Metodología

Hacer una breve introducción por la cepa por que la cepa

Microorganismo

La cepa Bacillus subtilis ATCC6633 fue adquirida del Biofilms and Biotechnology Laboratory en
Pennsylvania State University. El medio de cultivo Luria Bertani “LB” (anexo) fue empleado para la
conservación del microorganismo, cultivado en cajas Petri a 37 ºC por 24 h. La cepa fue
recultivada cada 20 días y preservadas a 4 ºC.

Preinoculo

Para la preparación de los preinóculos se utilizó medio LB, se trabajó con 25 mL de medio en
Erlenmeyer de 250 mL, sometidos al autoclave a 15 bar y 121 °C por 20 min, tomando una colonia
del plato de cultivo y se inoculó. Los preinóculos crecieron a 37 ºC, 180 rpm durante 18 horas.

Determinación del Índice de Emulsificación (IE24)

Se realizó con el medio de cultivo libre de microorganismos, fue centrifugado a 5000 rpm durante
20 minutos a 4 °C en una centrífuga ________(a). La actividad emulsionante se midió en tubos de
ensayo agregando 3 ml de hexano a 3 ml de medio de cultivo y agitando en el vórtex por un
tiempo de 2 minutos. Las mediciones se hicieron 24 horas después. El índice de emulsión (E24) es
la altura de la fase emulsificada y se divide entre la altura total.(b)

Se realizó con el medio de cultivo libre de microorganismos, el cual fue centrifugado a 5000 rpm
durante 20 minutos a 4 °C en una centrífuga ________(a). La actividad emulsionante se midió
agregando 3 ml de hexano y 3 ml de medio de cultivo a tubos de ensayo los cuales se agitaron en
el vórtex por un tiempo de 2 minutos. Las mediciones se hicieron 24 horas después. El índice de
emulsión (IE24) es la altura de la fase emulsificada y se divide entre la altura total.(b)

Determinación de la Tensión Superficial (TS)

En la determinación de la TS se utilizó el sobrenadante previamente tratado como se describió

para el IE24. Esta prueba se realizó mediante el principio del anillo de DuNöuy con el tensiómetro
Fisher-Scientific modelo 2 para cada una de los medios de cultivo. Las lecturas de las muestras
fueron tomadas por triplicado

Preparación de los inóculos.

Las bacterias se cultivaron en caldo nutritivo y se incubaron a 28 °C durante 72 horas a 180 rpm. El
cultivo obtenido fue centrifugado a 5000 rpm durante 15 minutos a 4 oC utilizando una centrífuga
Hettich refrigerada. La biomasa se lavó dos veces con solución salina isotónica estéril. La pastilla
de biomasa se resuspendió en solución isotónica estéril. Esta solución se toma como inoculo inicial
y fue sembrado en medio de Rennie (21), se incubó durante 3 días a 28 °C y 180 rpm. El cultivo
obtenido después de 3 días fue lavado con solución salina estéril para preparar una suspensión de
microorganismos con una densidad óptica de 1 leída a una λ de 620 nm. De esta suspensión se
considera el 10% del volumen de acuerdo a la cantidad de medio de cultivo que se va a utilizar
para el crecimiento y la producción del biosurfactante utilizando como fuente de carbono 5 g/L de
queroseno, se incubó a 28 °C y 180 rpm y se realizaron las determinaciones para la producción del
biosurfactante por un periodo de 4 a 9 días.

Se evaluaron 3 medios para el cultivo de B.subtilis y la producción de surfactina, utilizando como

única fuente de carbono el glicerol crudo obtenido de la empresa Oleoflores S.A., Valledupar,
Colombia. Los medios de cultivo fueron: a) “LB”, b) Glicerol-Peptona, “GP” y c) Medio Mínimo de
Sales con Glicerol Crudo “MSMCG” (Anexo B). Se hicieron cultivos en 100 mL de cada uno de los
tres medios en frascos Erlenmeyer de 250 mL con una densidad óptica (DO600) inicial de 0,1 y se
dejaron en agitación a 180 rpm a 37 °C por 72 horas, tomando muestras a las 2, 4, 6, 24, 48 y 73
horas. Los valores de DO fueron calculados con diluciones de 1/5 con el fin de obtener
mediciones proporcionales de la densidad celular con la DO. La velocidad de crecimiento μ fue
calculada con la pendiente entre el logaritmo base 10 de la DO y el tiempo [32]. Por medio de la
prueba cualitativa de gota colapsada

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[33] se analizó la actividad surfactante. Sobre una lámina de vidrio se vertieron 2 μL de aceite
de motor y 5 μL de sobrenadante de cultivo, luego de 10 minutos se comparó el colapso de la
interfase aceite-medio acuoso.

3.1.4 Crecimiento celular de B. subtilis. Se realizaron cultivos de B. subtilis en 125 mL de medio

de cultivo elaborado con cada uno de los residuos agroindustriales con las concentraciones de
ART y nitrógeno externo seleccionadas en las etapas

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3.1.2 y 3.1.3. El pH se ajustó a 7 porque es el que favorece el crecimiento de B. subtilis. Como

control del crecimiento se escogió el medio LB, el cual es un medio reportado en la literatura
favorable para el crecimiento de B. subtilis. Los cultivos se incubaron a 150 rpm y 30 °C. Se
tomaron muestras del cultivo cada 6 horas durante 78 horas. Debido a la turbidez del medio a
base de lactosuero, no se pudo medir la densidad óptica (DO). La cantidad de células de la
muestra de lactosuero fue determinada por conteo de unidades formadoras de colonias UFC
[39] con diluciones desde 10-2 hasta 10-4, en cajas Petri con medio LB-agar después de 24 horas
de incubación a 30 °C. Para los medios de extracto de piña, mucílago de café y LB se determinó
la DO a 600 nm en el espectrofotómetro Lambda 25 UV/VIS (Perkin Elmer, Estados Unidos) y
luego fueron convertidos a UFC utilizando como factor de conversión el número de UFC
obtenidas al inocular 1 μL de cultivo con dilución 10-2 en cajas Petri con medio LB-agar,
partiendo de una DO de 0.5 en cada uno de los medios analizados.

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Se evaluaron 3 medios para el cultivo de B.subtilis

(a) Cooper G.D., and Goldenberg G.B. (1991). Surface active agents from two Bacillus
species. Appl. Environ. Microbiol. 53 (2):224-229.
(b) PRODUCCIÓN DE BIOSURFACTANTES POR BACTERIAS DE VIDA LIBRE FIJADORAS DE
NITRÓGENO CRECIDAS EN HIDROCARBUROS