Khasiat Kombinasi Tetap dari Tetracycline, Chloramphenicol, dan

Colistimethate Sodium untuk Pengobatan Candida albicans keratitis

Anna R. Blanco,1 2Antonia Nostro,2 Valeria D'Angelo,2 Manuela D'Arrigo,2 Maria G. Mazzone,1 dan
Andreana Marino
1
SIFI SpA, Aci S. Antonio, Catania, Italia
2
Departemen Kimia, Biologi, Farmasi dan Ilmu Lingkungan, Universitas Messina, Polo
Annunziata, Messina, Italia

PURPOSE. Untuk mengevaluasi aktivitas antijamur dari kombinasi antibiotik

Korespondensi: Maria G. tetap (AC) yang mengandung tetrasiklin (TET), kloramfenikol (CAF), dan
Mazzone, colistimethate natrium (CS).
SIFI SpA, Aci S. Antonio, METODE. In vitro: Candida ATCC dan strain klinis digunakan. Konsentrasi
Catania hambat minimum (MIC) dari AC dan masing-masing antibiotik ditentukan.
95.025, Italia; Flukonazol (FLC) diuji untuk perbandingan. Kurva waktu-membunuh dari strain
mariagrazia.mazzone@sifi yang dipilih dilakukan. Ex vivo keratitis: kornea disuntikkan intrastromal
dengan strain yang dipilih. Setelah injeksi, kornea dibagi menjadi beberapa
group.com. kelompok perawatan: AC, FLC, atau saline. Kemudian, jaringan dianalisis untuk
Dikirim: April 13, 2017 unit pembentuk koloni per gram (CFU / g). Pewarnaan Propidium iodida (PI)
Diterima: 18 Juli 2017 dan MitoTracker (MTR) digunakan untuk menyelidiki modus tindakan.
HASIL.Nilai MIC diperlukan untuk menghambat pertumbuhan 90% organisme
Kutipan: Blanco AR, untuk antibiotik saja lebih tinggi daripada FLC. Namun, aktivitas mereka
Nostro A, D'An-gelo V, ditingkatkan ketika digunakan dalam kombinasi terhadap Candida ragi. Kurva
D'Arrigo M, Mazzone time-killing menunjukkan bahwa pada 24 jam, AC mengurangi beban kedua
MG, Marino A. Khasiat strain sekitar 1 Log10 CFU / g dibandingkan dengan inokulum awal (P
tetap combi-bangsa <0,0001). Efek ini juga signifikan terhadap FLC. Dalam ex vivo, AC efektif
dalam mengurangi beban kedua strain oleh 4 Log10 CFU / g sehubungan
tetrasiklin, chlorampheni- dengan kontrol. Selain itu, ia menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi daripada
col, dan natrium FLC terhadap Candida albicans ATCC 10231 (1 Log10 CFU / g, P <0,01
colistimethate untuk dibandingkan kontrol). Pewarnaan PI menunjukkan bahwa CS mengubah
pengobatan Candida permeabilitas membran, sedangkan pewarnaan MTR menunjukkan bahwa TET
albicans kera- Titis. atau CAF mengubah fungsi mitokondria. Sel-sel diobati dengan AC dan bernoda
menunjukkan kedua efek.
Berinvestasi Ophthalmol KESIMPULAN. Dalam studi ini, AC menunjukkan efikasi antijamur terhadap
Vis Sci. 2017; 58: 4292- Candida spp .; aktivitas ini bisa karena efek sinergis dari antibiotik di dalamnya.
4298. DOI: 10,1167 / Kata kunci: Candida, tetrasiklin, kloramfenikol, natrium colistimethate, keratitis
iovs.17-22047 jamur,modus tindakan
keterbatasan, seperti bioavailabilitas
yang buruk dan penetrasi pada mata
Keratitis mycotic, umumnya dikenal sebagai yang terbatas, terutama pada kasus
keratitis jamur, menyumbang sekitar 1% sampai dengan lesi yang dalam.6-8 Faktor-faktor
44% dari semua kasus keratitis mikroba, ini, khususnya terutama pada kasus
tergantung pada lokasi geografis.1,2 umumnya keratitis jamur yang parah, untuk
yang sering menyebabkan infeksi kornea memperlambat resolusi infeksi jamur,
termasuk Fusarium, Aspergillus, Curvularia, dengan sebagian besar kasus akhirnya
Bipolaris, dan Candida.1-3 Di antara spesies membutuhkan keratoplasty penetrasi
Candida, Candida albicans adalah agen etiologi terapeutik.8
yang paling umum dari keratitis.4Dalam bentuk
keratitis, satu atau lebih mata (misalnya, sekresi
air mata tidak cukup, penutupan kelopak mata
yang rusak) atau sistemik (misalnya, diabetes
mellitus, imunosupresi) kondisi menjadi
predisposisi infeksi. Bentuk infeksi mikotik ini Secara klinis, suspensi 5% Natamycin yang
juga dapat merubah defek epitel yang sudah ada tersedia secara komersial adalah obat awal pilihan
karena keratitis herpes atau karena lecet yang untuk keratitis jamur. Jika memburuk keratitis
disebabkan oleh lensa kontak yang
terkontaminasi..5 diamati pada Natamycin topikal, Amfoterisin B
(amp B) dapat diganti, meskipun topikal azoles
Pengelolaan keratitis jamur sebagian besar (misalnya,flukonazol dan vorikonazol) dianggap
melibatkan keputusan tentang penggunaan dan
rute pemberian antijamur.. Sebagian besar obat sebagai alternative yang baik untuk amp B untuk
antijamur yang tersedia saat ini memiliki pengobatan Candida keratitis. Mereka memiliki
penetrasi okular yang lebih baik dan kurang beracun ke
epitel kornea, dibandingkan dengan amp B.9-11
Klinis menentukan lama perawatan untuk setiap kasus
berdasarkan respon dan pengalaman klinis. Pengobatan
dengan agen antijamur sistemik dianjurkan dalam kasus
keratitis berat yang parah, skleritis, dan endophthalmitis.
Antijamur sistemik juga digunakan setelah PKP untuk
keratitis jamur9
Peningkatan antijamur diperlukan karena antijamur yang
ada dapat dikaitkan dengan khasiat, toksisitas, dan
resistensi yang terbatas. Munculnya strain jamur
resisten terhadap antijamur saat ini,, yang
diperburuk oleh kebutuhan untuk penggunaan
jangka panjang dari antijamur pada individu
immunocompromised, menyebabkan kesulitan
tambahan dalam pengobatan.13
Studi ilmiah terbaru telah mengevaluasi
kembali antibiotik lama, seperti kloramfenikol,
tetrasiklin, dan polimiksin, yang secara tradisional
digunakan untuk infeksi bakteri, untuk aktivitas
antijamur potensial mereka..14-17

Berdasarkan literatur dan pengalaman klinis, dalam penelitian ini, kami mengevaluasi aktivitas
antijamur dari kombinasi oftalmik antibakteri yang banyak digunakan (Colbiocin; SIFI SpA, Catania,
Italia) yang mengandung tetrasiklin (TET), kloramfenikol (CAF), dan natrium colistimethate (CS) ,
menggunakan tes in vitro dan model keratitis mikotik ex vivo. Uji spesifik juga dilakukan untuk
memahami mekanisme kerja.

BAHAN DAN METODE

Agen antimikroba

Kombinasi antibiotik tetap (AC) (Colbiocin; SIFI SpA) mengandung CAF (4 mg / mL), TET (5
mg / mL), dan CS (14,4 mg / mL). Flukonazol (FLC) diperoleh dari Sigma-Aldrich, Milan, Italia; CAF
dari Qu´ımica Sint'etica S.A., Madrid, Spanyol; TET dari Ningxia Qiyuan Pharmaceutical Co.,
Ningxia, Cina; dan CS dari Xellia Pharmaceuticals APS Dalslandsgade, Copenhagen, Denmark.

Strain
Strain berikut, diperoleh dari rumah sakit Italia di Messina dan Catania, digunakan untuk pengujian
antimikroba: Candida albicans ATCC 2091, C. albicans ATCC 10231, dan 14 klinis asing C. albicans
(n=7), Candida glabrata (n= 5), Candida utilis, dan Candida tropicalis. Ragi disimpan pada -70 0C
dalam vial Microbanks (DID; Pro-Lab Diagnostics, Ontario, Canada)..

In Vitro Study
Pengujian Kerentanan Antijamur. kerentanan obat ditentukan dengan menggunakan protokol
pengenceran microbroth Klinis dan Laboratorium Standards Institute.18,19 Kultur untuk uji aktivitas
antijamur ditumbuhkan dalam medium RPMI-1640 yang dilengkapi dengan MOPS (Oxoid, Milan,
Italia) pada 300C (48 jam).).
Kerja ragi disesuaikan dengan konsentrasi yang dibutuhkan 10 3 unit pembentuk koloni per mililiter
(CFU / mL). Daya AC direkonstitusi dalam 5 mL buffer mengandung EDTA, Polysorbate 80, dan air
murni. Dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) digunakan untuk melarutkan CAF dan TET dan
kemudian diencerkan hingga konsentrasi tertinggi (1% vol / vol) menggunakan media RPMI-1640.
FLC dilarutkan dalam medium RPMI-1640. Pengenceran dua kali lipat berurutan dari AC dan agen
antimikroba disiapkan di piring mikrotiter 96-baik di atas kisaran 0,016 hingga 2 mg / mL dalam
medium RPMI-1640 yang dilengkapi dengan MOPS. Piring diinkubasi selama 48 jam pada 35 0C.
Kontrol pertumbuhan (menengah dengan inokulum) dimasukkan. MIC90 didefinisikan sebagai
konsentrasi penghambatan minimum yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan 90%
organisme.. Untuk menentukan MFC (didefinisikan sebagai konsentrasi terendah agen antimikroba di
mana 99,9% mikroorganisme terbunuh), kaldu diambil dari masing-masing sumur dan diinokulasi
dalam Sabouraud Dextrose Agar (SDA) selama 48 jam pada 35 0C. Setiap penelitian dilaksanakan tiga
kali.

Pemeriksaan
Alat uji microdilution , sebuah susunan dua dimensi dari konsentrasi serial senyawa uji, digunakan
untuk menilai sinergisme obat. Konsentrasi hambat minimum (MIC) dari masing-masing antibiotik
yang termasuk dalam AC ditentukan secara individual atau dalam kombinasi untuk dua strain yang
dipilih: C. albicans ATCC 10231 dan C. albicans n. 4 isolat klinis. FLC diuji untuk perbandingan.
 Suspensi ragi disiapkan untuk menghasilkan inokulum akhir sekitar 2x10 3 CFU / mL. Piring mikro
dibaca setelah 48/72 jam inkubasi pada 350C. Setiap tes dilakukan dalam rangkap tiga. Hasilnya
dianalisis menggunakan pecahan indeks konsentrasi penghambatan (FICI), yang dihitung sebagai
berikut: FICI= (FICA+FICB [atau FICC]), di mana FICA= (MIC senyawa A di hadapan senyawa B) /
(MIC senyawa A saja). Demikian pula, penghambatan fraksional konsentrasi untuk senyawa B (atau
senyawa C) dihitung. Nilai FICI 0,5 ditafsirkan sebagai sinergi, sedangkan nilai FICI antara 0,5 dan 1,0
ditafsirkan sebagai aditif. Nilai-nilai FICI> 4.0 dianggap sebagai antagonism dan nilai-nilai FICI antara
1,0 dan 4,0 dianggap sebagai acuh tak acuh.20
Time-Killing Curve .
Kurva waktu untuk C. albicans ATCC 10231 dan C. albicans n. 4 isolat klinis dilakukan pada 10 kali
nilai MIC dari AC dan FLC. Ragi suspensi disiapkan untuk menghasilkan inokulum akhir sekitar 5 x
105 CFU / mL. Pada titik waktu yang telah ditentukan (0, 2, 4, 6, 8, 10, dan 24 jam), alikuot 0,1 mL
dihapus dari tabung kontrol (bebas obat) dan dari tabung dengan AC atau FLC untuk setiap strain.
Pengenceran serial dalam saline dilakukan. Volume 0,1 mL tersebar ke piring SDA dan diinkubasi pada
350C selama 24 hingga 48 jam untuk menentukan jumlah CFU / mL. Semua studi kurva waktu-
membunuh dilakukan dalam rangkap tiga.
Pengwarnaan Propidium Iodide.
Untuk menganalisis integritas membran, fraksi sel yang bertahan hidup dari C. albicans ATCC 2091
dan C. albicans n. 4 terkena AC dan masing-masing antibiotik diwarnai dengan larutan propidium
iodida (PI) (Sigma-Aldrich). Sampel kontrol dari kedua strain dilakukan untuk perbandingan. Secara
singkat, sel yang dirawat dan kontrol (105 sel / mL) dicuci dan disuspensikan dalam PBS (pH 7,0).
Untuk suspensi sel ini, solusi PI (larutan stok 1 mg / mL) kemudian ditambahkan ke suspensi sel ini
yang kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Sel dicuci lagi untuk menghilangkan
kelebihan pengwarnaan dan diperiksa di bawah mikroskop Axio Observer.Z1 dengan ApoTome.2
(Zeiss, Milan, Italia).

MitoTracker Staining.
Untuk mendeteksi perubahan permeabilitas membran mitokondria, fraksi sel yang bertahan hidup dari
C. albicans ATCC 2091 dan C. albicans n. 4 terkena AC dan setiap antibiotik diwarnai dengan pewarna
mitokondrion spesifik MitoTracker RedCMXRos (MTR) (Invitrogen, Fisher Scientific Italia, Rodano-
MI, Italia) sesuai dengan instruksi pabrik. Sampel kontrol dari kedua strain dilakukan untuk
perbandingan. Sel perlakuan dan kontrol (105 sel / mL) dikumpulkan dengan sentrifugasi dan
disuspensikan dalam medium segar dengan MTR pewarna mitokondria spesifik pada konsentrasi akhir
50 nM.21,22 Sel diinkubasi selama 15 menit pada 350C dalam gelap. Sel yang warnai dicuci tiga kali
dengan PBS dalam gelap dan segera diamati menggunakan mikroskop yang disebutkan di atas. MTR
memiliki eksitasi dan puncak emisi pada 579 dan 599 nm, masing-masing.

Ex Vivo Studi

Persiapan Inocula.
Strain berikut digunakan: C. albicans ATCC 2091 dan C. albicans n. 4. Ragi dikultur dalam media RPMI-
1640 yang dilengkapi dengan MOPS pada 358C selama 24 jam dan kemudian, beberapa koloni dari
setiap strain dicuci tiga kali dengan PBS untuk mencapai kepadatan 5x100 CFU / mL (V-1200-VWR,
Milan, Italia) dan kemudian diencerkan menjadi konsentrasi akhir dari inokulum (5x104 CFU / mL).
Kelinci Globe Harvest. Mata kelinci yang normal, diperoleh dari rumah potong hewan setempat,
dienukleasi segera setelah menetralisasi, dicuci sebelumnya dengan 1% povidone, dibilas dengan saline,
dan setelah direndam dalam tabung dengan 0,1% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM Ham's
F-12; PAA Laboratories, Biolife, Milan, Italia). Tabung, ditempatkan dalam wadah dengan es untuk
pengawetan, diangkut ke laboratorium dan digunakan segera.

Table 1. Nilai MIC, µg / mL

Strain CAF TET CS FLC AC,
Pengenceran

C. albicans ATCC 10231 2000 250 >2000 1,25 1:10

C. albicans ATCC 2091 2000 250 >2000 1,25 1:10
C. albicans 4 >2000 500 >2000 1,25 1:20
C. albicans 12 >2000 250 >2000 1,25 1:10
 C. albicans 13 >2000 500 >2000 1,25 1: 5
C. albicans 15 2000 250 >2000 1,25 1: 5
C. albicans 16 >2000 500 >2000 2,5 1:10
C. albicans 18 >2000 500 >2000 2,5 1:10
C. albicans 355 >2000 500 >2000 2,5 1:10
C. glabrata 1 >2000 250 >2000 4 1: 5
C. glabrata 3 2000 500 >2000 4 1:20
C. glabrata 8 >2000 500 >2000 4 1: 2
C. glabrata 9 >2000 500 >2000 4 1: 2
C. glabrata 10 >2000 500 >2000 4 1: 5
C. utilis >2000 500 >2000 2,5 1: 2
C. tropicalis >2000 250 >2000 2,5 1: 5

AC: Tetap kombinasi antibiotik yang mengandung CAF, TET, dan CS, di rasio tetap 1: 1: 3.

.
Kurva Pertumbuhan C. albicans. Kurva pertumbuhan C. albicans ATCC 2091 dan C. albicans n. 4
isolat okular dinilai menggunakan model keratitis ex vivo yang dimodifikasi.23
Mata secara acak dibagi menjadi dua kelompok (20 kornea per kelompok) yang sesuai dengan setiap
strain C. albicans. Untuk setiap kelompok, mata secara intrastromal disuntik dengan 50 lL dari suspensi
ragi (5x104 CFU / mL) menggunakan jarum 30-gauge. Kemudian kelompok dibagi menjadi lima
subkelompok (empat
mata masing-masing) sesuai dengan kurva pertumbuhan kali (0, 12, 24, 48, dan 72 jam dari
penghinaan). Cincin sclero-kornea setiap mata dipotong menggunakan gunting melengkung dan
ditempatkan pada dukungan kornea di piring berisi 2,5 mL DMEM seperti yang dijelaskan
sebelumnya.24,25
Kultur organ diinkubasi pada 370C didalam atmosfir yang dilembabkan 6% CO 2. Untuk membasahi
epitelium, 100 lL medium ditambahkan setetes ke permukaan epitel kornea setiap 12 jam. Media
budaya di piring itu berubah setiap 24 jam. Pada waktu tetap yang ditetapkan, kornea tanpa cincin
scleral ditimbang secara individual dan dihomogenisasi dalam 1 mL saline pada 48C selama 30 detik;
itu
homogenat secara serial diencerkan (1:10 pengenceran) dalam garam, dan diunggulkan dalam rangkap
dua ke SDA. Hasilnya dilaporkan ke jaringan berat dan dinyatakan sebagai CFU / g.

Pengobatan C. albicans Keratitis.

Dua puluh empat mata yang dienukleasi secara acak dibagi menjadi dua kelompok (12 kornea per
grup) yang sesuai dengan setiap strain C. albicans. Setiap kelompok disuntik intrastromal dengan
suspensi ragi 50 lL mengandung 5x104 CFU / mL. Pada 2 jam setelah injeksi (fase infeksi awal),
kornea dibagi menjadi tiga kelompok empat kornea masing-masing. Kelompok pertama diobati dengan
AC, kelompok kedua dengan FLC, dan kelompok kontrol ketiga dengan PBS. Rejimen pengobatan
terdiri dari enam instilasi harian (50 lL). Kemudian jaringan, 1 jam kemudian setelah berangsur-angsur
terakhir, dihomogenkan dan disepuh untuk menentukan jumlah CFU / g yang didapat kembali.

Analisis statistik
Hasilnya dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SD dari tiga percobaan dan dianalisis secara statistik oleh
ANOVA 1 arah,

Tabel 2. FICI CAF, TET, dan CS Diuji dalam Kombinasi 1: 1 Satu Sama Lain Terhadap C. albicans Strain
Strain CAF=TET TET=C CAF=
S CS
C. albicans ATCC 0,5 0,28 0,12
 10231
C. albicans n. 4 0,5 1 1
(cs)

FICI: nilai-nila i≤ 0,5 sinergisme, nilai antara 0,5 dan 1,0 aditif, nilai> 4,0 antagonisme, nilai antara 1,0
dan 4,0 tidak berbeda. c., strain klinis.

diikuti oleh Tukey posttest oleh GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA). Perbedaan kelompok dan
perawatan dianggap signifikan untuk P< 0.05.

HASIL
In Vitro Study

Uji Kerentanan Antijamur.

Nilai MIC90 untuk masing-masing antibiotik terhadap semua strain Candida spp. yang digunakan lebih
tinggi daripada yang diamati untuk referensi FLC. Di antara semua antibiotik yang diuji, TET adalah yang
paling efisien (MIC: 250-500 lg / mL). Nilai MIC terdeteksi dari pengenceran 1: 2 hingga 1:20 dari AC yang
direkonstitusi (Tabel 1).

Checkboard.
C. albicans ATCC 10231 dan C. albicans n. 4 isolat klinis dipilih untuk pengujian lebih lanjut. Dalam
pengujian microdilution checkerboard, pasangan antibiotik diuji dalam kombinasi dengan antibiotik satu
sama lain untuk menentukan Nilai-nilai FICI. Sinergi diamati untuk semua kombinasi yang diuji pada C.
albicans ATCC 10231. Khususnya, CAF=TET (FICI 0,5), TET = CS (FICI 0,28), dan CAF = CS (FICI
0,12). Sinergi juga diamati untuk kombinasi CAF=TET (FICI 0,5) C. albicans n. 4, sedangkan aditivitas
(FICI 1) terdeteksi untuk kombinasi lain (Tabel 2).

Kurva Time-Killing
Menunjukkan bahwa AC dan FLC, pada konsentrasi 10 kali MIC, mampu mempertahankan di bawah
kendali pertumbuhan C. albicans ATCC 10231 dan C. albicans n. 4 hingga 10 jam. Pada 24 jam, AC mampu
mengurangi beban 1 Log10 CFU / g dan 0,8 Log10 CFU / g, dibandingkan dengan inokulum awal untuk
strain ATCC dan untuk isolat klinis, masing-masing (Gambar 1). Perbedaannya secara statistik signifikan
terhadap kontrol, tetapi juga terhadap FLC (P <0,0001 untuk C. albicans ATCC 10231, P <0,001 untuk C.
albicans n. 4).

Pewarnaan PI. Propidium iodida, pewarna nuklir fluoresensi merah, adalah pewarna impermeant membran
yang umumnya dikeluarkan dari sel yang hidup. Pemeriksaan mikroskopis menunjukkan bahwa sel-sel
(sekitar 86,7%) dari kedua strain yang diobati dengan AC (1:10 vol / vol) berwarna merah mungkin karena
mereka kehilangan integritas membran sel. Sel-sel (sekitar 68,3%) diobati dengan CS (1000 lg / mL)
menunjukkan hasil yang sama, sedangkan 25,6% dari sel yang tidak diobati kehilangan permeabilitas
membran mereka (Gambar 2). Pewarnaan Sel positif (PI+) diamati di bawah mikroskop fluoresens..

MitoTracker Staining. MitoTracker adalah pewarna mitokondria spesifik dalam sel hidup dan akumulasinya
bergantung pada potensial membran. Namun, setelah dimasukkan dalam mitokondria, secara kimia dapat
terhubung ke kelompok tiol dan tidak akan meninggalkan mitokondria ketika potensial membran menurun
sebagai akibat dari fiksasi dan / atau kematian sel. Gambar mikroskop fluoresensi menunjukkan pewarnaan
positif di daerah jaringan mitokondria sel sehat yang tidak diberikan untuk kedua strain. Sel yang diobati
(sekitar 70%) dengan adanya TET (0,5 MIC) atau CAF (1000 lg / mL) menunjukkan pewarnaan
mitokondria yang lebih menyebar dan kurang intens, menunjukkan bahwa fungsi mitokondria berkurang
tetapi tidak dihilangkan. Sel-sel (sekitar 90%) diobati dengan AC
 FIGURE 1. Time-Killing Curve dari C. albicans ATCC 10231 (A) dan C. albicans n. 4 isolat klinis (B).
Berarti Log10 CFU / mL (± SD) perubahan C. albicans beban diobati dengan AC, FLC, atau saline
(888P< 0,001 vs FLC, **** P < 0,0001 dibandingkan kontrol, ** P < 0,01 dibandingkan kontrol).

(1:10 vol / vol) menunjukkan hasil yang sama. Gambar-gambar menunjukkan hanya bayangan sel yang
tidak memiliki mitokondria fungsional. Selain itu, pewarnaan menyoroti perubahan morfologis sel ragi
yang diobati dengan AC dan antibiotik menghormati sel-sel kontrol. AC, TET, dan CAF efek pada fungsi
mitokondria C. albicans ATCC 10231 ditunjukkan pada Gambar 3. Efek pada fungsi mitokondria C.
albicans n. 4 mirip dengan C. albicans ATCC 10231, karena itu tidak ditampilkan.

Ex Vivo Studi

C. albicans Kurva Pertumbuhan. Kurva pertumbuhan C. albicans ATCC 10231 dan C. albicans n. 4 strain
superimposibel. Beban mikotik yang diperoleh dari kornea setelah injeksi intrastromal adalah 3,3 ± 0,5
Log10 CFU / g. Setelah 24 jam dari tantangan jamur, beban meningkat sekitar 4 Log 10 CFU / g, tetap hampir
tidak berubah selama 72 jam, dan kemudian menurun (data tidak ditampilkan).

Pengobatan C. albicans Keratitis. AC efektif dalam percobaan keratitis kelinci ex vivo dalam mengurangi
beban C. albicans ATCC 10231 dan C. albicans n. 4. Oleh karena itu, AC secara signifikan mengurangi
beban kedua strain C. albicans oleh 4 Log10 CFU / g sehubungan dengan kontrol setelah enam dosis,
hingga 24 jam setelah infeksi (P <0,001). Selain itu, AC menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi daripada
FLC terhadap C. albicans ATCC 10231 (sekitar 1 Log10 CFU / g) (P <0,01). Kemanjuran serupa terhadap
C. albicans n. 4 diamati (Gbr. 4).

Diskusi

Fungi merupakan sel eukariotik yang menyebar dengan berbagai jalur pada sel manusia, hal itu
meningkatkan probabilitas dari aktivitas antifungal dari “ obat nonfungal”. Pada beberapa tahun yang lalu,
ada ketertarikan yang meningkat pada penggunaan antibiotik pada jamur. Obat lama yang baru-baru ini
digunakan kembali termasuk colistin, termosilin, fosfomisin, mesilinam, nitrofurantoin, dan kloramfenikol
untuk bakteri gram negative yang resisten terhadap berbagai obat dan trimetropin sulfametoksazol untuk
stapilokokus aureus yang resisten metisilin. Diantaranya, kolistin dan kloramfenikol juga telah dibuktikan
aktifitas antifungal yang melawan ragi.
 Pada penelitian ini, kita menemukan bahwa CAF, TET, dan CS lemah jika digunakan tunggal, ada
beberapa yang dapat digunakan tunggal yaitu FLC pada ragi candida, tapi aktifitas lebih tinggi pada
penggunaan secara AC dalam kombinasi yang tepat. Mekanisme yang mendasari masing-masing antibiotic
terhadap ragi dapat dijelaskan sebagai berikut: TET dan CAF mendorong ketidakseimbangan protein
mitonuklear dan disfungsi mitkondria, CS mengikat lipopolisakarida dan aniotik fosfolipid dalam sel
membrane bakteri, mengganggu integritas membrane.
Mekanisme kerja untuk tetrasiklin dan derivat deoksisilin adalah menghambat translasi melalui
pengikatan 30S ribosom unit pada bakteri. Khususnya untuk komponen bakteri dengan ekspektasi bahwa
tetrasiklin tidak mempengaruhi sel-sel eukariotik. Namun, tetrasiklin mengakibatkan ketidakseibangan
protein mitonuklear, dengan mengganggu proteostasis mitokondria dan menghambat fungsi mitokondria.
Ketidakseimbangan protein mitonuklear disertai dengan penurunan drastis respirasi selular, diindikasikan
untuk aktivitas kerusakan mikondria yang berat. Bahkan, tetrasiklin mengeliminasi pergeseran diauksi.
Kekurangan dari pergeseran diauksi atau kekurangan fungsi mitokondria mengubah metabolism akhir pada
derajat terendah ergosterol.
Kloramfenikol diketahui dapat menghambat translasi mitokondria di eukariot. Ikatan pada tempat A
dan menempati posisi yang sama sebagai aminosil Trna (aat-Trna), mencegah sintesis protein dalam
prokariot. Ikatan pada reseptor transferitin yang paling relevan dengan interaksi kloramfenikol-
mitokondria, terutama kloramfenikol mengurangi ikatan efek reseptor mitokondria transferitin, yang
menghasilkandeplesidalammitokondria.

Gambar 2. AC dan CS efek pada permeabilisasi membran oleh pewarnaan PI. (A) Sel diinkubasi dengan CS
(1000 lg / mL) selama 24 jam sebelum pewarnaan. (B) Sel diinkubasi dengan AC (1:10 vol / vol) selama 24 jam
sebelum pewarnaan. Sel diamati dan difoto menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik.
 GAMBAR 3. AC, TET, dan CAF efek pada fungsi mitokondria oleh pewarnaan MTR. (A) Sel
diinkubasi dengan TET pada konsentrasi sub-MIC (125 lg / mL) selama 24 jam sebelum pewarnaan.
(B) Sel diinkubasi dengan CAF (1000 lg / mL) selama 24 jam sebelum pewarnaan. (C) Sel diinkubasi
dengan AC (1:10 vol / vol) selama 24 jam sebelum pewarnaan. (D) Kontrol, sel yang tidak diobati pada
saat yang bersamaan. Sel diamati dan difoto menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik..

GAMBAR 4. Khasiat pengobatan AC terhadap C. albicans ATCC 10231 atauC. albicans n. 4 isolat klinis. Berarti
Log10 CFU / g (± SD) perubahan C. albicans ATCC 10231 atau C. albicans n. 4 muatan AC versus FLC yang
dirawat atau kelompok kontrol dalam jaringan kornea (88% <0,01 dibandingkan dengan FLC, * P <0,001
dibandingkan kontrol).

Polimiksin mengikat lipopolisakarida dan fosfolipid anionik dalam membran sel bakteri gram
negatif, mengganggu integritas membran.17 Polymyxins adalah hepatapeptida siklik kationik dengan ekor
hidrofobik yang berinteraksi dengan membran sitoplasma bakteri, sehingga mengubah permeabilitas dan
memicu kematian sel.26 Aktivitas antijamur lemah dari colistin dan polimiksin B terhadap beberapa jamur
telah dilaporkan.31–33 Sebagaimana dihipotesiskan oleh Zhai et al.14 dalam 2010, polimiksin B membunuh
jamur melalui pengikatan lipid anionik pada membran jamur dan gangguan integritas membran. Efisiensi
yang lebih rendah dari polimiksin sendiri terhadap eukariota dibandingkan dengan bakteri dapat sebagian
karena kehadiran sterol dalam membran eukariotik, seperti sterol telah terbukti mengurangi penyisipan
peptida katkation ke dalam membran campuran anionik untuk membentuk pori-pori.

Selain itu, hasil ini menunjukkan bahwa kombinasi budaya organ kornea dan keratitis mikroba
eksperimental memiliki potensi untuk digunakan sebagai alternatif berbasis mekanis untuk pengujian hewan
in vivo. Meskipun model ex vivo kurang elemen kekebalan tubuh, arsitektur tiga dimensi tetap, seperti
halnya molekul imun bawaan intraseluler dan komponen selulerstromal.

Kesimpulannya, kami menunjukkan bahwa AC yang mengandung tiga antibiotik dalam kombinasi tetap
memiliki kemanjuran yang tinggi terhadap Candida spp., Baik dalam model in vitro maupun ex vivo. Efek
yang dilaporkan dapat disebabkan oleh berbagai cara kerja dari tiga agen antimikroba yang digunakan dalam
kombinasi: CS meningkatkan permeabilitas membran ragi yang memungkinkan penetrasi TET dan CAF
berikutnya, yang mengubah fungsi mitokondria.

AC telah banyak digunakan di pasar Italia dan negara-negara Eropa lainnya sebagai obat tetes mata /
salep untuk mengobati infeksi mata bakteri selama 50 tahun. Berdasarkan hasil ini, kita dapat
mengasumsikan bahwa AC memiliki potensi untuk digunakan secara klinis sebagai obat pilihan pertama
ketika diagnosis keratitis menular yang disebabkan oleh bakteri atau jamur tidak jelas. Tes diagnostik khusus
diperlukan untuk mengesampingkan kondisi dan, jika perlu, kemajuan ke perawatan yang tepat. Studi lebih
lanjut, bagaimanapun, diperlukan pada jamur dan strain jamur lainnya, seperti Fusarium dan Aspergillus,
untuk memperluas temuan ini.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis mengucapkan terima kasih Eileen Collazo untuk bantuan ahli bahasa Inggris.
Penyingkapan: AR Blanco, SIFI SpA, (E); A. Nostro, Tidak; V. D'Angelo, Tidak; M. D'Arrigo, Tidak;
MG Mazzone, SIFI SpA, (E); A. Marino, Tidak

Referensi
1. Gower EW, Keay LJ, Oechsler RA, et al. Tren keratitis jamur di Amerika Serikat, tahun 2001
sampai 2007. Ophthalmology. 2010; 117: 2263-2267.
2. Garg P. jamur, mikobakteri, dan infeksi Nocardia dan mata: update. Eye (Lond). 2012; 26: 245-
251.
3. Revankar SG, Sutton DA. Melanized jamur pada penyakit manusia. Clin Microbiol Rev 2010; 23:
884-928.
4. Khater MM, Shehab NS, El-Badry AS. Perbandingan keratitis mikotik dengan keratitis
nonmycotic: studi epidemiologi. J Ophthalmol. 2014; 2014: 254.302.
5. Thomas PA, Kaliamurthy J. Mycotic keratitis: epidemiologi, diagnosis dan manajemen. Clin
Microbiol Menginfeksi. 2013; 19: 210-220.Qiu S, Zhao GQ, Lin J, et al. Natamycin dalam
pengobatan keratitis jamur: review sistematis dan meta-analisis. Int J Ophthalmol. 2015; 8: 597-
602.
6. Ansari Z, Miller D, galor A. pengalaman sekarang di keratitis jamur: diagnosis dan pengobatan.
Curr jamur Menginfeksi Rep 2013; 7:. 209-218.
7. Chang HY, Chodosh J. diagnostik dan terapeutik mempertimbangkan-negosiasi di keratitis jamur.
Int Ophthalmol Clin. 2011; 51: 33- 42.
8. Rose-Nussbaumer J, Prajna NV, Krishnan T, et al. kelompok percobaan pengobatan ulkus mikotik.
Faktor risiko untuk low vision fungsi terkait dalam sidang pengobatan ulkus mikotik: uji coba
secara acak membandingkan Natamycin dengan vorikonazol. Br J Ophthal-mol. 2016; 100: 929-
932.
9. Maharana PK, Sharma N, Nagpal R, et al. kemajuan terbaru dalam diagnosis dan manajemen dari
keratitis mikotik. India J Ophthalmol. 2016; 64: 346-357.
 10. Li PH, Chen CC, Liou SW. Candida parapsilosis keratitis berhasil diobati dengan flukonazol
topikal dan oral. Taiwan J Ophthalmol. 2016; 6: 155-157.
11. Morschh¨auser J. Perkembangan resistensi fluconazole di Candida albicans-contoh dari evolusi
mikro dari jamur patogen. J Microbiol. 2016; 54: 192-201.
12. Karagoz E, Ugan RA, Duzgun E, et al. studi perbandingan efek anidulafungin intravitreal,
vorikonazol, dan amfoterisin B di model endophthalmitis Candida eksperimental. Curr Res Eye.
2016; 27: 1-8.
13. Zhai B, Zhou H, Yang L, et al. Polimiksin B, dalam kombinasi dengan flukonazol, memberikan
sebuah efek fungisida kuat. J Antimicrob Chemother. 2010; 65: 931-938.
14. Joseph MRP, Al-Hakami AM, Assiry MM, et al. Dalam kegiatan anti-jamur vitro kloramfenikol:
laporan awal. J Mycol Med. 2015; 25: 17-22.
15. Moullan N, Mouchiroud L, Wang X, et al. Tetrasiklin mengganggu fungsi mitokondria di seluruh
model eukariotik: panggilan untuk berhati-hati dalam penelitian biomedis. Sel Rep 2015; 10:.
1681-1691.
16. Pankey G, Ashcraft D, Kahn H, Ismail A. assay Waktu-kill dan evaluasi Etest untuk bersinergi
dengan polimiksin B dan flucona-zole terhadap Candida glabrata. Antimicrob Agen Kemo-ther.
2014; 58: 5795-5800.
17. CLSI-Klinis dan Laboratorium Standards Institute. Metode referensi untuk Broth Dilusi Antijamur
Kerentanan Pengujian Ragi, Disetujui Standar M27-A3. Wayne, PA: Klinis dan Laboratorium
Standar Standards Institute; 2008.
18. Pfaller MA, Diekema DJ. Kemajuan dalam uji kerentanan antijamur Candida spp. dengan
menggunakan metode kaldu mikrodilusi Klinis dan Laboratorium Standards Institute, 2010
sampai 2012. J Clin Microbiol. 2012; 50: 2846-2856.
19. Van Vuuren S, Viljoen A. Tanaman berbasis metode penelitian antimikroba dan pendekatan untuk
mempelajari interaksi antara produk alami. Planta Med. 2011; 77: 1168-1182.
20. Oliver BG, Perak PM, Marie C, Hoot SJ, Leyde SE, Putih TC. Tetrasiklin mengubah kerentanan
obat di Candida albicans dan jamur patogen lainnya. Mikrobiologi. 2008; 154: 960- 970.
21. Shibata T, Takahashi T, Yamada E, et al. T-2307 menyebabkan runtuhnya potensial membran
mitokondria dalam ragi. Antimicrob Agen Chemother. 2012; 56: 5892-5897.
22. Marino A, Blanco AR, Ginestra G, Nostro A, Bisignano G. Ex vivo kemanjuran gemifloxacin di
keratitis eksperimental yang disebabkan oleh methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Int J
Antimicrob Agents. 2016; 48: 395-400.
23. Marino A, Santoro G, Spataro F, et al. peran resveratrol dalam peradangan kornea Staphylococcus
aureus yang diinduksi. Jalan-og Dis. 2013; 68: 61-64.
25. Marino A, Pergolizzi S, Lauriano ER, et al. aktivasi TLR2 di sel stroma kornea oleh keratitis
Staphylococcus aureus yang disebabkan. APMIS. 2015; 123: 163-168.
26. Zeidler U, Bougnoux ME, Lupan A, et al. Sinergi dari colistin antibiotik dengan antijamur
echinocandin dalam spesies Candida. J Antimicrob Chemother. 2013; 68: 1285-1296.
27. Hughes AL, Lee CY, Bien CM, Espenshade PJ. sterol 4-Metil mengatur fisi ragi SREBP-Scap
bawah oksigen rendah dan stres sel. J Biol Chem. 2007; 282: 24.388-24.396.
28. Schlunzen F, Zarivach R, Harms J, et al. dasar struktural untuk interaksi antibiotik dengan pusat
peptidil transferase di Eubacteria. Alam. 2001; 413: 814-821.
29. Grivell L, Walg H. Subunit homologi antara Escherichia coli, mitokondria dan ribosom kloroplas.
Biochem Biophys Res Commun. 1972; 49: 1452-1458.
30. Barnhill AE, Brewer MT, Carlson SA. Efek samping dari antimikroba melalui penghambatan
diprediksi atau istimewa dari
IOVS j Agustus 2017 j Vol. 58 j No. 10 j 4298

tuan rumah komponen mitokondria. Antimicrob Agen Kemo-ther. 2012; 46: 4046-4051.
31. Nicholls MW. sensitivitas polimiksin Candida tropicalis. J Med Microbiol. 1970; 3: 529-538.
32. Schwartz SN, Medoff G, Kobayashi GS, Kwan CN, sifat Schlessinger D. Antijamur polimiksin B
dan potensiasi nya tetrasiklin sebagai agen antijamur. Antimicrob Agen Chemother. 1972; 2: 36-40.
33. Ben-Ami R, Lewis RE, Tarrand J, Leventakos K, Kontoyiannis DP. aktivitas antijamur colistin
terhadap Mucorales spesies in vitro dan dalam model murine infeksi pulmo-nary Rhizopus oryzae.
Antimicrob Agen Chemother. 2010; 54: 484- 490.
34. Pinnock A, Shivshetty N, Roy S, et al. Ex vivo kelinci dan kornea mata manusia sebagai model
untuk keratitis bakteri dan jamur. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2017; 255: 333-342.