Cinética de fermentación alcohólica utilizando como fuente de nitrógeno harina de semilla de guayaba Psidium guajava
Liliana Serna Cock 1*, Daniel Mera Ayala 1, Jorge Angulo López 1, Ana Lucia Gómez 2
1*
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de Ingeniería y Administración, Carrera 32 vía Candelaria, Palmira – Valle, Colombia.
2
SUCROMILES S.A., Km. 14 Recta Cali-Palmira – Valle, Colombia.
1. INTRODUCCIÓN
En la industria de las fermentaciones, el costo, la disponibilidad y la
estabilidad de los sustratos de fermentación, son motivo de investigación,
ya que pueden representar hasta el 68 % del costo de producción de los
productos obtenidos por fermentación [1, 2], siendo las materias primas
más importantes las fuentes de carbono y de nitrógeno. En referencia a la
fuente de carbono, la melaza de caña de azúcar es uno de los principales
subproductos de la industria azucarera, es buena fuente de azúcares
fermentables y no requiere pretratamiento complejo [3]. Tradicionalmente
la urea es la principal fuente de nitrógeno, y el fósforo, es adicionado en la
forma de fosfato diamónico por su demostrada facilidad de absorción por
parte de las células microbianas, favoreciendo, al igual que la fuente de
nitrógeno, el desarrollo celular [4]. La búsqueda de nuevas fuentes de
nitrógeno está dirigida a reemplazar suplementos costosos como son los
péptidos y algunos factores de crecimiento (Vitaminas del complejo B) los
cuales tienen gran importancia en la fermentación [5].
De otro lado, estudios realizados por Steinhaus et al. [6], afirman que una
parte importante de la cosecha de guayaba se procesa en mermeladas,
sorbetes, pastas y barras de dulce llamadas bocadillos. Durante la
elaboración de dichos productos se utiliza la pulpa quedando como
residuo una gran cantidad de semilla, la cual representa el 4.0 % del peso
de la guayaba y posee un contenido importante de proteína [6,7]. Altaf et
al. [5], establecen una necesidad en la investigación sobre materiales
renovables nitrogenados como alternativa de fuentes de nitrógeno de
menor costo, en fermentaciones industriales. El residuo agroindustrial
generado en la agroindustrialización de la guayaba, pueden ser una fuente
alterna y potencial de alto interés en el estudio de posibles aplicaciones en
la industria de las fermentaciones.
Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue evaluar la cinética de
fermentación alcohólica utilizando como fuente de nitrógeno harina de
semilla de guayaba Psidium guajava. La cinética se midió en términos de
conversión de sustrato, rendimiento en producto y productividad.
2. METODOLOGÍA
2.1 Material biológico
Se trabajó con semilla de guayaba Psidium guajava suministrada por la
empresa Dulces San Antonio la Tentación, del Municipio de Vélez –
Santander, Colombia. La semilla se sometió a un proceso de secado
(Binder ED 115-UL, Germany) y molienda (FRITSCH Pulverisette 14,
Germany) para la obtención de la harina.
2.2 Determinación del contenido de nitrógeno del material biológico
Se determinó el contenido de nitrógeno mediante el método Kjeldahl [8].
2.3 Microorganismo
Se utilizó una cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red (Division of
S.I. Leaffre Group, France)
2.4 Fermentación
Las cinéticas se llevaron a cabo en 6 fermentaciones en discontinuo,
usando como sustrato, melaza más urea y fosfato diamónico MUFA
(Azúcares reductores 23 gL-1, urea 1.1 gL-1 y fosfato diamónico 0.67 gL-1)
y melaza más harina de semilla de guayaba MHSG (Azúcares reductores
23 gL-1 y harina de semilla de guayaba 51.42 gL-1). Los sustratos se
ajustaron a pH 4.6 utilizando ácido sulfúrico al 98 % y se esterilizaron a
121 °C y 0.11 MPa por 15 min (Autoclave esterilizador Medical – Essen
250 I, Colombia). Para la etapa de reproducción se utilizó el 30 % (v/v) de
inóculo con respecto al volumen del sustrato. Las fermentaciones se
realizaron en un bioreactor de 1500 mL, con un volumen de trabajo
efectivo de 1000 mL; en la etapa de reproducción de la levadura,
permanecieron en un baño termostático (Julabo – 13A, Germany) a 34 ±
0.5 °C, con aireación 5 L/min y agitación a 270 rpm por 4 horas y durante
la etapa de fermentación, permanecieron en el mismo baño termostático a
32 ± 0.5 °C, sin aireación y agitación a 270 rpm por 24 horas.
2.5 Cinética de producción de etanol, consumo de sustrato y
formación de biomasa en fermentación alcohólica
Para realizar las cinéticas de producción de etanol y consumo de sustrato,
en cada uno de los tiempos y para cada uno de los sustratos, se tomaron
asépticamente 10 mL de sustrato a las 0, 3, 6, 12, 18 y 24 horas de
fermentación (El tiempo 0 correspondió a las condiciones finales de la
etapa de reproducción celular), los cuales se centrifugaron a 4000 rpm por
10 minutos (Eppendorf Centrifuge – 5804R, Germany); posteriormente se
filtraron en filtros de 0.45 µm (Titan, USA). La producción de etanol se
midió en los sobrenadantes mediante cromatografía gaseosa
(Cromatógrafo de gases Agilent technologies – 7890A, USA) y el
consumo de sustrato (Azúcares reductores) se determinó por
espectrofotometría (Thermo Scientific – Genesys 10 UV, USA) mediante
el método DNS (Ácido 3,5- dinitrosalicilico) [9]. La cinética de formación
de biomasa se determinó por conteo en Cámara de Neubauer; el
seguimiento de la formación de biomasa se llevó a cabo durante 4 horas
con el fin de garantizar que el número de células inoculadas fuera superior
a 3x108 CelmL-1 acorde a la metodología establecida por Calderón, [4]. Se
calculó la conversión de sustrato (CS), el rendimiento en producto (Yp/s) y
la productividad mediante las Ecuaciones 1, 2 y 3.
Donde, S0: Concentración inicial de azúcares reductores (gL-1), S:
Concentración final de azúcares reductores (gL-1), hasta el tiempo en que
P es máximo; P: Concentración máxima de etanol (gL-1), mp: Masa de
etanol producida (g), VT: Volumen total de fermentación (L) y t: Tiempo
de fermentación (h).
2.6 Análisis estadístico
Se usó un diseño factorial de 2*6 con dos factores y tres replicas así:
Factor sustrato de fermentación, con dos niveles: melaza más urea y
fosfato diamónico (MUFA) y melaza más harina de semilla de guayaba
(MHSG). Factor tiempo de fermentación, con 6 niveles: 0, 3, 6, 12, 18 y
24 horas de fermentación, donde el tiempo 0 correspondió a las
condiciones finales de la etapa de reproducción celular. Las variables de
respuesta fueron: Conversión de sustrato, rendimiento en producto y
productividad. Los resultados se analizaron con el paquete estadístico
SAS 9.2 para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC., USA) [10]. La
comparación entre promedios se llevó a cabo a través de la prueba DMS
(Diferencia Mínima Significativa) con una probabilidad de P < 0,05.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La harina de semilla de guayaba presentó un contenido de nitrógeno del
1.23 % en base seca. El sustrato MHSG presentó el mayor rendimiento en
producto (Yp/s) y la mayor conversión de sustrato a las 18 y 24 horas de
fermentación respectivamente (6.11 gg-1 y 47.58 %). La productividad a
las 24 horas de fermentación en el sustrato MUFA fue mayor que la del
sustrato MHSG con valores de 2.59 y 2.50 gL-1h-1 respectivamente. Esto
indica que el sustrato MHSG al finalizar el proceso presenta la mayor
conversión de sustrato, pero el rendimiento en producto es mejor a las 18
horas de la fermentación.
 sulfato de amonio, por lo cual, la harina de semilla de guayaba se puede
8,60 140,00 considerar una fuente de nitrógeno viable para la fermentación alcohólica.

Azuúcares reductores (gL-1)

8,50 120,00
100,00
4. CONCLUSIONES
Log (CelmL-1)

8,40
80,00
8,30
60,00
8,20 La harina de semilla de guayaba es una buena alternativa como fuente de
40,00
8,10 20,00
nitrógeno en fermentaciones alcohólicas, cuando se utiliza como sustrato
8,00 0,00
MHSG, se pueden obtener mayor conversiones de sustrato y mejores
0 1 2 3 4 5 rendimientos en producto durante la etapa de fermentación. El uso de esta
Tiempo (h) fuente de nitrógeno podría disminuir los costos operacionales alrededor
MUFA - Formación de biomasa MHSG - Formación de biomasa del 35 %, comparado con el uso de las fuentes habituales, generando
MUFA - Consumo de sustrato MHSG - Consumo de sustrato además un valor agregado interesante a este residuo agroindustrial que
Figura 1: Cinética de formación de biomasa y consumo de sustrato de puede perderse en la agroindustrialización de la fruta.
Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de
reproducción, utilizando sustratos: melaza más urea y fosfato diamónico Agradecimientos
(MUFA) y melaza más harina de semilla de guayaba (MHSG). Los autores expresamos los agradecimientos al Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT) y a las empresas SUCROMILES S.A. y
La figura 1 muestra que los azúcares reductores mostraron un incremento Dulces San Antonio la Tentación, por los aportes a ésta investigación.
en su concentración durante la primera hora de reproducción, lo anterior
se explica por la presencia de sacarosa en la melaza, la cual es catalizada 5. REFERENCIAS
por la enzima invertasa presente en la levadura [11]. La hidrólisis de la
sacarosa trae consigo un ligero aumento en las concentraciones de 1. Kwon, S., Lee, P.CH., Lee, E.G., Chang, Y.K., Chang, N. (2000).
fructosa y glucosa [12], y por ende un aumento en los azúcares reductores. Production of lactic acid by Lactobacillus rhamnosuswith vitamin-
supplemented soybean hydrolysate. Enzyme and Microbial
8,80 300,00 Technology, 26: 209–215.
Azúcares reductores (gL-1)

8,70
8,60
250,00 2. Serna, L. and Rodríguez., A. (2007). Producción económica de ácido
láctico utilizando residuos de cosecha y jugos de caña de azúcar
Log (CelmL-1)

8,50 200,00
8,40 150,00 (Saccharum officinarum L.). Agricultura Técnica, 67: 29–38.
8,30 100,00 3. Calderón A., Evaluación del uso de antibióticos como mecanismo
8,20
50,00 para el control de contaminantes bacterianos en la fermentación para
8,10
8,00 0,00 la producción de alcohol etílico. Bogotá, 2007. Trabajo de grado
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 (Microbióloga Industrial). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad
Tiempo (h)
de Ciencias.
MUFA - Formación de biomasa MHSG - Formación de biomasa 4. Acevedo A., Godoy R, and Bolaños G., (2003). Incremento de la
MUFA - Consumo de sustrato MHSG - Consumo de sustrato producción de alcohol en fermentación de melazas mediante la
Figura 2: Cinética de formación de biomasa y consumo de sustrato de utilización del complejo enzimático Rhyzozyme. XXII Congreso
Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de Colombiano de Ingeniería química. Bucaramanga. Agosto 13–15.
fermentación, utilizando sustratos: melaza más urea y fosfato diamónico 5. Altaf, Md., Naveena, B.J., Reddy, G. (2005). Screening of
(MUFA) y melaza más harina de semilla de guayaba (MHSG). Inexpensive Nitrogen Sources for Production of L (+) Lactic Acid
from Starch by Amylolytic Lactobacillus amylophilus GV6 in Single
En la figura 2 el incremento de los azúcares reductores durante las 6 Step Fermentation. Food Technol. Biotechnol, 43 (3): 235–239.
primeras horas, fue debido, al suministro de sustrato que se realizó cada 6. Steinhaus, M., Sinuco, D., Polster, J., Osorio, C., Schieberle, Peter.
hora durante este periodo. La formación de biomasa disminuyó por (2008). Characterization of the Aroma-Active Compounds in Pink
efectos de dilución, ocasionada a su vez por el suministro de sustrato. Al Guava (Psidiumguajava, L.) by Application of the Aroma Extract
finalizar la etapa de fermentación se presentaron diferencias Dilution Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56
estadísticamente significativas P < 0.05 entre los dos sustratos, tanto para (11): 4120–4127.
el consumo de sustrato, como para la formación de biomasa. 7. Elizalde, M.P., Hernández, V. (2009). Guava seed as an adsorbent and
as a precursor of carbon for the adsorption of acid dyes. Bioresource
9,00
Technology, 100: 2111–2117.
8,00
7,00 8. Kjeldah, J. (1883). Neue Methode zur Bestimmung der Stickstoffs in
Etanol (% v/v)

6,00 organischen Korpern. Z Anal Chem, 22: 366–382.

5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 2 4 6
Figura 3: Cinética de producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae
(Ethanol Red), durante la etapa de fermentación, utilizando sustratos:
melaza más urea y fosfato diamónico (MUFA) y melaza más harina de
semilla de guayaba (MHSG).
La producción de etanol (figura 3) mostró un comportamiento similar para
los dos sustratos, estos no presentaron diferencias estadísticamente
significativas P > 0.05 a las 24 horas de fermentación, igual
comportamiento se presentó en estudios realizados por Turhan et al. [13],
quienes utilizaron extracto de levadura y extracto de algarroba con fuente
de nitrógeno. Mientras que Tang et al. [14], reportan una concentración de
etanol del 8.50 % a las 48 horas de fermentación utilizando melaza más
9. Millar, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for
determination of reducing sugar. Analyt. Chem, 31: 426–429.
10. SAS INSTITUTE INC. (1993). SAS user’s guide. Statistics, version
6.03 Edition. SAS Institute Inc., Cary, NC.
11. Echegaray, O.F., Carvalho, J.C.M., Fernandes, A.N.R., Sato, S.,
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Aquarone, E., Vitolo, M. (2000). Fed-batch culture of Sacchoromyces
Tiempo (h) cerevisiae in sugar-cane blackstrap molasses: invertase activity of
MUFA MHSG intact cells in ethanol fermentation. Biomass and Bioenergy, 19: 39–
50.
12. Kazuhiko, T. and Kozo, O. (1995). Factors Affecting the Ethanol
Productivity of Yeast in Molasse. Journal of fermentation and
bioengineering, 9 (5): 449–452.
13. Turhan, I., Bialka, K.L., Demirci, A., Karhan, M. (2010). Ethanol
production from carob extract by using Saccharomyces cerevisiae.
Bioresource Technology, 101: 5290–5296.
14. Tang, Y., An M., Zhong, Y.L., Shigeru, M., Wu, X., Kida, K. (2010).
Continuous ethanol fermentation from non-sulfuric acid-washed
molasses using traditional stirred tank reactors and the flocculating
yeast strain KF-7. Journal of Bioscience and Bioengineering, 109 (1):
41–46.