Anda di halaman 1dari 81

Prinsip-

PrinsipBudaya Sel
Istilah
• Kultur jaringan: istilah umum untuk memasukkan
budaya rgan dan kultur selKultur
•organ: budaya tiga dimensi dari jaringan yang tidak
diurgregasi mempertahankan beberapa dari semua
fitur histologis jaringan in vivo
• Kultur sel: budaya yang berasal dari sel-sel yang
terdispersi diambil dari jaringan asli, dari kultur
primer, atau dari garis sel atau strain sel oleh
agregasi enzimatik, mekanis, atau kimia.
• Histotypic culture: sel-sel telah dikumpulkan
kembali untuk menciptakan kembali jaringan tiga
dimensi seperti struktur misalnya. Dengan kultivasi
pada kepadatan tinggi di dinding saringan ...
• Organotypic: prosedur yang sama tetapi
mengkombinasikan sel-sel garis keturunan yang
berbeda misalnya keratinosit Epidermal dalam
kombinasi budaya dengan fibroblast dermal.
Penelitian yang menggunakan jaringan
kultur:
1. Aktivitas intraseluler: Replikasi dan
transkripsi DNA,
protein sintesis, energi kenalan,
metabolisme obat, 2. Flux intraseluler:
RNA, reseptor hormon translokasi dll 3.
Lingkungan interaksi: gizi, infeksi,
toksisitas,
karsinogenesis dll 4 Interaksi antar sel:
morpogenesis, kinetika proliferasi
sel dll. 5. Genetik: analisis genom,
manipulasi genetik dll 6. Produk sel: sekresi
produk, bioteknologi, disain
bioreaktor dll.
Apa itu kultur jaringan?
• Kultur in vitro
(mempertahankan dan / atau
berproliferasi) sel, jaringan atau
organ
• Jenis kultur jaringanKultur
-organ - Kultur jaringan - Kultur sel
Metode Eksperimental 2006 4
Kultur organ
• Seluruh embrio atau organ
dikeluarkan dari tubuh dan kultur
• Keuntungan
- Fungsi fisiologis normal dipertahankan. -
Sel tetap sepenuhnya terdiferensiasi.
• Kerugian
- Peningkatan tidak disarankan. -
Pertumbuhan lambat. - Eksplanasi segar
diperlukan untuk setiap
percobaan.
Metode Eksperimental 2006 5
Kultur Jaringan
• Fragmen dari jaringan yang
dipotong ditumbuhkan dalam media
biakan
• Keuntungan
- Beberapa fungsi normal dapat
dipertahankan. - Lebih baik daripada kultur
organ untuk ditingkatkan tetapi tidak ideal.
• Kekurangan
- Organisasi jaringan yang asli hilang.
Metode Eksperimental 2006 6
Kultur Sel
• Jaringan dari eksplan tersebar,
sebagian besar secara enzimatik,
menjadi suspensi sel yang kemudian
dapat dikultur sebagai monolayer
atau kultur suspensi.
• Keuntungan
- Pengembangan garis sel selama
beberapa generasi - Peningkatan skala
dimungkinkan
• Kerugian
- Sel mungkin kehilangan beberapa
karakteristik yang berbeda.
Metode Eksperimental 2006 7
EMP04 8
Apa itu Kultur&
JaringanTisu? Kultur
jaringan adalah nama umum untuk
mengangkat sel, jaringan atau organ
dari hewan atau tumbuhan dan
penempatan berikutnya ke lingkungan
buatan yang konduktif untuk
pertumbuhan
• Lingkungan ini biasanya terdiri dari
bejana kultur kaca atau plastik yang
cocok yang mengandung media
pendukung cair atau semi padat yang
memasok nutrisi penting untuk
kelangsungan hidup dan pertumbuhan.
• Ketika sel-sel dikeluarkan dari fragmen
organ, sehingga mengganggu
hubungan normal mereka dengan sel-
sel tetangga, itu disebutkultur sel.
eksperimentalMetode 2006

Mengapa kita
membutuhkan kultur
Sel?
• Penelitian
• Untuk mengatasi masalah dalam
mempelajari perilaku seluler seperti:
• efek pengganggu jaringan sekitarnya
• variasi yang mungkin timbul pada hewan di bawah
tekanan eksperimental
• Mengurangi penggunaan hewan
komersial atau berskala besar
• Produksi• Produksi bahan sel: vaksin,
antibodi , hormon
10
Aplikasi kultur sel
Metode Eksperimental 2006
11
Metode Eksperimental 2006

Keuntungan dari kultur


Sel
• Keuntungan:
• Kontrol mutlak terhadap lingkungan fisik
• Homogenitas sampel
• Lebih sedikit senyawa yang dibutuhkan
daripada pada model binatang
• Kerugian:
• Sulit dipelihara
• Hanya tumbuh dalam jumlah kecil jaringan
dengan biaya tinggi
• Dedifferentiation
• Ketidakstabilan, aneuploidi
12
Kelas Sel
Budaya • Kultur sel-sel hewan
biasanya dibagi menjadi 3 kelas:
1. Sel utama 2. Sel strain 3. dan jalur sel
1
Budaya
• Ketika sel-sel diangkat secara
operasi dari suatu organisme dan
ditempatkan ke dalam lingkungan
budaya yang sesuai yang akan
mereka lekatkan, bagi dan
kembangkan
• Mo St dari sel kultur utama memiliki
jangka hidup yang terbatas dari 5-10
divisi in vitro
• Karena rentang hidup mereka yang
terbatas, seseorang tidak dapat
melakukan eksperimen jangka
panjang dengan sel-sel ini.Sel-sel
•primer dianggap oleh banyak peneliti
untuk menjadi lebih fisiologis mirip
dengan in vivo. Sel
-
Primer
Kultur
• Ada dua metode dasar untuk
mendapatkan kultur primer:
1. Kultur eksplan:
• Potongan kecil jaringan yang menempel
(menggunakan gumpalan plasma atau fibrinogen)
ke gelas atau bejana kultur plastik yang diolah dan
direndam dalam media biakan
• Setelah beberapa hari sel-sel individual akan
bergerak dari jaringan yang menjelma keluar ke
permukaan atau substrat pembuluh kultur di mana
mereka akan mulai membelah dan tumbuh

1
-
Primer
Budaya
2. Disosiasi enzimatik:
• Lebih banyak digunakan
• mempercepat proses dengan menambahkan
mencerna (proteolitik) enzim seperti tripsin atau
kolagenase ke fragmen jaringan untuk melarutkan
semen yang menahan sel bersama-sama
• Ini menciptakan suspensi sel tunggal yang
kemudian ditempatkan kapal budaya nto yang
mengandung medium kultur dan dibiarkan tumbuh
dan membelah

1
-
Primer
Hayflick
Fenomena
• Sel akan terus tumbuh dan membelah
secara normal untuk jumlah lintasan
yang terbatas
• Ketika mereka sampai pada titik
tertentu bahkan jika mereka diberi
nutrisi yang sesuai, mereka hanya
berhenti membelah dan akhirnya akan
mati
• Tampaknya ada korelasi antara jumlah
maksimum bagian dan penuaan
• Jumlah bagian menurun ketika sel-sel
dipanen dari individu yang lebih tua

s'
2
StrainStrain
Sel •sel adalah sel yang telah
disesuaikan dengan tetapi, tidak seperti
garis sel, memiliki potensi pembagian
yang terbatas
• Setelah transfer serial sel primer,
pemilihan bertahap dapat terjadi sampai
jenis sel tertentu menjadi dominan
• Jika sel-sel ini terus tumbuh pada
tingkat konstan selama beberapa
bagian berturut-turut, sel-sel utama ini
disebut sebagai strain sel
• Sel-sel ini memiliki jangka hidup yang
terbatas dari 40-60 divisi in vitro
• Mereka berguna dalam produ
vaksinksi
-
3
GarisSel
• Jika sel-sel dalam strain sel mengalami
proses transformasi (perubahan spontan
atau diinduksi di kariotipe, morfologi atau
properti pertumbuhan) yang membuat
mereka "abadi“(mampu membagi tanpa
batas) mereka disebut garis sel
• Initidak diketahui bagaimana strain sel
diploid menjadi garis sel, meskipun
kejadian ini dapat ditiru oleh infeksi virus
onkogenik atau oleh paparan karsinogen
kimia.
• Garis Sel sering memiliki jumlah
kromosom abnormal dan mungkin
tumorigenik ketika diinokulasi ke hewan
yang rentan.
• Garis sel yang telah diturunkan dari tumor
sering tidak menunjukkan kontak-inhibisi
(penghambatan pertumbuhan di bawah
kondisi ramai), melainkan terus menumpuk-
up

-
Isolasi jalur sel untuk kultur in vitro
direseksi jaringan
sel atau jaringan kultur in vitro
kultur Primer
Sub-budaya Kultur sekunder
Sub-kultur Cell Line
Isolasi sel tunggal
Immortalization Subkultur berturut-turut Garis
sel klonal
Hilangnya kontrol pertumbuhan sel
Senescenc e
Garis sel yang berubah Garis
sel tak
terhingga Fibroblastik
Endotel

Sel morfologi sel bervariasi


tergantung pada jenis sel
Epitel
Neuronal
Morfologi Sel Kultur
• Kultur sel morfologi mengambil satu dari dua
bentuk:
- tumbuh dalam suspensi (sebagai sel tunggal atau
gumpalan kecil yang mengambang bebas)
• garis sel yang diturunkan dari darah (leukemia, limfoma)
- tumbuh sebagai monolayer yang melekat pada labu
kultur jaringan.
• sel-sel yang berasal dari jaringan padat (paru-paru, ginjal),
endotel, epitel, neuronal, fibroblast
Hela-Epithelial
BAE1-Endothelial
Experimental Methods 2006 22 MRC5-Fibroblast SHSY5Y-
Neuronal
Lingkungan kultur sel (in vitro)
Apa yang dibutuhkan sel untuk tumbuh?
• Substrat atau cairan (labu kultur sel atau
bahan perancah)
plastik dimodifikasi secara kimia atau dilapisi
dengan budaya protein ECM suspensi
• Nutrisi (media kultur)
• Lingkungan (CO
2,
suhu 37oC, kelembaban) ketegangan Oksigen
dipertahankan pada atmosfer tetapi dapat
bervariasi
• Sterility (teknik aseptik, antibiotik dan
antimikotik)
Mycoplasma diuji
aliran LaminarHood

Peralatan
24 Dr.Saba
Air FION
Untuk mengobati

Oppendori
WANI HIDE
TG ITnstad
Media Basal
• Mempertahankan pH dan osmolaritas (260-320
mOsm / L).
• Berikan nutrisi dan sumber energi.
Komponen Media Basal Garam Anorganik
• Menjaga osmolaritas
• Mengatur potensi membran (Na +, K +, Ca2 +)
• Ion untuk lampiran sel danenzim cofactor
indikator pH- Phenol Red
• Sekitar pertumbuhan sel yang optimal. pH 7.4
Buffer (Bikarbonat dan HEPES)
• Bikarbonat media buffering membutuhkanCO
2

atmosfer
• HEPES Kisaran buffer kimia yang kuat pH 7,2 - 7,6
(tidak memerlukan CO
2

)
Glukosa
• Energi

Lingkungan kultur sel (in vitro)


Lingkungan kultur sel (in vitro )
Komponen Media Basal
Keto asam (oxalacetate dan piruvat)
• Menengah dalam siklus Glikolisis / Krebs
• Keto asam ditambahkan ke media sebagai sumber
energi tambahan
• Menjaga metabolisme sel maksimum
Karbohidrat
• Sumber energi
• Glukosa dan galaktosa
• Rendah (1 g / L) ) dan tinggi (4,5 g / L) konsentrasi
gula dalam media basal.
Vitamin
• Prekursor untuk banyak faktor co
• B kelompok vitamin yang diperlukan untuk
pertumbuhan sel dan proliferasi
• Vitamin yang umum ditemukan dalam media basal
adalah riboflavin, thiamine dan biotin
Unsur Trace
• Seng , tembaga, selenium dan asam tricarboxylic
intermediate
Lingkungan kultur sel (in vitro)
Suplemen
L-glutamine
• Asam amino esensial (tidak disintesis oleh sel)
• En sumber ergy (siklus asam sitrat), digunakan dalam
sintesis protein
• Tidak stabil dalam media cair - ditambahkan sebagai
suplemen
Asam amino non-esensial (NEAA)
• Biasanya ditambahkan ke komposisi media dasar
• Sumber energi, digunakan dalam sintesis protein
• Dapat mengurangi beban metabolik pada sel
Faktor Pertumbuhan dan Hormon (misalnya: insulin)
• Merangsang transportasi glukosa dan pemanfaatan
• Penyerapan asam amino
• Pemeliharaan diferensiasi
Antibiotik dan Antimikotik
• Penicillin, streptomisin, gentamisin, amfoterisin B
• Mengurangi risiko kontaminasi bakteri dan jamur
• Sel dapat menjadi antibiotik yang tahan terhadap
perubahan fenotipe
• Lebih baik dihindari dalam kultur jangka panjang
Fetal Calf / Bovine Serum (FCS & FBS)
• Faktor pertumbuhan dan hormon
• Penyangga sel
aids • Mengikat dan menetralkan racun
• Lama penggunaan
• Agen infeksi (prion)
• Variabel Komposisi
• Mahal
• Masalah regulasi (untuk meminimalkan risiko)
Heat Inactivation (56oC selama 30 menit) - mengapa?
• Penghancuran komplemen dan imunoglobulin
• Penghancuran beberapa virus (juga serum yang
diiradiasi dengan sinar gamma)
! Berlebihan dapat merusak faktor pertumbuhan,
hormon & vitamin
dan mempengaruhi pertumbuhan
sel. Lingkungan kultur sel (in vitro)
Bagaimana kita membina sel di
laboratorium?
Bangkitkan kembali populasi sel beku Isolat dari
jaringan
Mempertahankan dalam budaya (teknik aseptik)
Subkultur (peralihan)
Hitung sel
Kriopreservasi
Kultur tingkat sel 2
sel kultur labu kultur khas
'Mr Frosty' Digunakan untuk membekukan sel
Kondisi Pertumbuhan
• 37 ° C Suhu tubuh
• 20% O
2

Respirasi optimal
• 5% buffer CO
ke 2
Bekerja menjaga dengan pH bikarbonat
medium
• Humidifikasi - Membantu mencegah
penguapan media kultur dari labu, yang
akan menghasilkan peningkatan tekanan
osmotik - tekanan atau kerusakan sel.
Apakah sel Anda
bahagia?
• Morfologi - mikroskop kontras
fase
• Ekspresi fungsi atau penanda
khusus
• Nomor sel, tingkat
pertumbuhan, viabilitas
- Haemocytometer -blue
TrypanPassaging Cells
Mengapa sel-sel lewat jalur?
• Untuk menjaga sel-sel dalam budaya (yaitu jangan
berlebihan)
• Untuk meningkatkan jumlah sel untuk eksperimen /
penyimpanan
Bagaimana?
• 70-80% konfluensi
• Cuci dalam PBS untuk mengangkat sel-sel mati dan
serum
• Trypsin mencerna interaksi permukaan-protein untuk
melepaskan sel (kolagenase juga berguna)
• EDTA meningkatkan aktivitas tripsin
• Resuspend dalam serum (menginaktivasi tripsin)
• Memindahkan suspensi sel encer ke labu baru
(media segar)
• Sebagian besar sel akan menempel di sekitar. 3-4
jam
Periksa confluency sel
Hapus menghabiskanmenengah
Cucidengan PBS
Inkubasi dengan tripsin / EDTA
resuspend dalam serum yang mengandungmedia
transferuntuk flask kultur
70-80% pertemuan 100% pertemuan
127,76
4378

14,30
Foçoğợg
85,47
HO

18.90
BAGIAN AA

16: 48_
1890_
16.48

100% konfluency
46% contuency
Transtection efficiency 194]

70% confluency
hep 3B-70% confluency
40%
TUN

Cut
Subculturing
• Suspension cells
• Monolayer / Adherent cellspemutusan
ikatan
- Diperlukanantar sel dan antar sel -
ke permukaan - Disosiasi mekanik (Sel)
Scraper) - Disosiasi proteolitik
• Trypsin / EDTA
• Nomor bagian
Mengapa sel-sel sel
cryopreserve?
• Mengurangi risiko kontaminasi mikroba.
Resuspend sel dalam serum yang mengandung media
• Mengurangi risiko kontaminasi silang dengan garis
sel lainnya.
• Mengurangi risiko pergeseran genetik dan
supernatan Centrifuge & Aspirate
perubahan morfologi.
• Penelitian dilakukan menggunakan sel pada bagian
rendah yang konsisten.
Sel resuspend dalam
Bagaimana? 10% DMSO di
FCS
• Fase log pertumbuhan dan> 90% viabilitas
• Sel-sel bagian & pelet untuk pertukaran media
Pindah ke Pembekuan beku di -80oCCryopreservant
•(DMSO) - mekanisme yang tepat tidak diketahui tetapi
mencegah pembentukan kristal es
• Bekukan pada -80oC - pembekuan cepat namun
'lambat'
• Nitrogen cair -196oC
Pindah ke tangki penyimpanan nitrogen cair
KriopreservasiSel
Pembekuan
• Tujuannya adalah untuk 'menyimpan' stok
sel pada bagian rendah untuk digunakan di
masa mendatang.
• Gunakan cryovial
• Cryoprotectant
- DMSO - Glycerol
• Pembekuan optimal
- 'Mr Frosty' / Cool Cell 1 ° C / menit dalam
-
80 ° C - Transfer ke nitrogen cair

Pencairan jumlah sel Manual
(Hemocytometer)
Diagram mewakili jumlah sel menggunakan hemositometer.
Jumlah sel otomatis
Cellometer memungkinkan Anda:
• Melihat morfologi sel, untuk konfirmasi visual setelah
penghitungan sel
• Memanfaatkan 300+ jenis sel dan pengaturan parameter
berbasis-wizard yang mudah
• Simpan gambar sampel dengan hasil yang aman di
komputer Anda, plus hasil autosave pada jaringan untuk
menambah kenyamanan dan perlindungan data
Kurva pertumbuhan ideal untuk sel
dalam budaya
Kontaminasi Sebuah
kontaminan kultur sel dapat didefinisikan sebagai
beberapa elemen dalam sistem budaya yang tidak
diinginkan karena kemungkinan efek sampingnya baik
pada sistem atau penggunaannya.
1-Chemical Contamination Media Incubator Air serum
2-Biological Contamination Bakteri dan ragi Virus Mycoplasmas
Kontaminasi silang oleh kultur sel lainnya
Bagaimana Cara Kontaminasi Kultur Sel Dapat Dikendalikan?
Kontaminasi
• Kontaminasi mikroba
- Bakteri, ragi, jamur, virus,
mycoplasma - Laminar Flow Hoods -
Teknik aseptik - Antibiotik - Tidak
bernyanyi!
• Kontaminasi Bahan Kimia • Kontaminasi
silang dengan saluran sel lain
-
2
x
Caco 2 untuk fe.pdf - Adobe Reader File Edit Lihat Dokumen Alat Jendela

O + + 1 16 1
Bantuan

1 39% -
139%

3
Temukan

Cari
Nutrisi dan Penelitian Ilmu Makanan
Vol 3, No 3, Jul-Sep 2016, halaman: 11-16

Asli Artikel
Evaluasi Bioavailabilitas Besi di Caco-2 Model Kultur: Modifikasi
Metode Asli Bahareh Nikooyeh ?, Tirang R. Neyestani * 1
1- Laboratorium Nutrisi Penelitian, Gizi Nasional dan Institut Penelitian Teknologi Pangan dan
Fakultas Ilmu Gizi dan Teknologi Pangan, Universitas Ilmu Kedokteran Shahid Beheshti, Teheran,
Iran

O pada Senin 27 Maret 2017


Diterima: Februari 2016
Diterima: Mei 2016
ABSTRAK Latar Belakang dan Tujuan: Dalam bahasa aslinya Metode in vitro untuk evaluasi
bioavailabilitas besi menggunakan model sel caco-2, pembentukan feritin oleh sel dianggap
sebagai indikator fungsional dari penyerapan dan pemanfaatan besi.

@
Kultur sel dan tes biokimia: Caco-2 sel di bagian 26-30 dibeli
dari Iran Pasteur Institute. Sel-sel dipindahkan ke piring 6-baik
di 50.000 sel / cm
2

pada
hari yang sama pembelian. Kemudian mereka diinkubasi di
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, D7777)
mengandung 10% serum janin anak sapi (FCS, Gibco, Inggris),
dan 1% campuran antibiotik-antijamur (Sigma-Aldrich, A5955)
pada 37 ° C dan 5% CO
2.

ediumnya diganti setiap 2-3 hari. Sel-sel itu, akhirnya,


digunakan untuk percobaan bioavailabilitas setelah 14 hari
inkubasi.
Untuk mempersiapkan sel-sel untuk penyerapan zat besi, media
dipindahkan dari sumur, dan sel-sel dicuci dengan 1 mL larutan
Hank (Sigma-Aldrich) dua kali. Kemudian mereka ditutupi
dengan 1 mL DMEM. Membran dialisis (cutoff: 15 kDa)
disiapkan oleh mendidih di 1mM Na
2

CO
3:

10 mM EDTA (1: 1, v / v) selama 30


menit dan kemudian dibilas di DDW. Sebuah sisipan dengan
membran dialisis disiapkan dimasukkan ke dalam setiap sumur
membuat dua bilik. 1,5 mL digest dipindahkan ke ruang atas.
Sampel dan standar diuji dalam rangkap tiga, dan satu sumur di
masing-masing plat digunakan sebagai kosong dengan
mentransfer DMEM alih-alih mencerna ke bilik atas sumur.
Piring itu mengantuk dan diinkubasi pada 37 ° C dan 5% CO
2

se
lama 120 menit. Kemudian sisipan dihapus dan sel-sel
diinkubasi di bawah kondisi yang sama lagi selama 22 jam.
Kemudian sel, setelah mengeluarkan
larutan di atas, dicuci dengan saline
buffer fosfat (PBS, pH 7.4) dua kali.
Setelah mengeluarkan buffer
pencuci, sel-sel dipanen
menggunakan 20 μL tripsin (0,2%
tripsin dalam 0,5% EDTA). Sel yang
dipanen disuspensikan dalam 2 mL
DDW dan kemudian disentrifugasi
pada 2000 g di RT selama 10 menit.
Supernatan dibuang, dan
sedimen itu disuspensikan kembali dalam
1 mL DWW. Kemudian sel-sel yang
tersuspensi dihancurkan menggunakan
60 detik homogenisasi pada 20000 rmp
di RT (Heidolph, Silent Crusher M,
Jerman). Lysate disentrifugasi selama 10
menit pada 2000 g di RT. Supernatan
dipindahkan ke microtube yang bersih
dan disimpan pada -80 ° C untuk
pemeriksaan feritin lebih lanjut
menggunakan tes immunosorbent
enzyme-linked (ELISA) (PishtazTeb,
Tehran, IR).
Memetakan kurva standar dan penentuanbesi
bioavailabilitas
In vitro pencernaan standar atau
roti
Digest

Analisis protein dan


kandungan feritin dalam sel caco-2 yang dipanen
Irun serapan dan sintesis feritin oleh sel caco-2

Gambar 1. Langkah-langkah evaluasi in vitro


bioavailabilitas besi menggunakan budaya sel caco-2.
Fermentabilitas Serat Pangan in vitro
• “Serat makanan adalah bagian tanaman yang dapat
dimakan atau karbohidrat analog yang tahan
terhadap pencernaan dan penyerapan di usus kecil
manusia dengan fermentasi lengkap atau parsial di
usus besar.
49 Dr.Saba
50 Dr.Saba
• In vitro fermentasi serat
makanan.
• Delapan substrat, satu atau
campuran dari dua DF (50:50) diuji.
• Secara singkat, 150 mg serat
makanan ditempatkan dalam tabung
tertutup 15 ml, kemudian
ditambahkan 9 ml media fermentasi
(1 L media yang mengandung 2,5 g
Tryptone, 125 μl larutan
mikromineral, 250 ml larutan buffer
karbonat, 250 larutan
makromineral, 1,25 ml 0,1% solusi
resazurine, dan solusi pengurangan
33,5 ml).
51 Dr.Saba


• Untuk inokulum, bubur feses
segar dari sukarelawan sehat
dikumpulkan dan diencerkan dalam
buffer fosfat untuk menghasilkan
10% (w / v) inokulum.
• Konsentrasi akhir inokulum adalah
1% (b / v) setelah pencampuran 1
ml inokulum 10% dengan 9 ml
media yang mengandung serat
makanan.
• Kontrol negatif yang hanya
mengandung media dan inokulum
feses disiapkan sebagai feses
kosong (FB).
• Semua proses 52 dilakukan di
Dr.Saba

ruang anaerobikdengan goyang (SL


ruang anaerobikdengan goyang (ruang
anaerobik SL Bacton IV)
53 Dr.Saba
Bubur feses segar dari sukarelawan sehat
54 Dr.Saba Digabung
dan diencerkan dalam buffer fosfat untuk
menghasilkan 10% (w / v) inokulum
55 Dr.Saba
• Secara singkat, 150 mg serat makanan ditempatkan dalam
tabung tertutup 15 ml, kemudian ditambahkan 9 ml media
fermentasi (1 L media yang mengandung 2,5 g Tryptone, 125 ml
larutan mikromineral, 250 ml larutan buffer karbonat, 250
larutan makromineral, 1,25 ml 0,1% larutan resazurin, dan
larutan pereduksi 33,5 ml).

• pH media yang mengandung serat makanan kemudian
diatur hingga pH 7,0.
Dr.Saba 56
Akhir konsentrasi inokulum adalah 1% (b / v)
setelah pencampuran 1 ml inokulum 10% dengan 9
ml media yang mengandung serat makanan.
57 Dr.Saba
Semua proses dilakukan di ruang dengan
goyang untuk
mempertahankan kondisi anaerobik yang
ditetapkan pada 37 oC selama 24 jam
58 Dr.Saba
Efek serat makanan pada th Isi SCFA dari supernatan fermentasi. Serat
makanan (5%) difermentasi dengan bakteri fecal manusia pada suhu
37oC selama 24 jam dalam kondisi anaerobik. P, I, C, IC, PC, PI, Cin
dan FB adalah pektin, inulin, selulosa, campuran selulosa inulin,
campuran selulosa pektin, campuran inulin pektin, ekstrak cincau dan
feses kosong, masing-masing.
D
b

59 Dr.Saba
S
C
F
A
t
o
t
a
l

(m
M
120
100
80
60
40
20
0
PIC IC PC PI Cin
FB)
c
c
b
b
b
a
a
cb
P
r
o
i
p
i
o
n
a
t
e
c
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

(m
M
12
10
8
6
4
2
0
PIC IC PC PI Cin FB

ef)
ab
f
cd cd
60

Dr.Saba
de
pengujian Terhadap
Jual Kanker
Proliferasi assay.
• Caco-2 sel dikultur dalam 96-well plate dengan
kepadatan 150000
sel / mL 1 hari sebelum pengobatan FS (hari 0),
kemudian diinkubasi selama 48
jam di media yang mengandung 20% FS. Untuk kurva
standar,serial 1: 2
pengencerandiulang untuk menghasilkan kurva
standar 80000-156 sel
per sumur, dalam volume akhir 100 μl (Young et al.,
2005).
62 Dr.Saba
• Setelah 48 jam, media pengobatan dihilangkan dan 100 uL /
well medium yang
mengandung 0,5 mg / mL larutan MTT ditambahkan ke setiap
well dan.inkubasi (37 ° C, 5%
CO 2) selama 1 jam (MTT) dimetabolisme). Formazan (produk
metabolik MTT)
diresuspensi dalam 80 μl 20% SDS dalam 0,02 M HCl dan
pelat diinkubasi dalam gelap
selama 1 jam dalam suhu kamar. Kepadatan optik dibaca
pada 570 nm denganback ground
absorbansipada 630 nm. Hasilnya dinyatakan sebagai
persentase pertumbuhan jumlah sel dalam
sumur yang mengandung media pengobatan dibandingkan
dengan pertumbuhan jumlah sel dalam sumur kontrol
(sedang saja).
63 Dr.Saba
P
e
r
c
e
n
t
g
r
o
w
t
h

(%
120
100
80
c
60
40
ba
20
0
PI PC PI Cin FB

Pengaruh dietary fiber fermentasi supernatan pada proliferasi


Caco- 2 sel. Sel yang seeded 1 hari sebelum pengobatan dengan
FS (hari0), kemudian diinkubasi selama 48 jam di media yang
mengandung 20% FS. P, I, C, IC, PC, PI, Cin dan FB adalah
pektin, inulin, selulosa, campuran selulosa pektin , campuran
inulin pektin, ekstrak cincau dan tinja kosong, masing-masing
batang mewakili rata-rata, dan garis adalah SEM dari 3data
dilambangkan oleh superskrip berbeda berbeda secara signifikan
dengan p <0,05.
b

ulangan.Titik64 Dr.Saba
)
ab
ab
Alkalin Uji aktivitas Phosphatase (AP)
• Untuk uji AP, 150000 sel / ml
dikultur dalam media tambahan
(DMEM mengandung 10% FCS,
1% NEEA, dan 100 U / mL
penicillin-streptomicyn dan 20 mM
HEPES) sampai sekitar 70% anak
sungai. Media dihapus dan diganti
dengan media yang mengandung
20% FS. Setelah inkubasi 4 jam,
sel-sel itu trypsinized dan
tersuspensi dalam 50 mM Tris-HCl
buffer, pH 10,0, dan
dihomogenisasi oleh sonifikasi. sel-
sel yang dihomogenkan menit untuk
disentrifugasi menghilangkan sel 65
pada puing-puing.
100.000 rpm selama 30
Dr.Saba
127,76
4378

14,30
Foçoğợg
85,47
HO

18.90
BAGIAN AA

16: 48_
1890_
16,48

100% confluency
46%contuency
efisiensiTranstection 194]

70% confluency
hep 3B-70% confluency
40%
TUN

Cut
Terima kasih