0,00 A
Clavo hoja F. Anaeróbico 0,00 A
Canela corteza presurizado 0,00 A
Canela corteza F. aeróbico 0,00 A
Canela corteza F. anaeróbico 0,00 A
Pimienta hoja hidrolato 0,00 A
Pimienta hoja presurizado 0,00 A
Pimienta hoja F. aeróbico 0,00 A
Pimienta hoja F. anaeróbico 0,00 A
Pimienta semilla presurizado 0,00 A
Pimienta semilla F. aeróbico 0,00 A
Pimienta semilla F. anaeróbico 0,00 A
Canela hoja hidrolato 0,00 A
Canela hoja presurizado 0,00 A
Canela hoja F. aeróbico 0,00 A
Canela hoja F. anaeróbico 0,00 A
Clavo botón floral presurizado 0,00 A
Clavo botón floral F. anaeróbico 0,00 A
Clavo botón floral F. aeróbico 0,00 A
Pimienta semilla hidrolato 8,00 B
Clavo semilla hidrolato 9,00 C
Canela corteza hidrolato 15,50 D
Testigo químico ziram 16,00 D
154
Anexo 23. Análisis de varianza (Anova), del efecto de medios con sucrosa al 2% y
con extracto de cacao en el número de conidias totales de M. roreri, de
las 12 a las 72 horas.
Conidias
Totales FV GL SC CM F P>F
Horas
12 horas Tratamientos 2 1,2888721911316,660 6,444360955658330 Infin 0,344
Error 9 0 0 0,063
Total 11 1.2888722
Coeficiente de variación 0
Error 9 0 0
Total 11 1.3338055
Coeficiente de variación 0
Error 9 0 0
Total 11 2.0492753
Coeficiente de variación 0
Error 9 0 0
Total 11 1.2365064
Coeficiente de variación 0
155
Anexo 24. Análisis de varianza (Anova), del efecto medios con sucrosa al 2% y
con extracto de cacao en el número de conidias germinadas de M. roreri,
de las 12 a las 72 horas.
Conidias
Germinadas FV GL SC CM F P>F
Horas
12 horas Tratamientos 2 398988635417 199494317708 1,065 0,0001
Total 11 398988652279
Total 11 456744810817
Total 11 355104168167
Total 11 395182294217
156
Anexo 25. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,
clavo y pimienta en el número de conidias totales de M. roreri, de las 12 a
las 96 horas.
Conidias
Totales FV GL SC CM F P>F
Horas
12 horas Tratamientos 5 1,4372767 287455347222 11826,7 0,001
Total 17 1,4375684
C. V. 0.601126
Total 17 1,5845
C. V. 2.232007
Total 17 1,8834508
C. V. 0.614838
Total 17 1,8320319
C. V. 0.771145
Total 17 1,676658360
C. V. 0.976612
157
Anexo 26. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del
efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre
la cantidad de conidias de M. roreri.
72 96
12 horas 48 horas
24 horas horas horas Tuk
Tratamiento Conidias/m Tukey* Tukey* Conidias/mL Tukey* Tukey*
Conidias/mL x106 Conidias/mL Conidias/m ey*
L x106 x106
x106 L x106
Clavo
semilla 112,08 B 106,66 B 110,27 A 79,16 B 78,19 B
Hidrolato
Pimienta
semilla 52,90 E 56,27 D 41,89 D 36,59 D 34,84 E
Hidrolato
Canela
corteza 50,16 F 40,94 E 24,27 F 25,32 F 11,89 F
Hidrolato
Testigo 75,69
114,44 A 84,58 C 70,13 C 64,16 C C
químico
Polisulfuro
59,44 D 42,50 E 36,94 E 29,16 E 39,86 D
de calcio
Testigo
104,16 C 115,69 A 100,0 B 115,13 A 98,88 A
absoluto
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Anexo 27. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,
clavo y pimienta en el número de conidias germinadas de M. roreri, de las
12 a las 96 horas.
Conidias
germinadas FV GL SC CM F P>F
Horas
12 horas Tratamientos 5 390483333333 78096666667 8996,74 0,001
Error 12 104166666,67 8680555,5556
Total 17 390587500000
C. V. 1,537189
24 horas Tratamientos 5 940062500000 188012500000 22561,5 0,001
Error 12 100000000 8333333,3333
Total 17 940162500000
C. V. 1,337491
48 horas Tratamientos 5 505406448303 101081289661 11593,5 0,001
Error 12 104625926 8718827,1667
Total 17 505511074229
C. V. 1,912436
72 horas Tratamientos 5 102737500000 20547500000 1408,97 0,001
Error 12 175000000 14583333,333
Total 17 102912500000
C. V. 4,537204
96 horas Tratamientos 5 1500730735769676 30014614715 1010,36 0,001
Error 12 356481481 29706790,1234
Total 17 153637888391
C. V. 4,34516
158
Anexo 28. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del
efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre
la cantidad de conidias germinadas de M. roreri.
12
72 96
horas 24 horas 48 horas
horas horas
Tratamiento Conidia Tukey* Conidias/ Tukey* Conidias/mL Tukey* Tukey* Tukey*
Conidias/ Conidias/
s/mL mL x106 x106 6 6
6 mL x10 mL x10
x10
Clavo semilla
9,02 D 7,36 D 8,05 D 5,97 C 2,91 C
Hidrolato
Pimienta
semilla 9,13 D 15,25 C 12,23 C 10,25 B 10,65 B
Hidrolato
Canela corteza
28,96 B 31,28 B 17,45 B 5,91 C 1,98 C
Hidrolato
Testigo
19,44 C 5,83 E 3,33 E 1,66 E 0,83 C
químico
Polisulfuro de
3,19 E 0,41 F 1,38 F 1,94 D 1,80 C
calcio
Testigo
46,52 A 68,19 A 50,83 A 24,30 A 26,52 A
absoluto
FV GL SC CM F P>F
9 23,810 2,646 7,366 0,0001
Tratamiento
90 32,323 0,359
Error
99 56,133
Total
Anexo 30. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del
Porcentaje de Incidencia de M. roreri en frutos de cacao asperjados con
hidrolatos de clavo, canela y pimienta.
159
Anexo 31. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad Externa (ISE) del
efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao
inoculados con M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 9 1.902 0.211 3.204 0,0001
Total 99 7.840
C.V. 31.22715
Anexo 32. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad Interna (ISI) del
efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao
inoculados con M. roreri.
FV GL SC CM F P>F
Total 99 12.643
C.V. 31.48399
Anexo 33. Porcentaje de mazorcas afectadas con M. roreri por tratamiento y sus
índices de severidad interna (ISI) y externa (ISE) después de 60 días de
la inoculación artificial con 9 x 104 conidias*mL-1. Tapachula, Chiapas –
México.
PORCENTAJE DE MAZORCAS
TRATAMIENTO INDICE Grados de la escala
0 1 2 3 4 5
Clavo hidrolato Aplicado Antes de la ISI 57,14 28,57 0 0 14,28 0
inoculación ISE 71,73 0 0 28,57 0 0
Canela hidrolato Aplicado Antes de la ISI 71,42 0 28,57 0 0 0
inoculación ISE 85,72 0 0 14,28 0 0
Pimienta hidrolato Aplicado Antes de la ISI 75 25 0 0 0 0
inoculación ISE 75 25 0 0 0 0
Polisulfuro de calcio Aplicado Antes de la ISI 100 0 0 0 0 0
inoculación ISE 100 0 0 0 0 0
Clavo hidrolato Aplicado Después la ISI 55,55 22,22 0 11,11 0 11,11
inoculación ISE 77,77 11,11 0 0 0 11,11
Canela hidrolato Aplicado Después la ISI 66,7 0 0 16,66 16,66 0
inoculación ISE 83,4 0 0 16,66 0 0
Pimienta hidrolato Aplicado Después la ISI 25 50 0 0 0 25
inoculación ISE 100 0 0 0 0 0
Polisulfuro de calcio Aplicado Después la ISI 100 0 0 0 0 0
inoculación ISE 100 0 0 0 0 0
Testigo sin inocular ISI 100 0 0 0 0 0
ISE 100 0 0 0 0 0
Testigo inoculado ISI 0 37,5 12,5 25 25 0
ISE 0 87,5 12,5 0 0 0
160
Anexo 34. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,
clavo y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao.
VARIABLE FV GL SC CM F P>F
Incidencia Total Tratamiento 5 3.33237200 0.66647440 13308.1 0,0001
Error 24 0.00120193 0.00005008
Total 29 3.33357392
C. V. 0.561083
Incidencia Chilillos Tratamiento 5 0.82589020 0.16517804 614.36 0,0001
Error 24 0.00645271 0.00026886
Total 29 0.83234291
C. V. 1.135432
Incidencia Mazorcas Tratamiento 5 2.07973912 0.41594782 10673.2 0,0001
Error 24 0.00093531 0.00003897
Total 29 2.08067443
C.V. 0.476864
Anexo 35. Análisis de varianza (Anova), del efecto en la producción de cacao seco
de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo
de M. roreri, en una plantación comercial.
FV GL SC CM F P>F
Tratamiento 5 8013637,039 1602727,408 8090,18 0,0001
Error 24 4754,588 198,108
Total 29 8018391,627
C. V. 1,404712
161
Anexo 36. Análisis de sensibilidad de los tratamientos para diferentes niveles de
rendimiento de cacao.
162