Isolasi dan Uji Kualitatif Hidrolisat Jamur Penghasil Enzim Selulase dari Tanah
Tumpukan Ampas Tebu
ABSTRACT
A Study on the isolation and qualitative analysis of cellulose producer fungus from waste product soil of
Saccharum officinarum in Tabek Patah West Sumatera has been done by using Czapek Dox Agar (CDA)
selective media. The selulolitic ability test of this isolated fungus was done by giving the congo red solution on
the surface of medium that was enriched with Carboxy Methyl Cellulose, the formation of transparent area
around the colonies showed that the fungus has the capability to decomposed the cellulose. The hydrolitic
enzyme in glucose form was analyed using Fehling solution and Thin Layer Chromatography. The result from
this research showed that the sample consisted of two species of decomposed cellulose fungus Aspergillus
terreus Thom and Rhizopus sp.
mengandung selulosa maka kemungkinan jamur kemudian ditambahkan air suling sampai 1 liter.
pengurai selulosa terdapat disana. Lalu dipanaskan sampai homogen. Selanjutnya
o
disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C,
Metodologi Penelitian tekanan 15 lbs selama 15 menit.
C. Medium Potato Broth (PB) – CMC 1 %
Alat dan Bahan Sebanyak 200 g kentang yang telah dikupas dan
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu diiris kecil direbus dengan 500 ml air suling
tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer berbagai selama lebih kurang satu jam, lalu disaring.
ukuran, gelas ukur berbagai ukuran, pinset, pipet Kemudian filtrat ditambahkan 10 g CMC lalu
mikro, pipet tetes, jarum ose, lampu spiritus, ditambahkan air suling ad 1 liter. Kemudian
timbangan analitik, spatel, kaca objek dan kaca media dipanaskan sambil diaduk sampai
®
penutup, mikroskop (ZEIZZ ), kapas, inkubator homogen. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada
® ® o
(Galenkamp plus ), autoklaf ( All American ), hotplate suhu 121 C tekanan 15 lbs selama 15 menit
®
( IEC ), lemari aseptis, Laminar Air Flow Cabinet (Atlas, 1993)
®
(ESCO ), lemari pendingin, vortex, sentrifugator,
kertas pH, plat KLT, dan lampu UV. Pembuatan Reagen
Bahan – bahan yang digunakan untuk a. Congo red 0,1 %
melakukan penelitian ini yaitu sampel tanah, medium Sebanyak 0,1 g serbuk congo red dilarutkan
Czapex Dox Agar (CDA), medium Carboxy Methyl dalam 100 ml alkohol 70 %.
Celluloce Agar (CMCA), medium Potato Broth (PB) – b. α-nafthol 1 %
CMC 1%, alkohol 70 %, larutan NaCl fisiologis steril Sebanyak 1 g serbuk α-nafthol dilarutkan dalam
(otsuka), air suling steril, congo red, reagen Fehling 100 ml etanol.
A, reagen Fehling B, etanol, butanol, air suling, c. Fehling A
larutan α-naftol, larutan lactophenol cotton blue dan Sebanyak 6,969 g CuSO4 . 5 H2O dilarutkan
larutan D-glukosa. dalam 100 ml air suling.
d. Fehling B
Prosedur dan Cara Kerja Sebanyak 35 g K Na – tartrat dan 10 g NaOH
dilarutkan dalam 100 ml air suling.
Pengambilan Sampel e. Larutan BEA (4:1: 2,2)
Sampel tanah tumpukan ampas tebu diambil Sebanyak 40 ml n-butanol, 10 ml etanol dan 22
secara acak pada satu lokasi di daerah Tabek Patah ml air dikocok baik –baik dalam corong pemisah
Sumatera Barat dengan 5 titik pengambilan. Tanah (Kanti, 2005 ; Sudaryati, 1993 ; Auterhoff, 1987)
sampel diambil pada kedalaman 10 – 15 cm dari
permukaan tanah pada masing-masing titik Pengolahan Sampel Tanah
pengambilan. Sebanyak 10 gram sampel dimasukkan
Sterilisasi Alat - alat kedalam erlenmeyer yang telah berisi NaCl fisiologis
Alat – alat yang akan digunakan disterilkan terlebih ad 100 ml. Lalu diaduk dan didapatkan pengenceran
-1
dahulu harus dicuci bersih dan kering, untuk alat – 10 . Dari pengenceran ini dipipet 1 ml masukkan ke
o
alat gelas disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C tabung reaksi yang sudah berisi 9 ml NaCl fisiologis
-2
tekanan 15 lbs selama 15 menit. Spatel, jarum ose, dan didapatkan pengenceran 10 , dilakukan sampai
-8
dan kaca objek disterilkan dengan cara melewatkan pengenceran 10 . Suspensi tanah dengan
–6 –7 –8
diatas nyala bunsen selama 30 detik. Ruangan dan pengenceran 10 , 10 , 10 digunakan untuk
lemari kaca aseptis disterilkan dengan larutan alkohol pembiakan jamur pada media pembenihan.
70 % sebelum dan sesudah kerja.
Isolasi dan Pemurnian Jamur Pengurai
Pembuatan Medium Perbenihan Selulosa (Indrawati, 2005 ; Kanti, 2005 ; Sudaryati,
A. Medium Czapek’s Dox Agar (CDA) 1993)
Medium Czapek’s Dox Agar (CDA) dibuat 1 ml suspensi tanah hasil pengenceran
dengan mencampurkan 3 g NaNO3, 1 g K2HPO4, dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu ditambahkan
0,5 g KCl, 0,5 g MgSO4.7H2O, 30 g Sukrosa, 15 12 ml medium CDA. Kemudian biarkan lempengan
g Agar dan air suling 1 liter. Selanjutnya agar memadat, setelah itu balikkan cawan petri,
o o
dipanaskan sampai homogen, pH larutan 5,5. inkubasi pada suhu 20 C – 25 C selama 120 jam.
o
kemudian disterilkan dalam autoklaf suhu 121 C, Setelah masa inkubasi, koloni yang tumbuh diamati.
tekanan 15 lbs selama 15 menit. Selanjutnya Koloni-koloni tunggal dari jamur dimurnikan dalam
digunakan untuk pemeliharaan dan identifikasi medium agar miring CDA, dengan bantuan jarum ose
jamur. dan diinkubasi kembali.
B. Medium Carboxy Methyl Celluloca Agar (CMCA)
Medium CMCA dipersiapkan dengan cara Seleksi Biakan Jamur Pengurai Selulosa
menimbang 10 g serbuk CMC dan 15 g Agar, (Indrawati, 2005 ; Kanti, 2005 ; Sudaryati, 1993)
6
J.Farm. And. Vol 1 (1) April 2013 Rahmi Yosmar dkk
Selanjutnya untuk melihat kemampuan jamur noda α-naftol. Adanya glukosa dalam sampel
dalam menghidrolisa selulosa maka dilakukan diidentifikasi dengan membandingkan tinggi noda
pembiakan pada medium CMCA dengan cara larutan pembanding dengan tinggi noda pada
inokulasi setempat. Biakan diinkubasi selama 4 hari sampel.
pada medium ini. Setelah itu ditetesi congo red yang
telah dilarutkan dengan pelarut alkohol 70 %. Jamur Hasil dan Pembahasan
yang menghasilkan selulase akan membentuk daerah
bening. Diameter daerah bening tersebut diukur pada Sampel tanah yang digunakan dalam penelitian
hari kelima inkubasi. ini merupakan tanah tumpukan ampas tebu yang
Identifikasi Jamur Pengurai Selulosa sudah mengalami pelapukan di Tabek Patah
(Lay, 1994 ; Larone, 1998). Sumatera Barat. Pengambilan sampel pada
Jamur yang diidentifikasi hanya yang kedalaman 10 – 15 cm dari permukaan tanah. Hal ini
memberikan diameter daerah bening yang tinggi, dilakukan karena pada kedalaman tersebut material-
dengan kata lain yang memberikan aktivitas yang material sisa tanaman dan hewan yang telah mati
besar dalam menguraikan selulosa. Identifikasi ini sudah tersebar merata di dalam tanah yang
dilakukan dengan cara : digunakan oleh mikroorganisme sebagai sumber
nutrisinya sehingga mikroorganisme banyak terdapat
A. Pengamatan Makroskopis pada permukaan tanah (Lay, 1994).
Pengamatan ini dilakukan dengan melihat bentuk Pengolahan sampel mula-mula dilakukan
dan warna koloni dari masing – masing jamur. dengan pengenceran bertingkat menggunakan
B. Pengamatan Mikroskopis larutan NaCl fisiologis, sampai diperoleh tingkat
-8
Pengamatan mikoroskopis dilakukan dengan pengenceran 10 . Pengenceran ini bertujuan untuk
membuat mikrokultur dari masing-masing isolat menghindari kesulitan pada tahap awal isolasi akibat
jamur, dengan cara sebagai berikut : terlalu banyaknya mikroorganisme pada sampel dan
Media CDA disiapkan dalam cawan petri dan larutan NaCl fisiologis dipakai untuk menghindari
biarkan memadat, kemudian dipotong dengan terjadinya lisis pada saat pengenceran (Dwijoseputro,
ukuran 0,5 x 0,5 cm (potongan blok agar). 1987).
-6 -7
Diambil satu bagian blok agar dan diletakkan Kemudian hasil pengenceran 10 , 10 , dan
-8
pada kaca objek dalam cawan petri yang dilapisi 10 diinokulasikan pada media CDA (Czapex Dox
tisu yang telah dibasahi dengan sedikit aquades Agar). Media CDA merupakan media selektif untuk
steril. Kemudian koloni sampel uji diinokulasikan jamur yang dapat menguraikan selulosa. Media
pada keempat sisi blok agar, kemudian ditutup selektif adalah media biakan yang mengandung
dengan kaca penutup. Semua pekerjaan paling sedikit satu bahan yang menghambat
dilakukan secara aseptis. pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan
0
Inkubasi pada suhu 20 - 25 C selama 5 – 7 hari. dan hanya menumbuhkan mikroorganisme yang ingin
Setelah masa inkubasi, kaca penutup diangkat diisolasi (Suriawiria, 1986 ; Volk, 1988).
dengan hati – hati lalu letakkan diatas kaca objek Dari hasil isolasi diperoleh lima isolat jamur
steril yang telah diberi satu tetes larutan seperti terlihat pada Tabel I, sedikitnya hasil yang
lactophenol cotton blue sebagai pewarna. didapatkan mungkin disebabkan karena pengaruh
Kemudian preparat diamati di bawah mikroskop. pengenceran dimana sampel terlalu encer sehingga
jamur tidak terbawa saat melakukan isolasi. Jumlah,
Uji Kualitatif Hidrolisat Enzim (Auterhoff, 1987 ; jenis dan aktivitas mikroorganisme dalam tanah
Markham, 1988) sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti iklim
Biakan murni jamur ditanam dalam media (curah hujan, angin dan suhu), tanah (keasaman,
o o
PB-CMC 1 % dan diinkubasi pada suhu 20 C – 25 kelembaban, suhu, dan hara) dan vegetasi (hutan,
selama 120 jam. Biakan kemudian disentrifus dan padang rumput dan belukar). Sehingga karena faktor
adanya glukosa diuji dengan menggunakan : –faktor tersebut diatas sangat sulit untuk menduga
1. Larutan Fehling jumlah, jenis dan aktifitas mikroorganisme (Lay,
Sebanyak 10 tetes reagen fehling A dan 10 tetes 1994).
reagen fehling B ditambahkan 3 ml larutan uji
lalu dipanaskan selama 20 menit maka akan
terbentuk endapan merah bata.
2. Kromatografi Lapis Tipis
Larutan uji ditotolkan pada plat KLT, begitu pula
larutan pembanding (larutan D-glukosa)
kemudian dikeringkan. Selanjutnya dimasukkan
kedalam chamber yang berisi pengembang
Butanol : Etanol : Air (4 : 1 : 2,2), kemudian
dikeringkan dan disemprot dengan penampak
7
J.Farm. And. Vol 1 (1) April 2013 Rahmi Yosmar dkk
Tabel I : Hasil isolasi jamur tanah pengurai selulosa Hal ini mengakibatkan daerah disekitar
mikroorganisme dengan media terlihat lebih kontras
No. Pengenceran Jumlah Jumlah koloni
dan daerah bening yang terbentuk akan semakin
koloni yang jelas (Lay, 1994).Jamur yang memberikan daerah
yang memberikan bening berarti jamur tersebut bersifat selulolitik.
Mikroorganisme penghasil selulase jika ditumbuhkan
tumbuh daerah bening
pada medium yang mengandung substrat selulosa
-6
yang dapat dihidrolisis akan mengeluarkan enzim
1. 10 4 1 tersebut disekeliling koloni. Hal ini ditandai dengan
adanya perubahan disekitar koloni tersebut.
-7
2. 10 1 1 Perubahan disekitar koloni tersebut dapat dilihat
dengan terbentuknya daerah bening.
-8
3. 10 0 0 Daerah bening terbentuk karena ikatan β 1,4
– Glikosida yang ada pada substrat CMCA diputus
oleh aktivitas enzim selulase yang dihasilkan oleh
Jamur-jamur yang tumbuh tersebut jamur tersebut (Indrawati, 2005 ; Sudaryati, 1993).
dimurnikan pada agar miring CDA selanjutnya diuji Ada dua jamur yang memiliki kemampuan selulolitik.
kemampuan selulolitiknya pada medium CMCA Dari hasil pengukuran diameter daerah bening terlihat
(Carboxy Methyl Celluloce Agar) dengan cara bahwa Isolat II memiliki aktivitas yang lebih besar
inokulasi setempat. Kemudian jamur yang tumbuh dalam menguraikan selulosa dibandingkan dengan
pada medium tersebut ditetesi dengan Congo red Isolat I seperti terlihat pada Gambar 1 dan Gambar 2.
0,1% dan parameter yang diamati adalah diameter Berbedanya diameter daerah bening yang
daerah bening yang terbentuk (Indrawati, 2005 ; dihasilkan berarti aktivitas selulase jamur
Kanti, 2005 ; Sudaryati, 1993). untukmenguraikan selulosa yang terdapat dalam
Congo red merupakan zat warna asam yang medium juga berbeda. Ini menunjukkan bahwa jamur
bermuatan negatif yang tidak dapat berikatan dengan yang memiliki diameter daerah bening terbesar
muatan negatif yang terdapat dalam dinding sel, mempunyai aktivitas selulolitik yang besar pula,
sitoplasma dan membran sel mikroorganisme. seperti terlihat pada Tabel II.
Sehingga zat warna ini tidak mewarnai
mikroorganisme tetapi mewarnai latar belakang
sediaan (media pembiakan).
Gambar 1 : Biakan jamur Aspergillus terreus Thom (Isolat I) yang ditetesi dengan congo red
setelah masa Inkubasi
Keterangan : a. Daerah bening
b. Biakan murni Isolat I
Gambar 2 : Biakan jamur Rhizopus sp. (Isolat II) yang ditetesi dengan congo red setelah masa
inkubasi
Keterangan :
a. Daerah bening
b. Biakan murni Isolat II
8
J.Farm. And. Vol 1 (1) April 2013 Rahmi Yosmar dkk
Gambar 3: Biakan murni Aspergillus terreus Thom (Isolat I) setelah lima hari inkubasi pada medium CDA
9
J.Farm. And. Vol 1 (1) April 2013 Rahmi Yosmar dkk
Gambar 4: Biakan murni Rhizopus sp. (Isolat II) setelah lima hari inkubasi pada medium CDA
10
J.Farm. And. Vol 1 (1) April 2013 Rahmi Yosmar dkk
12