Práctica N° 3

Métodos de recuentos de microorganismos

La determinación del número de microorganismos es de suma importancia en

microbiología. Los métodos que miden el número de las células son
primordialmente importantes para contar el numero de microorganismos
unicelulares, tales como levaduras y bacterias, mientras que la medida de la masa
celular puede emplearse para todo los tipos de microorganismos, incluidos los que
forman largos filamentos como los mohos, que no pueden contarse enumerando el
número de células. El método más común para medir número de células es el
recuento de placas o recuento de colonias. Sin embargo en la industria, en el cual
se necesitan resultados rápidos, se emplea mayormente el recuento por dilución o
la técnica del número más probable, basados en utiliza una serie de diluciones de
una muestra que se inoculan en una serie de tubos con medios líquidos, en vez de
sembradas en placas y cuyo conteo tiene fundamento estadístico.

Medición del crecimiento microbiano

1. Recuento en placa: El recuento en placa es el método más común de

medir el crecimiento bacteriano. Este método mide el número de células
viables. Puede tomar 24 horas o más para formar colonias visibles. El
recuento en placa, de acuerdo a los objetivos del ensayo, se puede realizar
de dos formas:
a. Siembra en superficie: 0.1 ml la solución bacteriana se agrega a la
superficie del agar nutritivo sólido. La solución bacteriana se
extiende entonces uniformemente encima del medio utilizando una
barra de vidrio doblada y estéril, la placa entonces se lleva a
incubación.
 b. Vertido en placa: en este método 1.0 ml-0.1 ml del cultivo se vierte
en placas de Petri. Se agrega agar nutritivo fundido y relativamente
enfriado, se agita suavemente para producir una mezcla
homogénea. Cuando el agar ha solidificado, la placa se invierte y se
lleva a incubación. Con esta técnica, los microorganismos sensibles
al calor pueden dañarse por el agar fundido siendo incapaz de
formar las colonias.
2. Micro-filtración por membranas: cuando la cantidad de bacterias es muy
pequeña, como en lagos y arroyos de agua pura, las bacterias pueden
determinarse por los métodos de la filtración. Aquí 100 ml de agua se
hacen pasar a través de una membrana delgada cuyos poros son tan
pequeños para son capaces de retener las bacterias. Las bacterias
retenidas en el filtro se colocan en una placa de Petri con agar nutritivo.
Este método es útil en la determinación de coliformes como indicadores de
contaminación fecal en alimentos o agua.
3. Recuento microscópico directo: para usar el método de recuento
microscópico directo, un volumen moderado de bacterias, se suspende en
un líquido puesto dentro de un área designada de una diapositiva
microscópica. Por ejemplo, 0.01 ml de la muestra extendida sobre 1 cm2
marcado sobre una diapositiva, teñida y observada bajo el objetivo de
inmersión. Una vez obtenido el número de bacterias determinado en varios
campos diferentes, se puede tomar un promedio del número de bacterias
observadas en el campo. De estos datos, se puede calcular el número de
bacterias sobre el cm2 en el cual se ha extendido la muestra. Dado que el
área en la diapositiva contiene 0.01 ml de muestra, el número de bacterias
en cada ml de la suspensión es el número de bacterias en la muestra
medidas x 100. Esta técnica presenta algunos inconvenientes: debido al
pequeño volumen de las microcámaras excavadas, normalmente 0.001 mL,
la concentración de la población microbiana tiene que ser bastante alta
 para que el resultado sea representativo, además también difícil distinguir
entre células vivas y muertas.

4. Métodos indirectos para el recuento microbiano. En estos métodos no

deben contarse todas las células microbianas para establecer su número.
a. Turbidez: En algunos tipos de pruebas, la estimación de la turbidez
es una manera práctica de monitorear el crecimiento microbiano. La
turbidez es la nubosidad de un líquido o la pérdida de transparencia
debido a la materia insoluble (coloides). En este método se emplea
un espectrofotómetro o colorímetro. En éstos, un haz de luz se
transmite a través de las bacterias que se suspenden en el medio
líquido hacia una celda fotoeléctrica. Como aumenta el número de
bacterias en crecimiento, menos luz alcanzará la célula fotoeléctrica.
El cambio de la luz es registrado en la balanza del instrumento
como el porcentaje de transmisión. La cantidad de luz que golpea el
detector fotosensible en el espectrofotómetro es inversamente
proporcional al número de bacterias en crecimiento: a menos luz,
más bacterias.
b. Actividad metabólica: Otra manera indirecta de medir el crecimiento
bacteriano es mediante la actividad metabólica de la colonia. En
este método se supone que la pérdida metabólica, la producción de
 CO2 y ácido, están en proporción directa al número de bacterias
presentes. Mientras más bacterias tengamos, se tendrá mayor
número de productos y desechos.
c. Peso seco. En el caso de los organismos filamentosos, como los
mohos, una manera de medir el crecimiento es por peso seco. Éstos
se separan de su medio de crecimiento, se filtran, se y secan
empleando un desecador. En el caso de las bacterias, éstas se
separan del medio de crecimiento mediante centrifugación.
d. Número más probable (NMP): El número de coliformes totales
(Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Escherichia) en una muestra
de agua se puede determinar por estimación estadística
denominada número más probable (NMP). En la prueba presuntiva,
las diluciones de la muestra se agrega en tubos de fermentación
caldo lactosa o lauril triptosa. Después de 24 a 48 horas de
incubación a 35°C, se busca la presencia de bacterias capaces de
fermentar la lactosa con la producción de gas (coliformes). El caldo
triptosa lauril es selectivo para bacterias Gram-negativo debido a la
presencia de sulfato lauril. El resultado positivo de la prueba es la
producción de ácido de la fermentación de lactosa, produciendo
cambios de color purpúreos del bromocresol (indicador del color) a
amarillo. Si no hay cambios de color, los resultados son negativos
para coliformes en 100 ml de agua.

Objetivo de la práctica:
  Determinar la presencia de coliformes en muestras de jugos artesanales
 Obtener índices acerca del posible número de coliformes presentes en
muestras de jugos elaborados de manera artesanal
 Realizar comparaciones entre el NMP y el recuento directo en placa.

Materiales

 Jugos artesanales, uno por grupo, de diversos sabores.

 Agar nutritivo, caldo lactosado.

Metodología:

1. Recuento en placa: Para realizar un recuento bacteriano la muestra se

diluye y se siembra en placas. Después de incubación se cuenta el número
de colonias que se han desarrollado. Se cuentan las placas que contienen
entre 30 y 300 colonias. Luego se determina el numero original de
bacterias promediando conteos y luego se multiplica en número de colonias
que se promedian por el factor de dilución (el inverso del grado de
dilución), de la placa donde se está haciendo el conteo. Las diluciones se
expresan generalmente como exponentes negativos. Por ejemplo, se usa
10-5 en lugar de 1/100.000.
a. Rotule 3 tubos de ensayo con 9 ml del liquido de dilución (agua
peptonada, agua destilada o buffer fosfatado), con las diluciones
que se emplearan (100-10-3), en igual forma rotule las placas de
Petri estériles con las diluciones correspondientes, su nombre, la
fecha y la muestra. Use dos placas por cada dilución. La muestra
sin diluir es la muestra 100.
b. Con una pipeta estéril, pese 1ml de la muestra al tubo con diluyente
marcado 10-1. Con la misma pipeta pase 1ml de la muestra a una
placa de Petri marcada 100. Repita el proceso con la segunda placa
de dilución 100.
 c. Agite el tubo 10-1, mezclando bien el contenido del mismo. Con una
pipeta nueva pase 1ml de la dilución 10-1 al tubo marcado 10-2. Con
la misma pipeta pase 1ml de la dilución 10-1 a cada una de las
placas de Petri marcada 10-1.
d. Repita el proceso con los tubos y las placas restantes hasta llegar a
la dilución 10-3.
e. Vierta aproximadamente 29 ml de agar nutritivo previamente
fundido y enfriado a 45°C, a cada una de las placas. Mezcle suave
el contenido de cada placa y déjelas en reposo hasta que
solidifiquen.
f. Invierta las placas y lleve a incubación a 35°C, durante 24 horas.
g. Después de la incubación (24 horas), cuente las colonias en las
placas que contienen entre 30 y 300 colonias. Sume los dos conteos
y tome el promedio. Multiplique este valor por el factor de la
dilución de las placas contadas. El producto es el número de
unidades formadoras de colonias por ml. (UFC/ml).

2. Número más probable (NMP): Para calcular el NMP se debe determinar

el número significativo de los tubos positivos y negativos. Los tubos
positivos son aquellos donde ha habido una producción significativa de
acido y gas a partir de la lactosa; todos los demás tubos son negativos. El
primer dígito del número significativo corresponde a la ultima dilución que
tenga el mayor numero de tubos positivos: los próximos dos dígitos del
número significativo corresponden al número de tubos positivos en las dos
diluciones subsiguientes.
a. Para la dilución emplee los mismos tubos de dilución que en la
práctica de recuento en placa. Rotule los tubos de caldo lactosado
en la misma forma, con tres tubos por dilución.
b. Con la misma pipeta estéril, pase 1ml de la muestra [dilución 100] al
liquido de dilución 10-1. Con la misma pipeta, pase 1ml de la
 muestra [dilución 100] a cada uno de los tres tubos de caldo
lactosado de dilución 100. Descarte la pipeta usada.
c. A partir de la dilución realizada, proceda preparando la siguiente
dilución de la serie antes de pasar de la dilución 10-1 a los tres tubos
con caldo lactosado, repita el procedimiento con la (s) diluciones
subsiguientes
d. Incube los tubos, debidamente rotulados e identificados, a 35°C
durante 24 horas.
e. Después de la incubación (24 horas), observe los tubos.
f. Anote el numero de tubos de cada dilución donde se ha producido
acido (color amarillo) y gas (burbujas finas produciendo espuma).
Esquema para la siembra de microorganismo
Preguntas a investigar:

1. ¿Cuál es la ventaja del recuento total en placa?

2. ¿Qué ventajas presenta el método de conteo microscópico directo?

3. ¿Qué utilidad presenta el método de NMP en la microbiología para el

recuento de los microorganismos?
4. ¿Qué desventajas presenta el método del NMP?

5. ¿Cuáles inconvenientes se presentan en el método espectrofotométrico

para la determinación del crecimiento microbiano?
6. Defina Biomasa celular.

7. Diga las desventajas del recuento microscópico directo.

8. ¿En qué casos es útil aplicar el recuento microscópico directo?

Bibliografía consultada

BETSY T.; KEOGH, J. Microbiology demystified. McGraw-Hill. USA. 2005. DOI:

10.1036/0071446508

CARPENTER, PHILIP L. Microbiología , McGRAW-HILL. MADRID, España 4° edición.

PRESCOTT, L.; HARLEY, J.; KLEIN, D. Agud Aparicio, José Luis (Traductor);
Gamazo de la Rasilla, Carlos (Revisor) Microbiología, Mc Graw-Hill, Madrid,
España.

PRESCOTT, L.; HARLEY, J. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, 5ta edición.

The McGraw−Hill Companies.
 Tabla De Número Más Probable (NMP)
Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos
10ml 1ml 0.1ml NMP 10ml 1ml 0.1ml NMP 10ml 1ml 0.1ml NMP

0 0 1 3 1 1 2 15 2 2 3 42
0 0 2 6 1 1 3 19 2 3 0 29
0 0 3 9 1 2 0 11 2 3 1 36
0 1 0 3 1 2 1 15 2 3 2 44
0 1 1 6 1 2 2 20 2 3 3 53
0 1 2 9 1 2 3 24 3 0 0 23
0 1 3 12 1 3 0 16 3 0 1 39
0 2 0 6 1 3 1 20 3 0 2 64
0 2 1 9 1 3 2 24 3 0 3 95
0 2 2 12 1 3 3 29 3 1 0 43
0 2 3 16 2 0 0 9 3 1 1 75
0 3 0 9 2 0 1 14 3 1 2 120
0 3 1 13 2 0 2 20 3 1 3 160
0 3 2 16 2 0 3 26 3 2 0 93
0 3 3 19 2 1 0 15 3 2 1 150
1 0 0 4 2 1 1 20 3 2 2 210
1 0 1 7 2 1 2 27 3 2 3 290
1 0 2 11 2 1 3 34 3 3 0 240
1 0 3 15 2 2 0 21 3 3 1 460
1 1 0 7 2 2 1 28 3 3 2 1100
1 1 1 11 2 2 2 35 3 3 3 1100+