A.

Alat dan bahan

1. Alat
- Pipet volum 0,5; 1; 2,5; 0,1; 0,2; 2 ml
- Labu takar 100, 50,dan 10 ml
- Tabung reaksi
- Pipet tetes
- Spektrofotometer visible
- Vortex
- Scalpel
- Sentrifuge
- Stopwatch
- Kalkulator
- Timbangan analitik
- Mikropipet
- Tabung eppendorf
- Holder kelinci
- Beker gelas
- Glasfirm

2. Bahan
- Asam trikloroasetat (TCA) 10%
- Natrium nitrit 10%
- Asam sulfamat
- NaOH 10%
- Asam klorida 6 N
- Larutan PCT
- Plasma darah kelinci
- Aquadest

B. Skema kerja
1. Perolehan plasma
Darah kelinci diambil melalui vena marginalis telinga
↓
Ditampung dalam tabung eppendorf yang telah diberi heparin
↓
Tampungan darah disentrifugasi selama 10 menit (berapa rpm) untuk memperoleh plasma

2. Pembuatan blangko
Sebanyak 2,5ml plasma diambil, dimasukkan ke tapung eppendorf
↓
Ditambahkan 1 ml larutan TCA 10%, divortex dan sentrifugasi selama 5 menit dalam
kecepatan 2500 rpm
↓
Ditambahkan 0,5 ml HCL 6 N, 1 ml NaNO2 10% tanpa OT
↓
Ditambahkan 1ml asam sullfamat 15% lewat dinding tabung dengan hati-hati
 ↓
Ditambahkan 3,5ml NaOH 10% dan di add aquadest sampai batas tanda
↓
Degassing selama 5 menit
↓
Serapan dibaca dengan spektrofotometri visible

3. Pembuatan larutan parasertamol

1) Pembuatan larutan stok parasetamol 1mg/ml
Sebanyak kurang lebih 100mg parasetamol ditimbang seksama
↓
Dimasukkan kedalam labu ukur 100ml, dilarutkan dalam aquadest
(dibantu etanol 95%) sampai 100ml

2) Pembuatan seri larutan intermediet

Larutan stok parasetamol 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 dan 6,0 ml dimasukkan ke dalam labu
takar 10,0 ml
↓
Kemudian diencerkan dengan aquadest sampai tanda sehingga diperoleh larutan
parasetamol dengan kadar 50, 100, 200, 300, 400, 500 dan 600 µg/ml.

4. Penentuan operating time (OT)

Larutan intermediet parasetamol dengan kadar 200 µ/ml diambil 0,25 ml, lalu
dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge yang berisi 0,25 ml plasma
↓
Tambahkan 1 ml larutan TCA 20% divortex dan disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan 2500 rpm
↓
Diambil 1,5 ml supernatant bening dan dipindahkan ke dalam labu nukur 10 ml lalu
secara berturut-turut tambahkan 0,5 ml HCL 6N, 1 ml NaNO2 10% dan dimasukkan OT
pada 5’, 10’, 20’ dan 30’
↓
Dengan hati-hati ditambahkan 1ml asam sulfamat 15% lewat dinding tabung, kemudian
ditambahkan 3,5ml NaOH 10% dan aquadest sampai tanda
↓
Lalu digegassing selama 5 menit, dan serapan dibaca dengan spektrofotometri visible pada
panjang gelombang 430 nm sampai diperoleh serapan yang stabil pada rentang waktu
tertentu.

5. Penentuan panjang gelombang maksimum

Larutan parasetamol kadar 150, 200, 250 µg/ml disiapkan, kemudian diambil masing-masing
0,25ml, lalu dimasukkan kedalam tabung sentrifuge yang berisi 0,25ml plasma.
↓
 Tambahkan 1ml larutan TCA 20% divortex dan disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan
2500 rpm
↓
Diambil 1,5 ml supernatant bening dan dipindahkan kedalam labu ukur 10ml lalu secara
berturut-turut ditambahkan 0,5 ml HCL 6N, 1ml NaNO2 10% dan lalu diperlakukan OT pada
5’, 10’, 20’ dan 30’
↓
Dengan hati-hati ditambahkan 1ml asam sulfamat 15% lewat dinding tabung, kemudian
ditambahkan 3,5 ml NaOH 10% dan aquadest sampai tanda
↓
Lalu didegassing selama 5 menit, serapan kemudian dibaca dengan spektrofotometri visible
dari panjang gelombang 430 nm dan ditentukan panjang gelombang maksimumnya.

6. Pembuatan kurva baku parasetamol

Dari tiap-tiap kadar 150, 200, 250 µg/ml disiapkan yang dibuat dari 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0;
5,0; dan 6,0 ml larutan stok parasetamol dimasukkan ke dalam labu takar 10ml
↓
Kemudian diencerkan dengan aquadest sampai tanda sehingga diperoleh larutan parasetamol
dengan kadar 50, 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 µg/ml
↓
Diambil 0,5 ml yang diperlukan seperti pada langkahh OT
↓
Diambil kedalam tabung sentrifuge yang berisi 0,25 ml plasma
↓
Ditambahkan 1ml larutan TCA 20% divortex dan disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan 2500 rpm
↓
Ambil 1,5 ml supernatant bening dan pindahkan kedalam labu ukur 10ml lalu secara berturut-
turut tambahkan 0,5 ml HCL 6N, 1ml NaNO2 10% lalu diperlakukan OT pada waktu 5
menit
↓
Dengan hati-hati ditambahkan 1 ml asam sulfamat 15% lewat dinding tabung, ditambahkan
3,5 ml NaOH 10% dan aquadest sam[pai tanda
↓
Lalu didegassing selama 5 menit, serpan kemudian dibaca dengan spektrofotometri visible
pada panjang gelombang 430 nm sampai diperoleh serapan yang stabil pada rentang waktu
tertentu

Serapan dibaca pada panjang gelombang maksimum

7. Menentukan perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistemik
Larutan blangko tanpa parasetamol
Sebanyak 0,25 ml plasma darah diambil, dimasukkan ke dalam tabung effendorf
↓
Ditambahkan 1ml larutan TCA 10%, divortex dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 2500 rpm
↓
 Seluruh supernatant bening diambil sedapatnya ( ± 15ml), dipindahkan kedalam labu ukur
50ml
↓
Ditambahkan 0,5 ml HCL 6N, 1 ml NaNO2 10% dan tanpa OT
↓
Ditambahkan 1 ml asam sulfamat 15% lewat dinding tabung dengan hati-hati
↓
Ditambahkan 3,5 ml NaOH 10% dan di add aquadest sampai batas tanda
↓
Serapan dibaca dengan spektrofotometri visible
↓
Larutan parasetamol kadar 150, 200, 250 µg/ml diambil 0,25ml
↓
Dimasukkan kedealam tabung sentrifuge yang berisi 0,25 ml plasma
↓
Ditambahkan 1ml larutan TCA 20% divortex dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 2500 rpm
↓
Diambil 1,5 ml supernatant bening dan dipindahkan kedalam labu ukur 10ml lalu secara
berturut-turut ditambahkan 0,5 ml HCL 6N, 1 ml NaNO2 10% lalu diperlakukan OT selama
5 menit
↓
Dengan hati-hati ditambahkan 1 ml asam sulfamat 15% lewat dinding tabung
↓
Ditambahkan 3,5 ml NaOH 10% dan aquadest sampai tanda
↓
Lalu di degassing selama 5 menit, serapan kemudian dibaca debgan spektrofotometri visible
dengan panjang gelombang 430 nm sampai diperoleh serapan yang stabil pada jaringan
tertentu
↓
Dibuat 3 kali replikasi (bukan pengulangn spektro)
↓
Kadar terukur dihitung menggunakan kurva baku menggunakan persamaan kuadrat terkecil
y= ax + b dan dihitung nilai r² dari plot tersebut
↓
- Perolehan kembali
Nilai recovery dan kesalahan sistemik untuk setiap kadar
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
Perolehan kembali (P) = x 100
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑖𝑘𝑒𝑡𝑎ℎ𝑢𝑖

↓
- Kesalahan sistemik = 100-P
Perolehan kembali (recovery) merupakan tolak ukur efisiensi analisis, sedangkan kesalahan
sistemik merupakan tolak ukur inakurasi penetapan kadar. Kesalahan berupa kesalahan
konstan/ proposional
↓
- Kesalahan acak
Rat-rata dan simpangan baku dari 3 kali replikasi untuk setiap besaran kadar. Hitung
kesalahan acak untuk setiap besaran kadar

𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢
Kesalahan acak = x 100%
ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎