Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE

Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura

Ingeniería en Biotecnología
Laboratorio de Enzimología
Práctica No 4

Autores:
 Castillo Fabricio
 Leiva Luis
 Villacrés Tamia
 Villafuerte Jessica
NRC: 4324

I. Tema:
Determinación del tipo de inhibición de la Succinato deshidrogenasa

II. Objetivos

General
.
Determinar el tipo de inhibición de la Succinato deshidrogenasa

Específicos
.

III. Introducción
La enzima succinato deshidrogenasa (SDH), ( EC1.3.5.1) es un complejo proteico
ligado a la membrana interna mitocondrial que interviene en la sexta reacción
del ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones, y que
contiene FAD (flavín-adenín-dinucleótido) unido covalentemente. Cataliza la
reacción: Succinato + ubiquinona(aceptor) ⇆ fumarato + ubiquinol(aceptor
reducido). Donde el succinato cumple un papel catalítico en la oxidación de sustratos
y no sólo es otro sustrato (Voet, Voet, & Pratt, 2009, pág. 530).

Ahora bien, la actividad enzimática se puede inhibir, es decir, reducir o eliminar. De

tal forma que la inhibición puede ser irreversible si el inhibidor se une covalentemente
a la enzima, casi siempre a un grupo de la cadena lateral de los amino ácidos en el
foco activo, quedando inactivada permanentemente. Pero también puede ser
reversible cuando el inhibidor puede disociarse de la enzima porque no se une por
enlaces covalentes. Y este tipo de inhibición puede ser competitiva, no-competitiva o
 acompetitiva, que se caracterizan por cinéticas distintas debido a la presencia del
inhibidor que modifica la actividad real que desempeña la enzima bajo condiciones
normales (Peretó, 2007, pág. 109).

En laboratorio se suele hacer pruebas para determinar el tipo de inhibición enzimática

en función de la actividad catalítica bajo condiciones específicas, así es común el uso
de azul de metileno como aceptor de electrones del complejo succinato-FADH2; el
ácido succínico para reducir al azul de metileno, ya que éste es reducido en lugar del
succinato; aceite para las muestras del aire del ambiente y así prevenir la oxidación
temprana del FADH2. Y ácido tricloroacético como inhibidor (Cañas, 2015, pág. 6).

En cuanto al ácido tricloroacético se sabe que este puede inhibir las reacciones
oxidativas en el ciclo de Krebs, ya que se tiene como antecedente que C-halógenos de
la seria alifática, flúor, bromo, yodo, cloro, y yodo acetato actúan sobre compuestos
proteicos sulfurados del tipo cistina de ciertas enzimas (Novoa, 1995, pág. 63).

IV. Metodología
Materiales

Materiales Reactivos
Tubos de ensayo Azul de metileno
Gradillas Solución de ácido tricloroacético
Vasos de precipitación Extracto de hígado
Espectrofotómetro Solución de Succinato
Baño María Aceite vegetal
Micropipetas de 10-100μL Agua destilada

Procedimiento

Se preparó 6 tubos (1 blanco y 5 problemas para cada concentración de sustrato).

Donde se utilizó la proporción de reactivos indicadas en las tabla 1 y 2, añadiendo a
cada tubo una solución de inhibidor (tricloroacético) a diferentes concentraciones
(s/n,1%,10%,15%,20%) y una solución de sustrato a diferentes concentraciones (0
.001%, 0.05%, 0.10%, 0.5%). Las mezclas de ensayo se incuban a 50 °C por 10 min.
Pasado el tiempo de incubación se toma 1 mL de cada tubo y se traspasa a otros tubos.
Enfriar y determinar la absorbancia a 664 nm de la mezcla problema utilizando como
blanco la mezcla de ensayo del de sustrato.

Tabla 1. Contenido y nomenclatura de los tubos de sustrato

 Reactivos Se añade 2 gotas de azul de metileno a las
concentraciones siguientes:
0 0 .001% 0.05% 0.10% 0.5%

Tubos Tubo 1B Tubo 2B Tubo 3B Tubo 4B

Agua destilada 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml

Extracto enzimático 1 ml 1 ml 1ml 1 ml

´

Tabla 2. Contenido y nomenclatura de los tubos problemas donde I es la concentración de inhibidor

Reactivos Se añade 2 gotas de azul de metileno a las

concentraciones siguientes:

0 0 .001% 0.05% 0.10% 0.5%

Tubos Tubo 1.I Tubo 2.I Tubo 3.I Tubo 4.I

Inhibidor 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Succinato (sustrato) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Extracto enzimático 1 ml 1 ml 1ml 1 ml

Aceite de vaselina 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml

Nota. Repetir el procedimiento para cada concentración de inhibidor. El tubo que no tiene inhibidor el
volumen se debe complementar con 2 ml de agua destilada

V. Resultados

Tabla 1, Absorbancias de acuerdo a la concentración de sustrato y porcentaje de inhibidor

Sin Inhibidor 1% 10% 15% 20%

[S]M Abs1 Abs2 Abs3 Abs4 Abs5
3,12647E-05 1,85 1,7 1,5 0,9 0,78
0,001563233 2,36 2,3 2,28 1,9 1,93
0,003126466 2,45 2,4 2,36 2,71 2,6
0,015632328 2,35 2,45 2,51 2,64 2,502
 Cálculo de la Ae de la enzima:
𝑨𝒃𝒔 ∗ 𝟎. 𝟎𝟎𝟒𝟔𝒅𝒎𝟑 ∗ 𝟏𝟎𝟔 𝒖𝒎𝒐𝒍 𝒖𝒎𝒐𝒍
𝑨𝒆 = 𝟑 = =𝑼
𝒅𝒎 𝒎𝒊𝒏
𝟗𝟓𝟎𝟎𝟎 ( ) + 𝟏𝒄𝒎 + 𝟏𝟎𝒎𝒊𝒏
𝒎𝒐𝒍 ∗ 𝒄𝒎

Calculo de Km y Vmax

Tabla 2, Datos para regresión por dobles recíprocos.

Sin Inhibidor
[S] V 1/[S] 1/V
3,12647E-05 0,008957895 31985 111,633373
0,001563233 0,011427368 639,7 87,5092115
0,003126466 0,011863158 319,85 84,2945874
0,015632328 0,011378947 63,97 87,8815911

Linealizacion de Dobles Recíprocos

120
y = 0.0008x + 86.293
100 R² = 0.9834

80
1/V

60
Series1
40 Linear (Series1)

20

0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
1/[S]

Tabla 3, Calculo de Vmax y Km a partir de la ecuación de la recta.

Vmax[umol/min] Km1[M]
0,01158843 9,27074E-06

Tabla 4, Dobles recíprocos de la V en base a la concentración de inhibidor

Sin I. Con inhibidor

1% 10% 15% 20%
1/[S] 1/V1 1/V2 1/V3 1/V4 1/V5
31985 111,6333725 121,483376 137,681159 229,468599 264,77146
639,7 87,5092115 89,7920605 90,5797101 108,695652 107,006082
319,85 84,2945874 86,0507246 87,5092115 76,2072838 79,4314381
 63,97 87,88159112 84,2945874 82,2795773 78,2279315 82,5426615

Comparacion de la linealización aplicando inhibidor

300

y = 0.0055x + 87.701
250
R² = 0.9838

200 y = 0.0045x + 86.09

R² = 0.9629
1/V

150
y = 0.0016x + 86.218
R² = 0.9858
100 y = 0.0011x + 86.322
R² = 0.9865
50
y = 0.0008x + 86.293
R² = 0.9834
0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
1/[S]

Tabla 5, Aumento del valor de Km [M]

Km1 Km2 Km2 Km3 Km4

9,27074E-06 1,2743E-05 1,85576E-05 5,22709E-05 6,27131E-05

Tabla 6, Vmax con poca variación

Vmax
[umol/min]
Sin inhibidor 0,01158843
1% 0,01158453
Con 10% 0,01159851
inhibidor 15% 0,01161575
20% 0,01140238

Dado:
Km aumenta valor y la Vmax permanece constante estamos hablando de una inhibición
competitiva.

VI. Discusión

VII. Conclusiones
VIII. Bibliografía

Cañas, A. O. (2015). Actividad de la enzima Succinato DH. Chiapas: Universidad Autónoma de

Chiapas.

Novoa, L. (1995). Algunos factores que influencian la actividad del ácido tricloroacético (TCA) en el
combate de malezas perennes. Costa Rica: Instituto Interamericano de Ciencias Agrícolas.

Peretó, J. (2007). Fundamentos de Bioquímica. Valencia: Universtát de Valencia.

Voet, D., Voet, J., & Pratt, C. (2009). Fundamentos de Bioquímica. Buenos Aires: Panamericana.