VillanuevaLuAE PDF

Espectroscopia Raman en fluidos
biológicos extracelulares
Por
M. C. Adrián Eugenio Villanueva Luna
Tesis sometida como requisito parcial para

obtener el grado de Doctor en Ciencias en la
especialidad de Óptica en el Instituto Nacional
de Astrofísica, Óptica y Electrónica.
Supervisada por:
Dr. Jorge Castro Ramos
©INAOE 2013
Derechos Reservados
El autor otorga al INAOE el permiso de reproducir y distribuir
copias de esta tesis en su totalidad o en partes.
B
En la entrega del premio nobel Raman estaba en completa
abstinencia de alcohol, y se le pregunto porque razón no estaba
tomando el respondió:
"Señor, usted ha visto el efecto Raman en alcohol, por favor no
trate de ver el efecto del alcohol en Raman."
Chandrasekhara Venkata Raman
“Recuerden niños, la diferencia entre perder el tiempo y hacer
ciencia es escribirlo”
Adam Savage
“Cuando me examino a mí mismo y mis métodos de
pensamiento, llego a la conclusión de que el don de la fantasía
ha significado más para mí que cualquier otro talento para el
pensamiento abstracto y positivo”
Albert Einstein.
A
Dedicatoria
A mi madre Rosa del Carmen Luna Vela y a mi padre

Nicolás Villanueva García por su apoyo en todo momento a lo
largo de este tiempo del desarrollo de mi doctorado.
B
Agradecimientos
Le agradezco a mi hermano y mis hermanas, Armando, María del Carmen, Martha Edith,
Verónica y Aracely Guadalupe por su apoyo moral en todo momento. A mi asesor el Dr. Jorge
Castro Ramos por dejarme desarrollar este proyecto, sus valiosas discusiones que le aportaron a
este trabajo, además de su paciencia en la forma de analizar los resultados obtenidos en cada
experimento. Al Dr. Sergio Vázquez y Montiel por creer en este proyecto cuando se le presento
la propuesta. A Carlos Ortiz Lima sin su ayuda no se habrían obtenido tan buenos dibujos para
esta tesis, además de sus valiosos consejos en la estructura y presentación de esta tesis. A Daniel
Sánchez Lucero por sus valiosas discusiones que me hacían reflexionar en el desarrollo de los
experimentos y por su valiosa ayuda en la realización de la etapa xy del arreglo experimental
utilizado para los experimentos de mapas. A José Gabriel Aguilar Soto por sus discusiones sobre
este trabajo. Al Dr. Aarón Flores Gil por toda su motivación y asesoría para el desarrollo de este
trabajo. A los voluntarios de los experimento realizados para este trabajo de tesis sin su ayuda no
hubiera sido posible alcanzar el objetivo y las metas trazadas para llevar a cabo este trabajo. Al
Dr. Michael D. Morris por darme la oportunidad de realizar una estancia en su laboratorio en la
universidad de Michigan, sus conversaciones educativas que me sirvieron mucho para aprender
más sobre espectroscopia Raman. Al Dr. Francis Esmonde-White por su asesoría y consejos en
todo momento de mi estancia en el laboratorio Morris. A la Dra. Karen Esmonde-White por su
ayuda y consejos en el trabajo realizado en mi estancia. A los miembros del grupo Morris
Katherine, Alex, Mekhala, Gurjit, John, Bo, Ingeborg y Peizhi, por toda su ayuda en los trámites
administrativos que tuve que realizar. A los miembros del grupo de óptica Biomédica de INAOE
por sus preguntas en los seminarios sobre el trabajo de tesis. Al Dr. Agustín Alvarado Santiago
por su ayuda en la realización de los Phantoms de PDMS. Al Dr. Francisco Renero Carrillo por
su ayuda en la caracterización de los Phantoms de PDMS. A los sinodales por sus valiosos
comentarios para la mejoría de la tesis presentada. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT) por haberme brindado la beca de doctorado y su apoyo con una beca mixta para
realizar mi estancia. A la Fundación Pablo García por haber creído en mi proyecto y haberme
brindado una beca a crédito a lo largo de mis estudios de doctorado. Al Instituto Nacional de
Astrofísica Óptica y Electrónica por haberme dejado utilizar sus instalaciones para el desarrollo
de mi tesis doctoral. A Liliana Perea por haber enviado los artículos que se necesitaron a lo largo
de este trabajo de tesis doctoral. Finalmente a las secretarias de la coordinación de óptica, Paty y
Eicela sin su ayuda en los tramites de compras y viáticos esto no hubiera sido posible.
C
D
Resumen
En este trabajo se hizo un estudio de la espectroscopia Raman en fluidos extracelulares,
específicamente en fluidos intersticiales que se encuentran entre el dedo índice y el dedo pulgar
con el fin de identificar las líneas espectrales de la glucosa, colesterol y triglicéridos.
Conjuntamente los resultados muestran la dependencia entre la fluorescencia del espectro
Raman con el color de la piel, un parámetro que se tiene que considerar cuando se hacen
experimentos in vivo. Además se evaluaron los lugares del cuerpo donde se reportan en la
literatura que se encuentran una gran cantidad de fluido intersticial y en el cual se tomaron los
espectros Raman, dicha evaluación se hizo haciendo mapas de la piel y midiendo la estructura
de la superficie usando tomografía óptica coherente. Adicionalmente se hicieron simuladores de
tejido sintéticos mejor conocidos como phantoms, usando polidimetilsiloxano como base
mezclados con lípidos sintéticos y glucosa, con el objetivo de ver el comportamiento de los
espectros Raman en dicha mezcla. Otra de las variables evaluadas fue el tipo de sangre de la
muestra para observar si se tenía una influencia adicional en el espectro Raman obtenido. Para
ver la influencia mencionada se hizo un análisis de componentes principales, el cual muestra
que se tiene una pequeña variación con el tipo de sangre. También se evaluó la regeneración del
colágeno con la intención de ver si se tiene una influencia en el espectro Raman que se quiere
obtener. Igualmente se presenta una evaluación de diferentes configuraciones geométricas de
punta de prueba para mejorar la colección de la señal en el experimento. Esto se logró haciendo
simulaciones de la razón entre fluorescencia y señal Raman usando NIRFAST, para corroborar
los resultados se hicieron experimentos haciendo simuladores de tejidos con base de gelatina y
se utilizó un tubo de silicona en el cual se le hizo pasar glucosa liquida. Para medir el
rendimiento de la geometría óptima se comparó con otras geometrías propuestas haciendo una
evaluación global de la intensidad de la banda espectral de la silicona. Los resultados
encontrados en este trabajo de tesis muestran que se tiene un gran potencial para hacer la
cuantificación de las líneas espectrales de los lípidos y la glucosa en la sangre.
I
Índice general
Abstract
In this work, extracellular fluids, specifically interstitial fluids found in between the index and
thumb finger, were examined using Raman spectroscopy in order to identify spectral lines of
glucose, cholesterol and triglycerides. in vivo Raman imaging measurements of skin at body sites
reported in the literature to contain large amount of interstitial fluid were correlated with
surface structural information obtained using optical coherence tomography.
Polydimethylsiloxane tissue phantoms with imbedded lipids and glucose were used to obtain
reference spectra of glucose-lipid mixtures in tissue. Principal component analysis of the Raman
imaging data showed that there were small variations in Raman signal with sample blood type.
The correlation of collagen and water content were evaluated to determine the influence of skin
hydration on the Raman data. A fiber optic probe for through the skin measurements was
developed by first optimizing the fiber geometry using Nirfast simulations. Fiber geometries
were then compared experimentally by making an overall assessment of the spectral band
intensity of silicone to verify the optimum configuration. Using the optimized geometry, the ratio
of fluorescence and Raman Nirfast simulations were corroborated with Raman probe
measurements of gelatin phantoms containing glucose solution filled silicone tubes. In
conclusion, the results show that Raman spectroscopy has great potential for the quantification
of lipids and blood glucose. Results show dependence between Raman fluorescence and skin
color. This needs to be considered with in vivo experiments.
II
Índice general
Índice general
Dedicatoria ........................................................................................................................................ B
Agradecimientos .................................................................................................................................... C
Resumen .......................................................................................................................................... I
Abstract ........................................................................................................................................ II
Lista de figuras ...................................................................................................................................... III
Lista de tablas ....................................................................................................................................... VI
Capitulo 1. Introducción ..................................................................................................................... 1
1.1 Objetivos y Metas de la tesis ............................................................................................. 4
1.2 Estructura de la tesis ......................................................................................................... 4
Capitulo 2. La piel .............................................................................................................................. 6
2.1 Introducción ..................................................................................................................... 6
2.2. Estructura general histológica ........................................................................................... 6
2.2.1. Epidermis ............................................................................................................................. 7
2.2.2 Dermis ................................................................................................................................. 8
2.2.3 Tejido subcutáneo ................................................................................................................ 9
2.3 Lípidos ........................................................................................................................... 10
2.4. El fluido intersticial ........................................................................................................ 10
2.5. Glucosa .......................................................................................................................... 12
2.6. Colesterol ....................................................................................................................... 13
2.7. Triglicéridos ................................................................................................................... 14
Capitulo 3. Espectroscopia Raman .................................................................................................... 16
3.1. Introducción ................................................................................................................... 16
3.2. Descripción del efecto Raman......................................................................................... 17
3.3. Ruidos en espectroscopia Raman .................................................................................... 21
3.3.1 Ruido de disparo (Shot noise) ............................................................................................. 21
3.3.1. Ruido generado por la muestra ........................................................................................... 22
3.3.2. Ruido generado por la instrumentación ............................................................................... 22
3.3.3. Ruido computacional .......................................................................................................... 22
3.3.4. Ruido generado por fuentes externas .................................................................................. 22
3.4. Vibraciones moleculares ................................................................................................. 24
Capitulo 4. Técnicas y métodos usados ............................................................................................. 29
I
Índice general
4.1. Tomografía óptica coherente........................................................................................... 29

4.2. Análisis de componentes principales (PCA) .................................................................... 30
4.3. NIRFAST ....................................................................................................................... 31
4.3.1. Aproximación de la difusión............................................................................................... 32
4.3.2. Implementación en elementos finitos .................................................................................. 33
4.4. Arreglo experimental y componentes utilizadas .............................................................. 34
4.4.1. Espectrómetro QE65000..................................................................................................... 34
4.4.2. Componentes del espectrómetro QE65000 .......................................................................... 35
4.4.2.1. Diseño con filtraje eficiente ........................................................................................ 36
4.4.2.2. Láser 785 nm .............................................................................................................. 37
4.5. Arreglo experimental ...................................................................................................... 38
Capitulo 5. Método de procesado ...................................................................................................... 39
5.1 Reducción de ruido usando wavelets ............................................................................... 39
5.1.1. Wavelets ............................................................................................................................ 39
5.1.2. Wavelets discretas .............................................................................................................. 41
5.1.2.1. Transformada inversa a partir de los coeficientes ........................................................ 41
5.1.3. Wavelets symlets ................................................................................................................ 43
5.1.4. Descripción del método ...................................................................................................... 44
5.2. Método adaptivo MimMax. ............................................................................................ 47
5.2.1. Ajuste polinomial modificado............................................................................................. 47
5.2.2. Ajuste adaptable ................................................................................................................. 47
5.2.3. Ajuste Polinomial en forma restringida ............................................................................... 49
5.2.4. Ajuste polinómico MimMax ............................................................................................... 49
Capitulo 6. Resultados ...................................................................................................................... 51
6.1. Efectos del color de piel en los espectros Raman............................................................. 51
6.2. Mapas Raman de la piel .................................................................................................. 52
6.2.1. Mapeo de punto a punto ..................................................................................................... 53
6.2.2. Escaneo de línea ................................................................................................................. 53
6.2.3. Iluminación global.............................................................................................................. 54
6.2.4. Datos obtenidos .................................................................................................................. 55
6.3. Imágenes OCT de la piel ................................................................................................ 61
6.4. Efectos del colágeno en el espectro Raman ..................................................................... 64
6.5. Efectos del tipo de sangre en el diagnostico .................................................................... 66
II
Índice general
6.6. Simulaciones con tejido sintético .................................................................................... 70

6.7. Espectros Raman de fluidos intersticiales ........................................................................ 74
6.8. Diferentes geometrías de puntas de prueba Raman .......................................................... 78
6.8.1. Simulaciones usando NIRFAST ......................................................................................... 80
6.8.2. Evaluación experimental de las puntas de prueba Raman .................................................... 84
Capitulo 7. Conclusiones y trabajo a futuro....................................................................................... 92
Capitulo 8. Referencias..................................................................................................................... 95
Apendice A: Lista de publicaciones ..................................................................................................... 100
Apéndice B: ANSI Z136.1-2007.......................................................................................................... 101
Apéndice C: Programas escritos para esta tesis .................................................................................... 103
Índice de figuras
Figura 1 Capas de la piel[31]. .................................................................................................................. 7
Figura 2 Iso-forma D y L de la glucosa. ................................................................................................. 12
Figura 3 Estructura Molecular del colesterol. ......................................................................................... 13
Figura 4 Estructura molecular de los triglicéridos................................................................................... 15
Figura 5 Se ilustra el experimento realizado por C.V Raman. ................................................................. 18
Figura 6 Diagrama de Jablonski ............................................................................................................. 19
Figura 7 Espectro Raman del sulfuro, mostrando los cambios Stokes y anti-stokes. ................................ 20
Figura 8 Tipos de ruidos. ....................................................................................................................... 23
Figura 9 Se muestra las bandas Raman y la fluorescencia de Fondo. ...................................................... 24
Figura 10 Se muestra la molécula del etileno planar. .............................................................................. 25
Figura 11 Diagrama esquemático del sistema que se tiene en el laboratorio. ........................................... 30
Figura 12 Secuencia usada en NIRFAST para el modelo directo. ........................................................... 34
Figura 13 Componentes del espectrómetro Raman QE65000. ................................................................ 35
Figura 14 Diagrama de la punta de prueba ............................................................................................. 37
Figura 15 Arreglo experimental empleado en esta tesis .......................................................................... 38
Figura 16 Espectro wavelet resultante de escalar la wavelet madre en dominio del tiempo ..................... 40
Figura 17 Wavelet Symlet 6, (izquierda) función de escala y (derecha) función Wavelet ........................ 43
Figura 18 Descomposición de multi-resolución. ..................................................................................... 45
Figura 19 Ejemplo de un espectro descompuesto en multi-resolución..................................................... 45
Figura 20 Descomposición de la señal usando wavelets. ........................................................................ 46
Figura 21 Espectro Raman sin ruido. ..................................................................................................... 46
Figura 22 Espectro de la muestra con adición de fondo Gaussiano con diferentes proporciones F/S. El
contorno del espectro original visible se presenta en una proporción de 10, mientras que el otro espectro
tiene una proporción de fluorescencia de 100. ........................................................................................ 48
Figura 23 Se muestran los residuos de los espectros normalizados restando el ajuste del espectro original.
.............................................................................................................................................................. 48
III
Índice general
Figura 24 Se muestra el espectro del polinomio sin restricciones (ajuste de quinto orden) y el restringido
(ajusto de quinto orden restringido) que se ajustan para remover la fluorescencia. .................................. 49
Figura 25 Ejemplo de la forma del ajuste MimMax en un espectro con fluorescencia de fondo gaussiano.
.............................................................................................................................................................. 50
Figura 26 Se muestran los distintos colores de piel de los voluntarios de este experimento. .................... 51
Figura 27 Se muestra la fluorescencia del espectro Raman obtenidos de los voluntarios. ........................ 52
Figura 28 Arreglo óptico básico de una punta de prueba, donde D es el diámetro de la fibra de excitación,
FC es la distancia focal de la lente colimadora, FF es la distancia focal de la lente que da la distancia focal
de la punta de prueba y S es la mancha que genera el láser. .................................................................... 55
Figura 29 Arreglo experimental empleado para hacer los mapas de la piel.............................................. 56
Figura 30 Imagen de la interface desarrolla en LabVIEW para realizar los mapas de la piel. .................. 56
Figura 31Concepto de cómo se realizaron los mapas. ............................................................................. 57
Figura 32 Esquema de espectros que se encuentran dentro del mapa. ..................................................... 57
Figura 33 Mapa espectros Raman de la palma de la mano. ..................................................................... 58
Figura 34 Mapa de espectros Raman del dorso de la mano. .................................................................... 59
Figura 35 Mapa de espectros de Raman de la piel con similares características. ..................................... 59
Figura 36 Mapa de espectros Raman de los cambios por las cicatrices. .................................................. 60
Figura 37 Mapa de espectros Raman de los cambios por los lunares. ...................................................... 60
Figura 38 Se muestran los diferentes colores de piel de los voluntarios para este experimento. ............... 61
Figura 39 Imágenes de cuatro voluntarios dos mujeres (V6 y V9) y dos hombres. .................................. 62
Figura 40 Se muestras las imágenes OCT de dos voluntarios de todas las áreas que se están midiendo en
este experimento. ................................................................................................................................... 62
Figura 41 Imágenes OCT del voluntario 1 al 5 se muestran todas las áreas donde se midió..................... 63
Figura 42 Imágenes OCT del voluntario 6 al 10 se muestran todas las áreas donde se midió. .................. 63
Figura 43 Imagen OCT (arriba) y (abajo) la transformada de Fourier del área señalada con la flecha. ..... 63
Figura 44 Se muestras los cambios del colágeno a 507 cm-1. .................................................................. 64
Figura 45 Se muestra las variaciones del colágeno a 937 cm-1. ............................................................... 65
Figura 46Se muestran las variaciones espectrales de dos bandas del colágeno (1330 y 1345 cm-1). ......... 65
Figura 47 Se muestra la línea espectral más intensa relacionada con el colágeno, la cual se encuentra en
1635 cm-1............................................................................................................................................... 66
Figura 48 Se muestran las bandas de hemoglobina (grises) y las de fibrina (amarillo) de los voluntarios
con O+. ................................................................................................................................................. 68
Figura 49 Se muestran las variaciones de estos espectros normalizados a 1002 cm-1. .............................. 69
Figura 50 Se muestra las distribución de la muestras usando la componente principal 1 y la 2. ............... 69
Figura 51 Se muestra una gráfica Biplot donde se ilustran las contribuciones de cada una de las variables.
.............................................................................................................................................................. 70
Figura 52 Metodología de fabricación de tejidos sintéticos de PDMS (a) medición de los componentes,
(b) mezclar los componentes, (c) extracción de burbujas en la cámara sónica y (d) verter de mezcla en un
recipiente para la generación del tejido sintético de PDMS. ................................................................... 71
Figura 53 Se muestra el espectro Raman de los componentes utilizados para realizar los tejidos sintéticos
.............................................................................................................................................................. 72
Figura 54 Perfil Y de 3 tejidos sintéticos. (a) tejido sintético 2, (b) tejido sintético 4 y (c) tejido sintético 6.
.............................................................................................................................................................. 73
Figura 55 Espectro Raman del phantom 1 y 2. ....................................................................................... 73
IV
Índice general
Figura 56 Espectros Raman del tejido sintético 3(F3), tejido sintético 4(F4), tejido sintético 5(F5) y tejido
sintético 6(F6). ...................................................................................................................................... 74
Figura 57 Espectros Raman de fluidos intersticiales ............................................................................... 75
Figura 58 Espectros Raman de fluidos intersticiales, en donde se muestran 3 bandas importantes de
glucosa, colesterol y triglicéridos. .......................................................................................................... 76
Figura 59 Espectros Raman de fluidos intersticiales y colesterol. ........................................................... 76
Figura 60 Espectros Raman de fluidos intersticiales y glucosa. .............................................................. 77
Figura 61 Espectros Raman de fluidos intersticiales y triglicéridos. ........................................................ 77
Figura 62 (derecha) Espectro Raman de la glucosa Solida y (izquierda) espectro Raman de la glucosa
liquida. .................................................................................................................................................. 79
Figura 63 Espectro Raman de la banda más representativa de la silicona. ............................................... 79
Figura 64 Cilindro generado para realizar simulación. En este cilindro se muestran 3 capas pero solo se
utilizaron dos. ........................................................................................................................................ 80
Figura 65 Se muestra la variación del coeficiente de esparcimiento y absorción con respecto a la
profundidad. (Izquierda) variación del coeficiente de absorción (0.012, 0.042 and 0.082 mm-1) con un
coeficiente de esparcimiento de 3.5 mm-1. (Derecha) variación del coeficiente de esparcimiento con
respecto a la profundidad (0.7, 1.9 and 3.5 mm-1) coeficiente de absorción de 0.012 mm-1....................... 81
Figura 66 Modelos de absorción (izquierda) y (derecha) esparcimiento. También la fuente en distintas
posiciones (parte superior) de origen en 2.5 mm ejes, (centro) y origen mm (abajo) Fuente de +5 mm. ... 82
Figura 67 Se muestra las configuraciones más eficientes teniendo la fuente de iluminación en eje a +2.5 y
5 mm, a una profundidad de 1 mm. ......................................................................................................... 83
Figura 68 Se muestran las geometrías propuestas para ser comparadas con la de mayor eficiencia. Esta
comparación se hará de manera experimental......................................................................................... 84
Figura 69 Se muestra la imagen espectral de las fibras 50 de las diez ramas diferentes, el orden es rama 1
en inferior y 10 en la parte superior. Esta imagen muestra el perfil espectral de fibras iluminado por una
fuente de luz blanca. .............................................................................................................................. 85
Figura 70 Se muestran los diferentes perfiles espaciales de las ramas de fibras que se utilizan para este
experimento........................................................................................................................................... 85
Figura 71 En esta figura se muestra la distancia entre el borde del contenedor y gelatina. La figura de la
parte superior derecha muestra la montura utilizada para probar las configuraciones propuestas y las
ramas de fibra. La figura de la gelatina con el tubo de silicona y las dimensiones del tubo de silicona se
muestran en la parte inferior. ................................................................................................................. 86
Figura 72 Se muestra fibras antes y después de la limpieza con metanol................................................. 87
Figura 73 (Izquierda) Muestra el tejido sintético hecho con gelatina utilizando intralípido II. (Centro)
Tejido sintético liquido hecho con agua e intralípido II, y (derecha) se muestra el montaje experimental
para medir el espectro de la fibra usando luz blanca. .............................................................................. 87
Figura 74 Se muestra el perfil de intensidad de del espectro de la fibra iluminando con luz blanca de cada
rama. (Izquierda), el primer conjunto de datos que se tomaron y (derecha) los que se tomaron de forma
sistemática del perfil de intensidad......................................................................................................... 88
Figura 75 Graficas obtenidas en el experimento. .................................................................................... 89
Figura 76 Se muestra la gráfica de las variaciones de cada una de las configuraciones............................ 90
Figura 77 Se muestran las cuatro configuraciones con la mejor eficiencia en las pruebas experimentales
realizadas. ............................................................................................................................................. 91
V
Índice general
Índice de tablas
Tabla 1 Vibraciones moleculares del colesterol. ..................................................................................... 25
Tabla 2 Vibraciones moleculares de la glucosa. ..................................................................................... 26
Tabla 3 Vibraciones moleculares de los triglicéridos. ............................................................................. 27
Tabla 4 Vibraciones moleculares del colágeno. ...................................................................................... 27
Tabla 5 Vibraciones moleculares de la hemoglobina y la fibrina. ........................................................... 28
Tabla 6 Se muestran la distribución del tipo de sangre en la población hispana. ..................................... 67
Tabla 7 Muestra las concentraciones de los fantoms que se fabricaron. .................................................. 72
Tabla 8 Se muestra la eficiencia total de cada una de las configuraciones propuestas.............................. 90
VI
Índice general
VII
Capítulo 1: Introducción
Capitulo 1. Introducción
El aumento de peso y la falta de actividad física han hecho que los últimos años se incremente (el
número) de personas con triglicéridos y colesterol elevado. Otro de los problemas de salud que
va en aumento es la diabetes, la Organización Mundial de la Salud (World Health Organization,
WHO por sus siglas en inglés), muestra las estadísticas en el año 2000, a nivel mundial había
171 millones de pacientes y se proyecta que para 2030 habrá 366 millones de personas con
diabetes. En el caso de México, de acuerdo a la OMS, es el tercero en América después de
Estados Unidos y Brasil con una cifra de 2,179,000 (2000) y una proyección de
6,130,000 (2030) 1 . Las últimas estadísticas presentadas por el sector salud en abril de 2012
muestran que México ocupa el séptimo lugar a nivel mundial por el número de enfermos con de
diabetes2.Para el caso de la Diabetes es fácil determinar las cifras de individuos que padecen
dicha enfermedad, pero en el caso de aquellos que padecen elevación del colesterol es más
complicado, porque no todos los que tienen el colesterol elevado saben que están padeciendo
este problema y por lo tanto no se someten a una prueba para medir los lípidos, además no es
común que cuando visiten al médico se tenga un aparato que les determine si su colesterol esta
elevado. La cifras que proporciona la OMS no son el número de personas que la padecen sino un
porcentaje de personas que están en riesgo de tener el colesterol elevado. Otra cifra que se puede
encontrar en las estadísticas de la OMS es el promedio de colesterol en cada país. Las
estadísticas encontradas están en edades mayores a los 25, entre los años de 1980 a 2008. En
México la prevalencia de colesterol elevado en la sangre es de 50.7 % y el colesterol promedio
en la población es de 4.9 mM donde el máximo normal es de 5.2 mM3.
La capacidad del médico para diagnosticar la enfermedad se ve reforzada por la disponibilidad

de información objetiva oportuna, y cuantitativa. Los sucesivos avances en la tecnología
biomédica han favorecido obtener la información que se necesita.
Novedosas aplicaciones biomédicas de la espectroscopia óptica, tales como la de fluorescencia

[1], reflectancia [2] y Raman [3], puede proporcionar información sobre la composición del
tejido a nivel molecular. De estas técnicas, la espectroscopia Raman puede proporcionar
información detallada sobre la mayoría de la composición química del tejido en estudio debido a
que la progresión de la enfermedad se acompaña de intercambio químico, la espectroscopia
Raman puede proporcionar al médico información valiosa para el diagnóstico de la enfermedad.
La espectroscopia Raman es una técnica óptica que, recopila la información de las muestras de
estudio, por medio de fibras ópticas, las cuales a su vez, fácilmente se pueden adaptar en el
instrumental común utilizado por los médicos, como: los catéteres, endoscopios y agujas, según
1
http://www.who.int/diabetes/facts/world_figures/en/index.html
2
[http://www2.esmas.com/salud/417176/mexico-septimo-lugar-diabetes-mundo/].
3
http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_prevalence/en/
1
sea necesario. La espectroscopia de Raman es versátil, y también puede adecuarse para realizar
la toma de espectros directamente in vivo, y además obtener la información en tiempo real [4].
Las aplicaciones diagnósticas de la espectroscopia Raman actualmente bajo investigación son

muy diversas. Por ejemplo, la espectroscopia de Raman se puede utilizar para controlar analitos
en sangre de forma no invasiva [5]. Se puede utilizar para realizar diagnóstico de tejido in vivo
mínimamente invasiva en tiempo real, cuando existe una alta incidencia de prueba falsas
positivas que conduce a biopsia, como en el cáncer de mama [6,7].
Uno de los métodos para detectar glucosa en la sangre fue desarrollado en la universidad
Syracuse por el Dr. Chaiken, su instrumento consiste en medir en la yema de los dedos usando
luz de excitación infrarroja en la que se colecta esparcimiento Raman, Rayleigh y Mie además de
la fluorescencia. Debido a que la yema de los dedos es altamente vascularizada es una buena
zona para recolectar información de la sangre. Pero las manos y los dedos en particular son
altamente idiosincrásicos que requieren aparatos específicos para permitir una cuidadosa y
metódica espectroscópica de sondeo. El aparato incluye medios para la colocación precisa y
reproducible de los tejidos en relación con la abertura óptica que disponen los medios adecuados
para aplicar y mantener la presión que mantiene el tejido superficial inmóvil durante los
experimentos. La materia blanda; por ejemplo, la piel se extruye en la abertura en respuesta a
cualquier presión aplicada, por ejemplo, para mantener el tejido en registro con el sistema óptico,
por lo que la posición, el área de contacto, la presión, y la fuerza se mide continuamente y es
almacenada para producir retroalimentación para aplicar una fuerza de accionamiento y para
discernir la conformidad del sujeto de prueba. El cumplimiento afecta fuertemente a la fiabilidad
de la medición y los factores humanos deben ser adecuadamente gestionados en el caso de
palpación in vivo. El aparato produce observaciones y mediciones reproducibles que permiten
palpación consistente de los tejidos de una amplia gama de tipos de piel [8–12].
Otra de las alternativas en la literatura es la medición de glucosa in vivo usando espectroscopia

Raman de mejoramiento de superficie conocida como SERS (por sus siglas en inglés Surface
Enhanced Raman Spectroscopy). El grupo de la universidad de Northwestern del Dr. Van Duyne
ha realizado mucho del trabajo reportado en la literatura. Este método consiste en una técnica
óptica altamente específica y sensible adecuada para la detección directa de la glucosa. El efecto
SERS es altamente dependiente de la distancia focal, con lo que las moléculas de glucosa que
están dentro de unos pocos nanómetros o absorbido a una superficie SERS-activa. Este sensor, se
realiza con una monocapa auto-ensamblada (SAM) que facilita las interacciones reversibles entre
moléculas de glucosa y la superficie. La cantidad de glucosa cerca de la superficie es
proporcional a su concentración en el medio ambiente circundante [13–18].
Uno de los laboratorios que lleva más tiempo trabajando en la detección de glucosa es el George
Harrison el cual estaba dirigido por el Dr. Feld. Uno de los principales obstáculos que han
enfrentado es que la luz del infrarrojo cercano penetra sólo la mitad de un milímetro por debajo
de la piel, por lo que mide la cantidad de glucosa en el líquido que baña las células de la piel
2
(conocida como líquido intersticial), no la cantidad en la sangre. Para superar esto, el equipo
produjo un algoritmo que relaciona las dos concentraciones, lo que les permite predecir los
niveles de glucosa en sangre a partir de la concentración de glucosa en el líquido intersticial. Sin
embargo, esta calibración se hace más difícil inmediatamente después de que el paciente come o
bebe algo azucarado, porque la glucosa en la sangre se eleva rápidamente, mientras que se
requieren cinco a 10 minutos a ver un aumento correspondiente en los niveles de glucosa en
fluido intersticial. Por lo tanto, las mediciones de líquido intersticial no dan una idea exacta de lo
que está sucediendo en el torrente sanguíneo. Para abordar este tiempo de retraso, Barman y
Kong desarrollado un nuevo método de calibración, llamado corrección de concentración
dinámica (DCC), que incorpora la velocidad a la que la glucosa se difunde desde la sangre hacia
el líquido intersticial. En un estudio de 10 voluntarios sanos, los investigadores utilizaron
espectroscopia Raman calibrada con DCC para aumentar significativamente la precisión de las
mediciones de glucosa en la sangre obteniendo una mejora promedio del 15 por ciento y hasta un
30 por ciento en algunos pacientes [5,19–24].
Para el caso del colesterol la mayoría de las investigaciones en espectroscopia Raman se hace
con muestras in vitro y para la detección de ateroesclerosis [25,26]. En uno de los trabajos
reportados por Van de Poll et al. 2003 evalúa la sensibilidad y especificidad de la espectroscopia
Raman para la detección de colesterol o calcificación en la arteria coronaria humana y muestras
de aorta in vitro, utilizando un punta de prueba Raman desarrollada para aplicaciones in vivo[27].
De los pocos estudios que hay para triglicéridos Chan et al 2005, estudia lipoproteínas
individuales ricas en triglicéridos (TGRL) extraída de sangre de voluntarios humanos
combinando pinzas ópticas y microespectroscopia Raman. Con la cual se obtiene información
sobre su composición y además se obtuvo la firma espectral Raman de las lipoproteínas
individualmente atrapadas de muy baja densidad, una subclase de TGRL, que desempeñan un
papel importante en la enfermedad cardiovascular, exhibe picos distintos asociados con las
vibraciones moleculares de los ácidos grasos, proteínas, lípidos, y reordenamientos de los lípidos
[28].
Lo anterior mencionado resume los trabajos más importantes reportados en la literatura para la
detección de glucosa, colesterol y triglicéridos.Como se puede ver los métodos para estudiar la
concentración de la glucosa son bastante estudiados y hay varias propuestas en la espectroscopia
Raman para realizarla. En el caso del colesterol su estudio in vivo no es tan estudiado, su enfoque
principal es hacia la detección de ateroesclerosis. Y en el caso de los triglicéridos se hace in vitro
aislando las partículas derivadas de los triglicéridos.
3
1.1 Objetivos y Metas de la tesis
El objetivo principal de este trabajo de tesis, consiste en obtener espectros Raman en fluidos
biológicos extracelulares in vivo entre el dedo índice y el pulgar y determinar las bandas
espectrales de la glucosa, el colesterol y triglicéridos.
Para llevar a cabo el objetivo se requiere de cumplir con las siguientes metas:
o Evaluar el efecto en el espectro Raman de la coloración de la piel.

o Evaluar el efecto del tipo de sangre en el espectro Raman.
o Generar tejidos sintéticos con lípidos y glucosa para evaluar cómo influye la
mezcla de las sustancias en el espectro Raman.
o Evaluar los espectros Raman generados en los fluidos intersticiales para la
identificación de la glucosa, colesterol y triglicéridos.
o Diseñar una punta de prueba con múltiples fibras para la mejor colección de los
espectros Raman.
1.2 Estructura de la tesis
En el capítulo 2 se describen las diferentes capas que conforman la piel. En la primera sección se
da una definición de la piel humana. En la segunda sección se detallan las diferentes capas que la
conforman y su función principal. En la tercera sección, se definen los lípidos, fluidos
intersticiales, glucosa, colesterol y triglicéridos. En el capítulo 3 se define la espectroscopia
Raman y los fundamentos principales en el que se basa esta técnica. Además se describen los
diferentes tipos de “ruidos” por efectos ópticos que se presentan al obtener el espectro Raman de
interés. Finalmente, se detallan las vibraciones moleculares utilizadas para el desarrollo de este
trabajo de tesis. En el capítulo 4 se puntualizan otros métodos ópticos y matemáticos alternos a la
espectroscopia Raman que se utilizaron adicionalmente para llevar a cabo el trabajo de tesis,
tales como: la tomografía óptica coherente, el análisis de componentes principales (PCA, por sus
sigla en Inglés), y la descripción del software NIRFAST que fue utilizado para diseñar
geometrías de puntas de prueba Raman. Después se describe detalladamente el arreglo
experimental utilizado; es decir, cada uno de los componentes que constituyen el espectrómetro
Raman, tales como: el modulo láser, la punta de prueba, la resolución espectral del equipo, etc.
En el capítulo 5 se detalla el método de procesado se abordan un par de problemas encontrados
en la espectroscopia Raman, los cuales son el ruido de disparo y la fluorescencia de fondo.
Existen muchos métodos para removerlos pero en esta tesis se hace una propuesta de método de
remoción de ruido, y se utiliza uno reportado en la literatura para sustraer la fluorescencia debido
a que el comportamiento es similar a los que se obtienen en los espectros de esta tesis. En la
primera sección se describe el método de reducción de ruido utilizando wavelets de tipo Symlets
4
y en la segunda sección se describe el método para sustraer fluorescencia denominado MimMax.

En el capítulo 6 se presenta los experimentos realizados y los resultados que se obtuvieron en
este trabajo. Está dividido en el estudio del efecto del color de la piel en los espectros Raman, la
realización de mapas de la piel, imágenes OCT para ver la zona que se está midiendo, los
experimentos que se realizaron con tejidos sintéticos (phantoms) hechos con PDMS, la
influencia del tipo de sangre en el diagnóstico, los espectros de los fluidos intersticiales y
finalmente el diseño de una punta de prueba con mayor eficiencia que la que se tiene en el
laboratorio. Finalmente en el capítulo 7 se puntualizan las conclusiones logradas en este trabajo
de tesis y el trabajo a futuro.
5
Capítulo 2: La piel
Capitulo 2. La piel
2.1 Introducción
La piel es uno de los objetivos bajo estudio en esta tesis, debido a que se tomarán espectros en
diferentes partes de ella, tales como: encima de la palma, en medio del pulgar y el dedo índice,
encima y abajo del pulgar. Por tal motivo es importante dar una breve descripción de ella y de las
sustancias que se quieren medir. En este capítulo se describen las diferentes capas que
conforman la piel, en la primera sección se da una definición de la piel humana. En la sección
dos se describen las diferentes capas que la conforman y su función principal, en la sección tres
se define los lípidos, fluidos intersticiales, glucosa, colesterol y triglicéridos.
La piel es el mayor órgano del cuerpo humano. Ocupa aproximadamente 2 m², y su espesor varía
entre los 0.5 mm (en los párpados) a los 4 mm (en el talón). Su peso aproximado es de 5 kg.
Actúa como barrera protectora que aísla al organismo del medio que lo rodea, protegiéndolo y
contribuyendo a mantener íntegras sus estructuras, al tiempo que actúa como sistema de
comunicación con el entorno [29].
Las tres capas principales desde la superficie son:
 La epidermis,
 La dermis y
 El tejido subcutáneo.
De la piel dependen ciertas estructuras llamados anexos cutáneos que son los vellos, las uñas, las
glándulas sebáceas y las sudoríparas. En la piel del ser humano, sobretodo la del varón se
produce más secreción sebácea que la que tiene la mujer. Esto es debido a la mayor cantidad de
andrógenos (hormona sexual masculina) que produce el varón. Como consecuencia, la piel
masculina es más gruesa y grasa que la femenina [1].
2.2. Estructura general histológica
La piel está compuesta de:
Corpúsculos de Meissner (Georg Meissner): Presentes en el tacto de piel sin vellos, palmas,
plantas, yema de los dedos, labios, punta de la lengua [30].
 Corpúsculos de Krause: que proporcionan la sensación de frío.
6
 Corpúsculos de Paccini: que dan la sensación de presión.

 Corpúsculos de Ruffini: que registran el calor.
 Corpúsculos de Merckel: que registran al tacto superficial.
Existen dos tipos de piel:
 Piel blanda: la piel blanda es aquella que se encuentra principalmente en los párpados y
las zonas genitales.
 Piel gruesa: la piel gruesa se localiza en la piel labial, plantar y palmar, además ésta se
caracteriza por tener un estrato corneo muy desarrollado, a comparación del resto de la
piel.
Mientras que en corrientes médicas, como la histoanatomía y dermatología se estudia en 3

estratos:
 Epidermis.
 Dermis.
 Tejido subcutáneo
Cada una de las capas tiene funciones y componentes diferentes que se interrelacionan.
Figura 1 Capas de la piel[31].
2.2.1. Epidermis
La epidermis es la capa externa de la piel. El espesor de la epidermis varía en diferentes tipos de

piel. Es la más fina en los párpados a 0.05 mm y la más gruesa en las palmas y plantas de los pies
7
a 1.5 mm. La epidermis se compone en su mayoría por queratinocitos, que se encuentran

segmentados en el estrato corneo, además de un factor importante que son los melanocitos o
también llamados como los pigmentocitos, que dan la pigmentación a la piel y que se encuentran
justamente sobre el estrato germinativo. En la piel se pueden apreciar bajo cortes histológicos
células de Langerhans y linfocitos, que se encargan de dar protección inmunológica, además de
hallar a los mecanorreceptocitos o células de Merckel [31].
La epidermis también contiene melanocitos que producen melanina (el pigmento de la piel). Se
divide en 5 capas [31]:
 Estrato germinativo se compone de una capa de células cilíndricas bajas u ovales, su

citosol demuestra la presencia de tonofibrillas, además que las células de dicho estrato se
relaciona por la unión desmosómica, además de anclarse a la membrana basal por
uniones hemidesmosómicas.
 Estrato espinoso se conforma por células con forma poligonal, los núcleos son redondos y
el citosol es de características basofílicas. Tiene un mayor contenido de tonofibrillas que
las del estrato germinativo. Las prolongaciones del citosol se asemejan a espinas, por lo
que también reciben células espinosas, justamente porque las tonofibrillas son más
numerosas en dichas prolongaciones dando la forma de espinas.
 Estrato granuloso se compone de 3 a 5 capas de células aplanadas, el citosol contiene
gránulos basófilos denominados gránulos de queratohialina. La queratohialina es una
sustancia precursora de la queratina. Cuando los queratinocitos llegan a la última capa de
este estrato las células epidérmicas mueren y al morir vierten su contenido al espacio
interceular.
 Estrato lúcido se distingue por tener una zona muy delgada de características eosinófilas.
Los núcleos comienzan a degenerar en las células externas del estrato granuloso y
desaparecen en el estrato lúcido.
 Estrato córneo de células planas queratinizadas anucleadas, también llamadas células
córneas. Esta capa se distingue como la más gruesa y eosinófila. El estrato córneo está
formado por hileras aplanadas y muertas que son los corneocitos. Los corneocitos están
compuestos mayormente por queratina. Todos los días se eliminan capas de corneocitos.
 Estrato disyunto es la continua descamación de las células córneas.
Las células que migran desde el estrato germinativo tardan en descamarse alrededor de 4
semanas. Esto depende de la raza y género, así como también de la especie cuando se estudia en
animales.
2.2.2 Dermis
La dermis también varía en espesor dependiendo de la localización de la piel. Se trata de 0.3 mm

en los párpados y 3 mm en la parte trasera. La dermis es una capa profunda de tejido conjuntivo
8
en la cual se tienen la peculiaridad de la abundancia de las fibras de colágeno y elásticas que se

disponen de forma paralela y que le dan a la piel la consistencia y elasticidad característica del
órgano. Histológicamente se divide en 2 capas [31]:
Estrato papilar. Compuesto por tejido conectivo laxo, fibras de colágeno tipo III, y asas capilares.
 Estrato reticular: compuesto por tejido conectivo denso, fibras de colágeno tipo I, fibras
elásticas, en donde se encuentran microscópicamente mastocitos, reticulocitos y
macrófagos. En su porción inferior se observa una capa de músculo liso que conforma al
músculo piloerector. En la piel facial existe musculatura de tipo estriado en donde hay
fijación de los músculos de la mímica en la dermis.
En la dermis se hallan los siguientes componentes [32]:
 Folículo piloso.
 Músculo piloerector.
 Terminaciones nerviosas aferentes (que llevan información).
 Glándulas sebáceas.
 Vasos sanguíneos y linfáticos.
La dermis es 20-30 veces más gruesa que la epidermis. En ella se encuentran los anexos
cutáneos, que son de dos tipos: córneos (vellos y uñas) glandulares (glándulas sebáceas y
sudoríparas).
2.2.3 Tejido subcutáneo
Es un estrato de la piel que está compuesto de tejido conjuntivo lazo y adiposo, lo cual le da
funciones a la piel de regulación térmica y de movimiento a través del cuerpo como el que se ve
cuando estiramos la piel de nuestro antebrazo hacia arriba, si no tuviera estos tipos de tejidos
sería imposible moverla [31].
Los componentes propios que integran al tejido subcutáneo son:
 Ligamentos cutáneos.
 Nervios cutáneos.
 Grasa.
 Vasos sanguíneos y linfáticos.
9
2.3 Lípidos
Los lípidos son un conjunto de moléculas orgánicas, la mayoría biomoléculas, compuestas

principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden
contener fósforo, azufre y nitrógeno, que tienen como característica principal el ser hidrofóbicas
o insolubles en agua y sí en disolventes orgánicos como la bencina, el alcohol, el benceno y el
cloroformo. En el uso coloquial, a los lípidos se les llama incorrectamente grasas, aunque las
grasas son sólo un tipo de lípidos procedentes de animales. Los lípidos cumplen funciones
diversas en los organismos vivientes, entre ellas la de reserva energética (triglicéridos), la
estructural (fosfolípidos de las bicapas) y la reguladora (esteroides) [33].
2.4. El fluido intersticial
El fluido intersticial (o fluido tisular) es una solución que baña y rodea a las células de los
animales multicelulares. Es el componente principal del fluido extracelular, que también incluye
plasma y el líquido transcelular. El fluido intersticial se encuentra en los espacios intersticiales,
también conocidos como los espacios de los tejidos. En promedio, una persona tiene alrededor de
11 litros de líquido intersticial, el cual proporciona a las células del cuerpo con nutrientes y un
medio de eliminación de residuos [34].
Producción y eliminación
Plasma y el líquido intersticial son muy similares. Plasma, el componente principal de la sangre,
se comunica libremente con el fluido intersticial a través de los poros y hendiduras intercelulares
en el endotelio capilar.
Formación de fluido de tejido
La presión hidrostática es generada por la fuerza sistólica del corazón. Se empuja el agua fuera
de los capilares. El potencial de agua se crea debido a la capacidad de los solutos pequeños para
pasar a través de las paredes de los capilares. Esta acumulación de solutos induce ósmosis. El
agua pasa de una alta concentración (de agua) fuera de los vasos a una baja concentración en el
interior de los vasos, en un intento de alcanzar un equilibrio. La presión osmótica conduce de
nuevo el agua en los vasos. Debido a que la sangre en los capilares está fluyendo
constantemente, equilibrio nunca se alcanza. El equilibrio entre las dos fuerzas difiere en
diferentes puntos de los capilares. En el extremo de un vaso arterial, la presión hidrostática es
mayor que la presión osmótica, por lo que favorece el movimiento neto de agua y otros solutos
10
que son pasados en el fluido del tejido. En el extremo venoso, la presión osmótica es mayor, por
lo que el movimiento neto favorece sustancias que se pasa de nuevo en el capilar. Esta diferencia
es creada por la dirección del flujo de la sangre y el desequilibrio de solutos creados por el
movimiento neto de agua favorece el fluido del tejido.
La eliminación del fluido tisular
Para evitar una acumulación de fluido de tejido que rodea a las células en el tejido, el sistema
linfático juega un papel en el transporte de líquido de los tejidos. Líquido tisular puede pasar a
los vasos linfáticos circundantes, y, finalmente, termina por reunirse con la sangre.
A veces, la eliminación de líquido de los tejidos no funciona correctamente, y hay una

acumulación. Esto causa hinchazón, y puede verse a menudo alrededor de los pies y los tobillos.
Composición
El fluido intersticial consiste en un disolvente de agua que contiene aminoácidos, azúcares,

ácidos grasos, coenzimas, hormonas, neurotransmisores, sales, así como los productos de
desecho de las células. La composición de fluido de los tejidos depende de los intercambios entre
las células en el tejido biológico y la sangre. Esto significa que el fluido tisular tiene una
composición diferente en diferentes tejidos y en diferentes áreas del cuerpo. No todos los
contenidos de la sangre pasan en el tejido, lo que significa que el fluido de los tejidos y la sangre
no son los mismos. Los glóbulos rojos, plaquetas y las proteínas plasmáticas no pueden pasar a
través de las paredes de los capilares. La mezcla resultante que pasa a través es, en esencia
plasma de la sangre sin las proteínas del plasma. Fluido de los tejidos también contiene algunos
tipos de células blancas de la sangre, que ayudan a combatir las infecciones.
La linfa se considera una parte del fluido intersticial. El sistema linfático devuelve proteína y el
exceso de líquido intersticial a la circulación. La composición iónica del líquido intersticial y el
plasma sanguíneo variar debido al efecto de Gibbs-Donnan. Esto provoca una ligera diferencia
en la concentración de cationes y aniones entre los dos compartimientos de fluido.
Función fisiológica
El fluido intersticial baña las células de los tejidos. Esto proporciona un medio de entrega de los
materiales a las células, la comunicación intercelular, así como la eliminación de desechos
metabólicos.
Debido a que se requiere más detalle de lo que vamos a medir en esta tesis por tal motivo aquí se
presenta una descripción breve de las sustancias que se quieren medir.
11
2.5. Glucosa
La glucosa, es un monosacárido el cual es el carbohidrato central en la fisiología humana. El

nombre viene de la palabra griega “glykys” (γλυκυ´ς ), que significa "dulce". Hay dos isómeros
ópticos de la glucosa, glucosa D-y L- (Fig. 2), y ambas son ópticamente activas con la quiralidad
opuesta. Sin embargo, sólo la glucosa D- está involucrada en el metabolismo humano. La imagen
de espejo de la molécula, glucosa L-, está presente en los alimentos, pero no puede ser utilizado
por las células [35]. En lo sucesivo, el término "glucosa" significará su iso-forma biológico
activo (iso-forma D-). La glucosa es la forma de transporte de hidratos de carbono, y
combustible importante para avivar la energía metabólica en todas las células humanas. La
glucosa está participando en una gran cantidad de reacciones bioquímicas en el perfil metabólico
modulando tanto en forma fisiológica y en la patología. La glucosa tiene papel crítico en la
producción de proteínas y en el metabolismo lipídico. De acuerdo con el metabolismo de la
glucosa teóricamente está involucrada en los procesos de envejecimiento. El nivel de glucosa en
sangre es un parámetro de un alto valor predictivo en trastornos tales como diabetes mellitus,
enfermedad coronaria y la hipertensión arterial.
Figura 2 Iso-forma D y L de la glucosa.
Las concentraciones de glucosa en el organismo humano
Concentración de glucosa en plasma es el resultado del equilibrio entre la glucosa que entra en la
circulación y la eliminación de glucosa de la circulación.
 El nivel de glucosa en sangre normal en humanos es de aproximadamente 4 mM (

72 mg/dL)
 El cuerpo, en funcionamiento normal, restaura el nivel de azúcar en la sangre a un
intervalo de aproximadamente 4.55 a 6.11 mM (82 a 110 mg/dL)
 Poco después de comer el nivel de glucosa en la sangre puede aumentar temporalmente
hasta 7.77 mM (140 mg/dL) [36].
12
2.6. Colesterol
Colesterol, del griego chole-(bilis) y stereos (sólido), seguido por la química sufijo-ol para un
alcohol, es una sustancia química orgánica clasificado como un esteroide cerosa de grasa. Es un
componente estructural esencial de las membranas celulares y se requiere para establecer la
permeabilidad de la membrana y fluidez.
Además de su importancia dentro de las células, el colesterol también sirve como un precursor
para la biosíntesis de las hormonas esteroides, ácidos biliares, y de vitamina D [37]. El colesterol
es el principal esterol sintetizado por animales; en los vertebrados que se forma
predominantemente en el hígado. Pequeñas cantidades se sintetizan en otros organismos
celulares (eucariotas), tales como plantas y hongos. Es casi completamente ausente entre los
procariotas (es decir, bacterias).
Aunque el colesterol es importante y necesario para la salud humana, los niveles altos de
colesterol en la sangre se han asociado a los daños a las arterias y las enfermedades
cardiovasculares.
El colesterol es necesario para construir y mantener las membranas, además modula la fluidez de
la membrana en el rango de temperaturas fisiológicas. El grupo hidroxilo del colesterol
interactúa con los grupos de cabeza polares de los fosfolípidos de la membrana y esfingolípidos,
mientras que los esteroides voluminosos y la cadena de hidrocarburo se insertan en la membrana,
junto con la no polar de ácidos grasos de cadena de los otros lípidos. A través de la interacción
con los fosfolípidos las cadenas de ácidos grasos, hacen que el empaque del colesterol de la
membrana aumente, lo que reduce la fluidez de la membrana. En este papel estructural, el
colesterol reduce la permeabilidad de la membrana plasmática a los solutos neutros, los protones
(iones de hidrógeno positivos) y los iones de sodio.
Figura 3 Estructura Molecular del colesterol.
13
Dentro de la membrana celular, el colesterol también funciona en el transporte intracelular, la

señalización celular y la conducción nerviosa.
El nivel en sangre de colesterol total debe ser: <200 mg/dL (<5.178 mM) de colesterol en sangre
normal, 200-239 mg/dL límite alto (5.178-6.18 mM),> 240 mg/dL de colesterol alto [56] Sin
embargo, como los métodos de prueba actuales determinan el colesterol LDL ("malo") y HDL
("colesterol bueno") por separado, esta visión simplista se ha convertido en algo obsoleto. El
nivel de LDL deseable se considera que es menos de 100 mg/dL (2.6 mM) [58], aunque un límite
superior más nuevo de 70 mg/dL (1.8 mM) puede ser considerada de mayor riesgo en individuos
basado en algunos de los ensayos mencionados anteriormente. Es de destacar que los valores
típicos de LDL para niños antes de estrías grasas comienzan a desarrollar es de 35 mg/dL.
2.7. Triglicéridos
Un triglicérido (TG, triacilgliceroles, TAG, o triacilglicérido) es un éster derivado de glicerol y

tres ácidos grasos [38]. Hay muchos triglicéridos, dependiendo de la fuente de aceite, algunos
son altamente insaturado, otros menos.
Compuestos saturados que están "saturados" con hidrógeno - todas los huecos donde los átomos
de hidrógeno se podrían unir a átomos de carbono están ocupadas. Compuestos insaturados que
tienen dobles enlaces (C = C) entre átomos de carbono, reduciendo el número de lugares en los
que átomos de hidrógeno pueden unirse a átomos de carbono. Compuestos saturados que tienen
enlaces sencillos (CC) entre los átomos de carbono, y el otro enlace está unido a átomos de
hidrógeno (por ejemplo, = CH-CH =,-CH2-CH2-, etc.)
Los triglicéridos son un mecanismo para almacenar calorías no utilizadas, y su alta concentración
en sangre se correlaciona con el consumo de almidón y otros alimentos altos en carbohidratos.
Los triglicéridos son un componente principal de los aceites de la piel humana. [39]
En el cuerpo humano, los niveles altos de triglicéridos en la sangre se han relacionado con la
aterosclerosis y, por extensión, el riesgo de enfermedad cardíaca y accidente cerebrovascular. Sin
embargo, el impacto relativo negativo del aumento del nivel de triglicéridos en comparación con
el de LDL: HDL relaciones es aún desconocido. El riesgo puede ser parcialmente explicada por
una fuerte relación inversa entre el nivel de triglicéridos y HDL-colesterol.
La American Heart Association ha establecido directrices para los niveles de triglicéridos:
 Rango normal, de bajo riesgo <150 mg/dL (<1.70 mM)

 Ligeramente arriba de lo normal 151-199 mg/dL( 1.70-2.25 mM)
 Cierto riesgo 200-499 mg/dL (2,26-5,65 mM)
14
 Muy alto, alto riesgo > 500 mg/dL (> 5.65 mM)
Figura 4 Estructura molecular de los triglicéridos.
En este capítulo se describió las capas de la piel, se detallan las diferentes capas que conforman
la piel y su función principal, luego se definieron los lípidos, fluidos intersticiales, glucosa,
colesterol y triglicéridos.
15
Capítulo 3: Espectroscopia Raman
Capitulo 3. Espectroscopia Raman

3.1. Introducción
La espectroscopia Raman es ampliamente utilizada en estudios biológicos. Esta técnica posee

ciertas características que son sustentables en el estudio de la piel invitro e in vivo, además de
proveer información detallada acerca de la composición y estructura molecular en la piel,
también, debido a que las vibraciones moleculares son directamente influenciadas por el
microambiente de los grupos funcionales, el espectro vibracional provee información de las
interacciones moleculares. Por lo tanto, este tipo de información se puede obtener de manera
completamente no invasiva tal que el espectro Raman puede ser tomado directamente de la piel
[40]. En este capítulo se define la espectroscopia Raman y el efecto en el que se basa esta
técnica. En la sección cuatro se describen los diferentes ruidos que se presentan al obtener el
espectro Raman de interés.
La Espectroscopia Raman es una técnica fotónica de alta resolución que proporciona en pocos
segundos información química y estructural de casi cualquier material ya sea compuesto
orgánico o inorgánico permitiendo así su identificación. La espectroscopia Raman está basada en
el fenómeno de esparcimiento inelástico [41]. Esta es una de las técnicas más usadas en química
en la identificación de moléculas. En esta técnica se usa una fuente monocromática de radiación
para producir esparcimiento elástico e inelástico en una muestra.
La radiación incidente interactúa con la materia y polariza (cambios de energía) los orbitales de
las moléculas o átomos de la muestra, esta radiación crea un nuevo estado llamado estado virtual.
Como este nivel de energía no es un estado estable, se re-emite un fotón rápidamente. En este
proceso se presentan dos tipos de esparcimiento, esparcimiento elástico conocida como
esparcimiento Rayleigh y esparcimiento inelástico conocido como esparcimiento Raman. El
proceso más probable es el esparcimiento Rayleigh y no cambia la energía de la radiación re-
emitida. Una pequeña parte de la radiación re-emitida a diferente energía es debido al
esparcimiento inelástico, dicha radiación es conocida como esparcimiento Raman. En este caso,
el proceso de esparcimiento induce movimiento molecular y, consecuentemente, se puede
presentar un intercambio de energía de fotón a molécula o átomo y viceversa. El esparcimiento
Raman es un proceso débil y solo 1 de 106 fotones incidentes son esparcidos de forma inelástica
[41].
16
3.2. Descripción del efecto Raman
El fenómeno conocido como efecto Raman fue descrito por el físico Hindu Chandrasekhara
Venkata Raman en el año 1928, lo que lo llevo a la obtención del premio Nobel de física en
1930. Este científico dio nombre al fenómeno inelástico de esparcimiento de la luz que permite
el estudio de rotaciones y vibraciones moleculares. Sus estudios sobre este fenómeno se
inspiraron en los trabajos realizados anteriormente por Rayleigh. A diferencia de Rayleigh que
afirmaba que el color azul del mar no es más que el azul del cielo visto en reflexión, Raman
realizó un experimento sencillo con el que pudo demostrar que el color azul del agua procedía de
un fenómeno propio, posteriormente explicado como el esparcimiento de la luz debido a su
interacción con las moléculas del agua. En 1923, mientras estudiaba el esparcimiento de la luz en
el agua y en alcoholes purificados, uno de sus alumnos observó un cambio de color en un rayo de
luz solar al ser filtrada y transmitida. El y su equipo no fueron capaces de eliminar este efecto y
por tanto sospecharon que el fenómeno era una propiedad característica de la sustancia. Tras
realizar diversos estudios durante los cinco años siguientes, Raman y su discípulo Krishnan,
publicaron el famoso artículo en la revista Nature en 1928, en el que describieron este nuevo tipo
de radiación secundaria [42]. En el cual describen su experimento de la siguiente forma: “El
nuevo tipo de esparcimiento de la luz descubierta por nosotros, naturalmente, requiere
iluminación muy potente para su observación. En nuestros experimentos, un haz de luz del sol es
convergido sucesivamente por un objetivo de telescopio de 18 cm de apertura y 230 cm de
longitud focal, y por una segunda lente de 5 cm de longitud focal. En el foco de la segunda lente
se colocó el material de esparcimiento, que es o bien un líquido (cuidadosamente purificado por
destilación repetida a vacío) o su vapor libre de polvo. Para detectar la presencia de la radiación
modificada esparcida se usan filtros. Un filtro de color azul-violeta, cuando se combina con un
filtro amarillo-verde y se coloca en la luz incidente, se extingue por completo el camino de la luz
a través del líquido o vapor. La reaparición sucede cuando el filtro amarillo se transfiere a un
lugar entre ella y el ojo del observador lo cual prueba la existencia de una radiación esparcida
modificada”.
17
Figura 5 Se ilustra el experimento realizado por C.V Raman.
El análisis mediante espectroscopia Raman se basa en hacer incidir un haz de luz monocromática
de frecuencia υ0 sobre una muestra cuyas características moleculares se desean determinar, y
examinar la luz esparcida por dicha muestra. La mayor parte de la luz esparcida presenta la
misma frecuencia que la luz incidente pero una fracción muy pequeña presenta un cambio en
frecuencia, resultado de la interacción de la luz con la materia. La luz que mantiene la misma
frecuencia υ0 que la luz incidente se conoce como esparcimiento Rayleigh y no aporta ninguna
información sobre la composición de la muestra analizada. La luz esparcida que presenta
frecuencias distintas a la de la radiación incidente, es la que proporciona información sobre la
composición molecular de la muestra y es la que se conoce como esparcimiento Raman. Las
nuevas frecuencias, +υr y –υr, son las frecuencias Raman, características de la naturaleza química
y el estado físico de la muestra e independientes de la radiación incidente [43]. Las variaciones
de frecuencia observadas en el fenómeno de esparcimiento Raman, son equivalentes a
variaciones de energía. Los iones y átomos enlazados químicamente para formar moléculas y
redes cristalinas, están sometidos a constantes movimientos vibracionales y rotacionales; estas
oscilaciones se realizan a frecuencias bien determinadas en función de la masa de las partículas
que intervienen y del comportamiento dinámico de los enlaces existentes. A cada uno de los
movimientos vibracionales y rotacionales de la molécula le corresponderá un valor determinado
de la energía molecular. Un diagrama energético en el que cada estado de energía se representa
por una línea horizontal se muestra en la figura 2 y se conoce como el diagrama de Jablonski
[44].
18
Figura 6 Diagrama de Jablonski
De la figura 6 pueden distinguirse los siguientes casos [44]:
Las variaciones de frecuencia observadas en el fenómeno de esparcimiento Raman, son

equivalentes a variaciones de energía. Los iones y átomos enlazados químicamente para formar
moléculas y redes cristalinas, están sometidos a constantes movimientos vibracionales y
rotacionales; estas oscilaciones se realizan a frecuencias bien determinadas en función de la masa
de las partículas que intervienen y del comportamiento dinámico de los enlaces existentes. A
cada uno de los movimientos vibracionales y rotacionales de la molécula le corresponderá un
valor determinado de la energía molecular. Un diagrama energético en el que cada estado de
energía se representa por una línea horizontal
 si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón esparcido a la misma

frecuencia que el fotón incidente, se dice que el choque es elástico ya que ni el fotón ni la
molécula sufren variaciones en su estado energético; la molécula vuelve al mismo nivel
de energía que tenía antes del choque y el fotón esparcido tiene la misma frecuencia υ0
que el incidente, dando lugar al esparcimiento Rayleigh;
 si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón esparcido a una frecuencia
distinta de la incidente, se dice que el choque es inelástico (existe transferencia de energía
entre la molécula y el fotón); en este caso pueden darse dos fenómenos:
 si el fotón esparcido tiene una frecuencia menor a la del incidente, se produce una
transferencia de energía del fotón a la molécula que, después de saltar al estado de
19
energía no permitido, vuelve a uno permitido mayor al que tenía inicialmente; el fotón es
esparcido con frecuencia υ0 -υr y se produce el esparcimiento Raman Stokes;
 si el fotón esparcido tiene una frecuencia mayor a la del incidente, se produce una
transferencia de energía de la molécula al fotón; esto significa que la molécula,
inicialmente antes del choque no se encontraba en su estado vibracional fundamental sino
en uno de mayor energía y después del choque pasa a este estado; el fotón es esparcido
con frecuencia υ0 +υr y se produce el esparcimiento Raman anti-Stokes.
Cada material tendrá un conjunto de valores υr característicos de su estructura poliatómica y de

la naturaleza de los enlaces químicos que la forman.
El espectro Raman está formado por una banda principal o Rayleigh y dos series de bandas
secundarias correspondientes a las bandas Raman Stokes y anti-Stokes, situadas simétricamente
a ambos lados de la banda Rayleigh esto se muestra en la figura 7.
Figura 7 Espectro Raman del sulfuro, mostrando los cambios Stokes y anti-stokes.
Es importante resaltar que el desplazamiento de las longitudes de onda Raman respecto a la

longitud de onda incidente υ0 es independiente de esta última y por ello suele tomarse este
desplazamiento como abscisa para representar los espectros Raman, situando el centro de la
banda Rayleigh como origen del eje. De tal forma en el eje de abscisas en realidad aparecerá la
diferencia entre la longitud de onda Raman y la de excitación del láser,
 1 1 
R(cm1 )    7
 *10 , (3.1)
 0 (nm) 1 (nm) 
donde ΔR es el desplazamiento Raman en cm-1, λ0 es la longitud de onda de excitación en nm, y

λ1 es la longitud de onda del espectro Raman en nm.
20
En ocasiones, debido a la naturaleza química del material que se analiza, unido al efecto Raman
se produce un efecto de fluorescencia que puede llegar a enmascarar las bandas Raman; en estos
casos, podría resultar de interés medir el espectro anti-Stokes ya que a estas frecuencias, aunque
el efecto Raman es más débil, también lo es el efecto de la fluorescencia y pueden observarse
bandas Raman en la parte anti-Stokes del espectro, que se encuentran enmascaradas en la parte
Stokes [45].
3.3. Ruidos en espectroscopia Raman
El "ruido" es la información indeseada debido a la electrónica del instrumento, la respuesta sin

conexión lógica y eventos aleatorios. De tal manera que el ruido es tan solo un nombre que le
adjudicamos a aquellas señales que no nos interesan.
Uno de los problemas inherentes a la adquisición de cualquier señal es el ruido presente en la

medición. En el caso de la obtención de espectros Raman los ruidos más habituales pueden ser
clasificados en cinco grupos diferentes: ruido de disparo, ruido generado por la muestra, ruido
generado por la instrumentación, ruido computacional y ruido generado por fuentes externas
[46].
3.3.1 Ruido de disparo (Shot noise)
Ruido de disparo es una fuente de ruido inevitable en la medición de espectros Raman. Es un

tipo de ruido electrónico que tiene lugar cuando el número finito de partículas que transportan
energía, tales como los electrones en un circuito electrónico o los fotones en un dispositivo
óptico, es suficientemente pequeño para dar lugar a la aparición de fluctuaciones estadísticas
apreciables en una medición [47].
El nivel de este ruido es mayor cuanto el valor promedio de la intensidad de corriente eléctrica o
de la intensidad luminosa es más grande, según se trate de un dispositivo electrónico u óptico.
Sin embargo, en tanto que el nivel de señal crece más rápidamente cuanto mayor es su nivel
promedio, a menudo el ruido de disparo sólo supone un problema cuando se trabaja con
intensidades de corriente o intensidades luminosas bajas.
El ruido de disparo en los dispositivos electrónicos consiste en fluctuaciones aleatorias de la

corriente eléctrica a través de un conductor, causadas por el hecho de que la corriente se
transporta en cargas discretas (electrones). Esto no sólo ocurre en las uniones p-n, sino en
cualquier conductor, incluso en las situaciones en que la carga no esté bien localizada [48].
21
3.3.1. Ruido generado por la muestra
El ruido generado por la muestra incluye emisiones ópticas no deseadas y generadas por la
propia muestra como es el caso de la fluorescencia, fenómeno que se produce si, al incidir un
fotón sobre una molécula, éste es absorbido y la molécula pasa a un estado electrónico excitado
donde permanece unas decenas de nanosegundos, para saltar a otro estado excitado pero de
menor energía, liberando un fotón de frecuencia más baja que el incidente [46]. En los espectros
Raman la fluorescencia suele presentarse como una suave curvatura de la línea de base y puede
alcanzar una intensidad que llegue a enmascarar por completo la intensidad de las bandas
Raman. El ruido generado por la muestra incluye también los cambios de intensidad Raman
debidos a cambios en la muestra no relacionados con la concentración; por ejemplo, tanto la
intensidad de las bandas como la posición pueden variar en función de la temperatura de la
muestra, aunque estos cambios tienden a ser pequeños. La heterogeneidad de la muestra también
puede crear ruido ya que el análisis realizado en un punto de la muestra no tiene que ser
representativo de la muestra completa.
3.3.2. Ruido generado por la instrumentación
Ruido generado por la instrumentación: depende del diseño específico de la instrumentación

empleada en el análisis. Este tipo de ruido incluye los ruidos introducidos por el detector como el
ruido térmico, el ruido de lectura que es la dependencia de la eficiencia cuántica del detector con
la longitud de onda [45].
3.3.3. Ruido computacional
Ruido computacional: este ruido se refiere al introducido en el proceso de digitalización de la

señal de salida del detector.
3.3.4. Ruido generado por fuentes externas
Ruido generado por fuentes externas: este ruido es el generado externamente al equipo Raman o
la muestra que se está analizando. Generalmente es causado por alguna fuente de luz externa que
contamina la señal en algún punto del equipo de medición aunque, si el equipo y el contenedor
de la muestra a medir están cuidadosamente diseñados, deberían de ser inmunes a las radiaciones
externas. Pueden ser por ejemplo fuentes externas de ruido las luces fluorescentes y la luz solar.
Una fuente de ruido externo de origen no-óptico es generada por partículas de alta energía como
los rayos cósmicos que llegan al detector del equipo. Los rayos cósmicos liberan un gran número
de electrones que son indistinguibles de los fotoelectrones. Los electrones generados por los
rayos cósmicos se concentran en uno o máximo dos de los elementos del detector. El resultado es
22
un pico muy estrecho y de gran intensidad en el espectro de esparcimiento Raman. Estos picos
ocurren infrecuentemente, en tiempo aleatorio y posiciones también aleatorias del espectro
Raman. Estas partículas de alta densidad de energía son las que componen la radiación cósmica
que llega a la órbita terrestre y que está formada en un 98% por nucleones (cada uno de los
corpúsculos que intervienen en la constitución de un núcleo atómico) [49]. Es difícil confundir
un pico cósmico con una banda Raman por la disparidad en sus características, a no ser que el
azar haga caer varios rayos cósmicos en píxeles adyacentes del detector, lo cual es poco
probable; en este caso, sería necesaria la eliminación de este ruido para poder aplicar otras
técnicas de procesado sobre el espectro.
De todos estos posibles ruidos que nos podemos encontrar en un espectro, los más habituales son
el ruido de disparo, el cósmico y la fluorescencia, como se pueden ver en la figura 8. La
aplicación de la espectroscopia Raman a la identificación de pigmentos, está basada en la
localización de la posición de las bandas Raman para discernir entre un pigmento u otro; estos
ruidos presentes en el espectro Raman dificultan la identificación de las bandas y por tanto será
beneficioso reducirlos mediante técnicas de procesado de señal que no conlleven pérdida de
información. Además, esta reducción permitirá aplicar otras técnicas de procesado sobre el
espectro, como por ejemplo la detección automática de las bandas Raman, de forma más
eficiente.
600
500
Bandas
Raman
400
Intensidad (U.A)
300 Ruido Ruido de

cosmico disparo
200 (spike)
100
-100
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Desplazamiento Raman(cm-1 )
Figura 8 Tipos de ruidos.
Los procesos de esparcimiento Raman y los de fluorescencia no están relacionados. En la

fluorescencia la molécula absorbe completamente al fotón incidente y pasa a un estado
electrónico excitado, y transcurre un tiempo (tiempo de vida media) cuando la molécula sufre
una nueva transición al estado electrónico inferior re-emitiendo radiación normalmente de
longitud de onda superior a la que se absorbió. En cambio en el efecto Raman, el fotón, como un
23
todo, nunca resulta absorbido, si no que perturba a la molécula y le induce a que sufra una
transición. La diferencia esencial radica en el hecho de que la fluorescencia puede disminuirse
agregando especies que mediante colisiones, quitan la energía de la molécula excitada por
absorción de radiación, antes de que aquella re-emita, mientras que el efecto Raman, no es
posible llevar a cabo este proceso porque la molécula excitada nunca alcanza un estado excitado
como situación intermedia y por tanto no es posible que permanezca el tiempo (tiempo de vida
del estado excitado) necesario para que pueda tener lugar la colisión que la inhiba. El estado
intermedio que alcanza una molécula en un proceso de esparcimiento Raman es un estado
virtual, que no necesariamente coincide con ningún estado propio de la molécula [49,50]. En la
figura 9 se muestran un ejemplo de la fluorescencia y las bandas Raman.
2500
2400
Bandas
2300 Raman
2200 Fluorescencia
de fondo
2100
Intesidad(U.A)
2000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Desplazamiento Raman (cm-1)
Figura 9 Se muestra las bandas Raman y la fluorescencia de Fondo.
3.4. Vibraciones moleculares
Una vibración molecular se produce cuando los átomos de una molécula están en movimiento
periódico mientras que la molécula como un todo tiene constante movimiento traslacional y
rotacional [51]. La coordenada de una vibración normal es una combinación de cambios en las
posiciones de los átomos en la molécula. Cuando la vibración sucede los cambios de
coordenadas es sinusoidal con una frecuencia ν, la cual es la frecuencia de la vibración. Las
coordenadas internas son de los tipos siguientes, ilustradas con referencia a la molécula planar de
etileno que se muestra en la figura 10.
24
Figura 10 Se muestra la molécula del etileno planar.
 Estiramiento: es un cambio en la longitud de un enlace, tal como C-H o C-C.

 Flexión: es un cambio en el ángulo entre dos enlaces, tales como el ángulo de HCH en un
grupo metileno.
 Oscilación: es un cambio en el ángulo entre un grupo de átomos, tal como un grupo
metileno y el resto de la molécula.
 Menea: es un cambio en el ángulo entre el plano de un grupo de átomos, tal como un
grupo metileno y un plano a través del resto de la molécula.
 Doblaje: es un cambio en el ángulo entre los planos de dos grupos de átomos, tales como
un cambio en el ángulo entre los dos grupos metileno.
 Fuera del plano: es un cambio en el ángulo entre cualquiera de los enlaces C-H y el plano
definido por el resto de átomos de la molécula de etileno.
En un espectro de infrarrojo la intensidad de una banda de absorción es proporcional a la

derivada del momento dipolar molecular con respecto a la coordenada normal [52]. La intensidad
de las bandas Raman depende de la polarizabilidad.
Las vibraciones moleculares que se relacionan con el colesterol, glucosa, triglicéridos, colágeno,
hemoglobina y fibrina se presentan a continuación [28,36,46,53–56]:
Tabla 1 Vibraciones moleculares del colesterol.
Desplazamiento Raman (cm-1) Asignación

418 Colesterol.
429 Colesterol, éster de colesterol.
538 éster de colesterol.
548 Colesterol.
608 Colesterol
614 éster de colesterol
699 νC-S Gauche de cisteína, colesterol.
700 νC-S Cisteína, Colesterol,
702 Colesterol, éster de colesterol.
25
883 ρ(CH2) asignación de proteína, triptófano, colesterol

Banda del colesterol (asociado al espectro de la aterosclerosis), lípidos,
1444
ácidos grasos.
1669 Estiramiento carbonyl (C=O), éster de colesterol.
1670 Amida Colesterol y sus ésteres.
1674 Estiramiento de la vibración C=C, colesterol
Tabla 2 Vibraciones moleculares de la glucosa.
Desplazamiento Raman(cm-1) Asignación
477 Polisacáridos, amilosa, amilopectina
540 Grupo de la glucosa-sacarida.
α-Anomeros, grupo de la glucosa-sacarida (se sobrepone con

840
la banda acilo), Sacarido (α).
842 Glucosa.
847 Monosacaridos (a-glucosa), disacarido(maltosa)
Muy probablemente debido a las vibraciones de estiramiento

enlace sencillo para los aminoácidos y valina y polisacáridos.
850
Tirosina (resonancia de Fermi de anillos fundamentales y
armónicos).
854 Modo esquelético de un α-anómeros (polisacáridos, pectina).
Tirosina (asignación de proteína y polisacárido), olefínico

855
(asignación de proteína y polisacárido).
Los monosacáridos C-C (β-fructosa), modo esquelético(C-O-

868 C). Disacárido (sacarosa), modo esquelético(C-O-C).
Polisacáridos, amilasa. Polisacáridos, amilopectina.
Muy probablemente debido a las vibraciones de estiramiento

870 enlace sencillo para los aminoácidos Prolina y valina y
polisacáridos.
891 Grupo sacárido (se superpone con la banda de acilo).
Monosacáridos (β-glucosa), modo esquelético de (C-O-C).

898
Disacáridos (maltosa), el ADN.
913 Glucosa.
1071 Glucosa, lípidos.
26
1112 Grupo sacárido (se superpone con la banda de acilo).
1117 Glucosa, estiramiento C-C (lípidos de mama).
1343 Glucosa.
Tabla 3 Vibraciones moleculares de los triglicéridos.
Desplazamiento Raman (cm-1) Asignación
1070 Triglicéridos(ácidos grasos)
Tabla 4 Vibraciones moleculares del colágeno.
Desplazamiento Raman( cm-1) Asignación
507 S-S disulfuro de banda de tensión de colágeno.
524 S-S disulfuro de banda de tensión de colágeno.
Vibración(C-C) de la columna vertebral de Hidroxiprolina del

856
colágeno (colágeno de tipo I).
Prolina (colágeno de tipo I), (C-C) de vibración de la columna

937 vertebral de colágeno, la cadena principal C-C (asignación de
colágeno).
1030 Fenilalanina de colágeno.
1066 Prolina (asignación de colágeno).
1204 Hidroxiprolina, tirosina (asignación de colágeno).
1269 Amida III (asignación de colágeno).
Región fosfolípidos típicos asociados con el ADN y colágeno

1330
fosfolípidos.
1345 Meneado CH3, CH2 (asignación de colágeno).
27
1439 Deformación CH3, CH2 (asignación de colágeno).
1635 Diferencias en el contenido de colágeno.
Tabla 5 Vibraciones moleculares de la hemoglobina y la fibrina.
Desplazamiento Raman( cm-1) Asignación
1000 Hemoglobina
1542 Hemoglobina
1248 Fibrina pura
1342 Fibrina pura
En este capítulo se describió la espectroscopia Raman y todos los ruidos involucrados cuando se
toma un espectro Raman. Además de mostrar las ubicaciones de las bandas espectrales de mayor
interés para la realización de esta tesis.
28
Capítulo 4: Técnicas y métodos usados
Capitulo 4. Técnicas y métodos usados

En este capítulo se describen las técnicas utilizadas adicionalmente a la espectroscopia Raman
para el desarrollo de esta tesis. La primera parte detalla la tomografía óptica coherente,
seguidamente se define el análisis de componentes principales, sucesivamente se describe el
software NIRFAST que fue utilizado para diseñar geometrías de puntas de prueba Raman.
Después se puntualizan los componentes del espectrómetro Raman que se está utilizando, la
punta de prueba, el láser y finalmente el arreglo experimental utilizado.
4.1. Tomografía óptica coherente
La Tomografía Óptica Coherente (OCT del inglés optical coherence tomography) es una técnica
que consiste en la adquisición de señal óptica y su método de su procesamiento la cual alcanza
una resolución micrométrica, la reconstrucción de imágenes en tres dimensiones son posibles
dentro de los medios de esparcimiento óptico (por ejemplo, tejido biológico). La tomografía
óptica coherente es una técnica interferométrica, por lo general emplea luz infrarroja cercana. El
uso de luz de longitud de onda relativamente larga permite que penetre en el medio de
esparcimiento. La microscopía confocal, es otra técnica similar, la cual típicamente penetra
menos profundamente en la muestra [57].
Dependiendo de las propiedades de la fuente de luz (se han empleado diodos superluminiscente,
láseres ultracortos y láseres pulsados supercontinuos), ha alcanzado resolución sub-micrométrica
(con fuentes de muy amplio espectro que emiten en un intervalo de longitud de onda ~ 100 nm
de ancho).
Una aplicación relativamente reciente de la Tomografía Óptica Coherente en el dominio de la

frecuencia proporciona ventajas en la relación señal-ruido, lo que permite una adquisición más
rápida de la señal de la muestra. Los sistemas de Tomografía Óptica Coherente comercialmente
disponibles se emplean en diversas aplicaciones, incluyendo la conservación de arte y
diagnóstico en la medicina, especialmente en la oftalmología, donde se puede utilizar para
obtener imágenes detalladas desde dentro de la retina. Recientemente a comenzado a ser
utilizada en cardiología para ayudar a diagnosticar la enfermedad arterial coronaria [58].
Un diagrama esquemático de un sistema estándar a 930 nm (Thorlabs SR-OCT) se muestra en la

figura 11. La fuente de luz es un diodo superluminiscente (SLD) la cual es guiada a un
interferómetro de Michelson, en donde se divide la luz en dos trayectorias ópticas distintas. El
camino óptico del brazo de referencia termina en un espejo, mientras que el otro camino contiene
una lente formadora de imágenes que enfoca la luz sobre la muestra. Esta lente también se utiliza
29
para recoger la luz que es retroesparcida o reflejada desde la muestra. El regreso de la luz en el
extremo de los dos caminos se re combina y se dirige a un espectrómetro, que espacialmente
separa la luz para formar el patrón de interferencia que se analiza a continuación para producir la
imagen espectral del OCT. Si la longitud del brazo de muestra se fija, el patrón de interferencia
sería una simple función sinusoidal variable de longitud de onda, para la cual la transformada de
Fourier es un solo pico. Sin embargo, debido al hecho de que refleja la luz retroesparcida que se
origina a partir de distintas profundidades dentro de la muestra, surge una modulación en la
amplitud del patrón de interferencia que varía sinusoidalmente. Puesto que la modulación de la
amplitud depende de la profundidad, la transformada de Fourier representa la intensidad de la luz
esparcida o reflejada como una función de la profundidad.
Figura 11 Diagrama esquemático del sistema que se tiene en el laboratorio.
4.2. Análisis de componentes principales (PCA)
Una de las dificultades inherentes a la estadística multivariante es el problema de la visualización

gráfica de datos que tiene muchas variables. Cuando hay más de tres variables, es más difícil de
visualizar sus relaciones.
30
Afortunadamente, en los conjuntos de datos con muchas variables, los grupos de variables a
menudo se mueven juntos. En muchos sistemas sólo hay unas pocas variables pero una
instrumentación robusta permite medir docenas de variables del sistema. Cuando esto sucede, es
posible tomar ventaja de la redundancia de la información. Se puede simplificar el problema
mediante la sustitución de un grupo de variables con una nueva variable única. El análisis de
componentes principales es un método cuantitativo riguroso para lograr esta simplificación. El
método genera un nuevo conjunto de variables, llamadas componentes principales. Cada
componente principal es una combinación lineal de las variables originales. Todos los
componentes principales son ortogonales entre sí, así que no hay información redundante. Los
componentes principales como toda una forma una base ortogonal para el espacio de los datos.
Hay un número infinito de maneras de construir una base ortogonal para varias columnas de
datos. ¿Qué es tan especial sobre la base de las componentes principales?
La primera componente principal es de un solo eje en el espacio. Cuando se proyecta cada

observación en dicho eje, los valores resultantes forman una nueva variable. La varianza de esta
variable es el máximo entre todas las posibles elecciones del primer eje.
El segundo componente principal es otro eje en el espacio, perpendicular a la primera. El hecho

de proyectar las observaciones sobre este eje genera otra nueva variable. La varianza de esta
variable es el máximo entre todas las posibles elecciones de este segundo eje [59].
El conjunto completo de componentes principales es tan grande como el conjunto original de

variables. Sin embargo, son comunes para la suma de las varianzas de las primeras componentes
principales hasta alcanzar el 80 % de la varianza total de los datos originales. Al examinar los
argumentos de estas variables nuevas, los investigadores suelen desarrollar una comprensión más
profunda de las variables que generaron los datos originales.
4.3. NIRFAST
El software conocido como NIRFAST (Fluorescencia de infrarrojo cercano y Tomografía

espectral del inglés Near Infrared Fluorescence and Spectral Tomography, NIRFAST), simula la
propagación de la luz en el tejido biológico y está basado en el método de elementos finitos
(FEM).
31
4.3.1. Aproximación de la difusión
En general se acepta que si la magnitud de la fluencia isotrópico dentro del tejido es

significativamente mayor que la magnitud de flujo direccional. El campo de luz es 'difuso' ocurre
cuando las interacciones de esparcimiento dominan sobre la absorción y la región de interés está
lejos de las fuentes provocando que la fluencia de luz no cambie rápidamente con el tiempo. Esta
suposición permite una transición a partir de la ecuación de transporte radiativo, que se utiliza
para describir un campo de luz anisotrópico [60]. La aproximación de la ecuación de difusión, se
utiliza para predecir campos de fluencia isótropos.
La aproximación de difusión en el dominio de frecuencia está dada por
 i 
  k ( r ) ( r ,  )    a ( r )    ( r ,  )  q 0 ( r ,  ), (4.1)
 c m (r ) 
donde a y s ' son el coeficiente de absorción y el de esparcimiento reducido respectivamente,
q0 (r ,  ) es el término de la fuente isotrópica, (r ,  ) es la razón de la fluencia del fotón en la
posición r,  es la frecuencia de modulación,   1 3(    ) es el coeficiente de difusión y cm(r)

a s
es la velocidad de la luz en cualquier punto, definido por c0/n(r ), donde n(r) es el índice de
refracción en el mismo punto y c0 es la velocidad de la luz en el vacío.
La frontera aire-tejido está representada por una condición de índice de desacoplamiento tipo III
(también, conocida como condición de Robín o condición de frontera mixta), en la cual la
fluencia en el borde del tejido existe pero no regresa [61,62]. El flujo en la frontera externa es
igual a la tasa de fluencia en la frontera ponderada por un factor que considera la reflexión
interna de la luz dentro del tejido. Esta relación se describe por la siguiente ecuación:
^
( ,  )  2 A n k( ) ( ,  )  0, (4.2)
^
donde  es un punto en la frontera exterior, n es la normal apuntado hacia afuera, y A depende
del desacoplamiento del índice de refracción relativo (RI) entre el dominio del tejido  y el aire.
Aquí A se puede derivar de la ley de Fresnel:
3
2 /(1  R0 )  1  cosc
A 2
, (4.3)
1  cosc
donde c  arcsen(naire / n1 ) , es el ángulo al cual ocurre la reflexión total interna para fotones
moviéndose de la región Ω con RI n1 con RI naire en el aire y R0  ( n1 / naire  1)2 /( n1 / naire  1)2 .
En la frontera externa, RI es generalmente asumida igual que la del espacio libre, así que naire=1.
32
4.3.2. Implementación en elementos finitos
Cuando RI es homogéneo, la discretización de un volumen en elementos finitos Ω puede ser

obtenida subdividiendo el dominio en D elementos unidos a unos vértices de nodo V. En el
formalismo de elementos finitos, la fluencia en un punto dado, Φ(r), es aproximadamente por
tramos de una función polinomial continua,  h ( r )  V1  i ui ( r ) h , donde Φh es un subespacio
dimensional finito comprendido por funciones básicas ui (r ); i  1...V  elegidas para tener un
sustento limitado.
El problema para resolver Φh se convierte en una inversión de matriz dispersa. En el caso de

NIRFAST se usa la solución iterativa estabilizada de gradiente bi-conjugado. Como fue
desarrollado anteriormente [63,64] , la ecuación de difusión (4.1), en el marco de FEM, puede
ser expresada como un sistema de ecuaciones lineales:
  i  1 
 K( k )  c  a    F    q0 , (4.4)
  c m  2 A 
Donde las matrices K (k), c   a  i / cm  y F están dadas por:
Kij   k(r )ui (r )  u j (r )d n r (4.5)


 i  n
Cij    a (r )  ui (r )u j (r )d r (4.6)

c m ( r ) 
Fij   ui (r )u j (r )dn 1r . (4.7)

El vector de la fuente q0 tiene los siguientes términos
q0i   ui (r )q0 (r )dnr. (4.8)


El término de la fuente se define como una distribución Gausiana, igualando el perfil de

intensidad en la punta de la fibra óptica. La fuente por lo tanto se puede definir con más de un
elemento. Ya que se supone que es isotrópica esférica en el modelo estándar de difusión, la
simulación refleja con exactitud los datos experimentales cuando la fuente se centra una
distancia de esparcimiento de transporte (1 /  s' ) con la frontera exterior δΩ. Varios estudios se
han realizado para mostrar que este tipo de representación puede aproximar directamente las
fuentes, siempre y cuando los valores de la razón de fluencia más cercanos a la fuente no se
utilicen es decir, dentro de 3-5 longitudes de esparcimiento reducido [65].
33
Figura 12 Secuencia usada en NIRFAST para el modelo directo.
4.4. Arreglo experimental y componentes utilizadas
La información descrita en esta sección fue extraída del manual del espectrómetro provisto por
ocean optics y la información que se encuentra en línea en la página de inphotonics 4. Además de
mostrarse las características del láser las cuales fueron encontradas en la página de Btekw5.
4.4.1. Espectrómetro QE65000
El espectrómetro utilizado fue el espectrómetro QE65000 de Ocean Optics incluye un arreglo

lineal CCD conectado con la circuitería necesaria para la operación del espectrómetro, dando
4
http://www.inphotonics.com/probeRPB.htm
5
http://bwtek.com/products/cleanlaze/
34
como resultado un sistema compacto y flexible, con ninguna de sus partes móviles. El
espectrómetro QE65000 es una combinación única de tecnologías a disposición de los usuarios
con una inusualmente alta respuesta espectral óptica de alta resolución. La electrónica ha sido
diseñada para una gran flexibilidad en la conexión de varios módulos, así como interfaces
externas. Las interfaces del QE65000 para PC, PLC (controlador lógico programable) y otros
incorporados a través de los controladores para comunicación USB 2.0 o RS-232. El detector
usado en el espectrómetro QE65000, es un detector de enfriado TE (TEC), 1044x64 elementos
CCD de Hamamatsu. El QE65000 opera a través de USB (sin funcionamiento del TEC), o de
una fuente de alimentación +5 VDC. El espectrómetro QE65000 es controlado por un
microcontrolador, por lo tanto, todos los parámetros operativos se ejecutan a través del software
de interfaz de la unidad.
4.4.2. Componentes del espectrómetro QE65000
En la figura 13 se enumeran las diferentes componentes del espectrómetro QE65000.
Figura 13 Componentes del espectrómetro Raman QE65000.
1. Conector SMA: Asegura la entrada de fibra en el espectrómetro. La luz entra a la fibra de

entrada y esta lo conduce al banco óptico desde el conector.
2. Rendija (slit): Una pieza de material oscuro que contiene una abertura rectangular, la cual
va montada directamente detrás del conector SMA. El tamaño de la abertura regula la
cantidad de luz que entra al banco óptico y controla la resolución espectral. También
puede utilizar el QE65000 sin rendija. En esta configuración, el diámetro de la fibra
conectada al QE65000 determina el tamaño de la entrada de apertura.
3. Filtro: Restringe las radiaciones ópticas de comprobar la validez de las regiones de
longitud de onda determinada. La luz pasa a través del filtro antes de entrar en el banco
óptico. Ambos filtros pasa altas y pasa banda están disponibles para limitar la radiación a
determinadas regiones de longitud de onda.
35
4. Espejo colimador: La luz enfocada que entra hacia el banco óptico hacia la rejilla del
espectrómetro. La luz entra en el espectrómetro, pasa a través del conector SMA, la
rendija, y filtro, entonces se refleja en el espejo colimador dentro de la rejilla.
5. Rejilla: La luz Difractada del espejo colimador y directamente difractada por el espejo de
enfoque. Las rejillas están disponibles en diferentes densidades de líneas, lo que le
permite especificar la longitud de onda de cobertura y resolución en el espectrómetro.
6. Espejo de enfocamiento Recibe la luz reflejada desde la rejilla y se enfoca la luz en el
detector CCD o la lente de colección L2 (dependiendo de la configuración del
espectrómetro).
7. Área del detector con enfriamiento: Provee el 90 % de eficiencia cuántica y la caja de
píxeles en una columna vertical permite adquirir la luz en su totalidad a la altura de la
abertura de la imagen del espectrómetro. Esto mejora la luz recogida y la señal-ruido
significativamente.
8. Detector con filtro OFLV: Elimina los efectos de segundo orden y se utiliza con una
rejilla de HC-1 en un sistema de 200-950 nm de longitud de onda en un QE65000.
Las características del espectrómetro QE6500:
 El rango espectral es de 780 a 1000 nm

 La resolución óptica es de aproximadamente 0.14 a 7.7 nm y FWHM (~ 6 cm-1).
 Tiempo de integración es de 8 ms a 15 min.
 Punta de prueba Raman RIP-RPB.
El diseño más simple de una sonda de fibra óptica Raman consta de dos fibras montadas juntas.
En esta configuración, una fibra se adjunta a la fuente de excitación láser y se ilumina la zona de
muestreo. La otra fibra recoge la luz difusa y transmite la energía al espectrómetro. La luz
colectada puede ser amplificada por medio de más fibras de colección o mejorar la superposición
entre la excitación y la recaudación mediante la adición de fibras óptica de enfocamiento.
4.4.2.1. Diseño con filtraje eficiente
El RamanProbeTM se basa en un diseño patentado (EE.UU. Patent 5, 112127) que optimiza el

rendimiento óptico de fibra. Esta se trata de fibra de dos sondas, una fibra se utiliza para la
excitación y otro para la colección. La superposición entre los dos extremos de fibra se ha
optimizado mediante el uso de una lente de enfoque, por lo tanto se tiene la luz del láser y la
colección de la radiación esparcida. La trayectoria del haz se muestra en la figura 14. En el
extremo de la fibra de excitación, se utiliza una lente colimadora de la luz láser. Un filtro pasa
banda que elimina las bandas Raman de sílice, sólo se transmite luz láser. El filtro dicroico
transmite también a la línea láser la cual va una lente que enfoca la luz en la muestra. La misma
lente recoge la luz que es esparcida 180° desde la dirección de la luz láser (la geometría de retro-
esparcimiento). La señal de colección es entonces reflejada por el filtro dicroico a través del
36
filtro pasa altas que sólo transmite la luz con esparcimiento Raman de Stokes. Este último filtro
atenúa la banda de Rayleigh en un factor de 108, lo que reduce la observación de las bandas de
Raman de sílice que se plantean en la recopilación de fibra. Por último, otra lente se utiliza para
enfocar la luz, ahora consiste de bandas solo de la muestra en la fibra de salida. Todas esta
ópticas están contenidas en 0.5"(25,4 mm) de diámetro de acero inoxidable. El filtrado en la
punta de prueba Raman es tan eficiente que el rango espectral completo, incluida la línea láser,
se puede visualizar en un CCD sin filtrado adicional en el espectrómetro. Los componentes
ópticos son capaces de soportar temperaturas elevadas (aproximadamente 200 °C) y, con la
adición de una extensión de tubo, se pueden mover más lejos de la muestra en aplicaciones de
mayor temperatura. En la figura 14 se muestra el diagrama de la punta de prueba.
Figura 14 Diagrama de la punta de prueba
La distancia focal es de 7.5 mm y está diseñada para un láser de 785 nm. Sus dimensiones son de
114 x 38 x 12.5 (mm).
4.4.2.2. Láser 785 nm
La Serie de láseres BRM tiene una línea espectral angosta, alta potencia láser, desarrollado
específicamente para la aplicación de la espectroscopia Raman. Es compacta y robusta, apta para
diversas aplicaciones industriales, con un láser integrado, con enfriador termoeléctrico y
conector de fibra.
Las características del láser son:
 Tiempo de calentamiento menor a 15 minutos.

 El tiempo de vida del láser es de 10,000 horas.
 Potencia de salida menor a 500 mW.
 El ancho de la línea espectral es de 0.2 nm.
 Conector SMA 905.
37
4.5. Arreglo experimental
En el arreglo experimental se ocupa un láser como fuente de excitación de 785 nm. Se tiene una
punta de prueba de 2 fibras, una de colección que va conectada al espectrómetro y la otra para la
fuente de excitación respectivamente. El arreglo está configurado de la forma que se muestra en
la figura 15. En la distancia focal de la punta de prueba se obtiene la mejor señal. Además de una
montura que tiene un desplazamiento de vertical para obtener la distancia del punto focal de la
punta de prueba. La PC está conectada al espectrómetro mediante un puerto USB. El software
que se ocupa es el spectra Suite® desarrollado por Ocean Optics.
Figura 15 Arreglo experimental empleado en esta tesis
En este capítulo se ha descrito la tomografía óptica coherente, se dio una explicación muy
general de en qué consiste el análisis de componentes principales, además de la descripción de
cómo funciona el software Nirfast, las partes del espectrómetro utilizado, las características del
láser, la punta de prueba utilizada, Asimismo se detalla el arreglo experimental utilizado para
realizar esta tesis.
38
Capítulo 5: Método de procesado
Capitulo 5. Método de procesado

En este capítulo se abordan un par de problemas encontrados en la espectroscopia, los cuales son
el ruido de disparo y la fluorescencia de fondo. Existen muchos métodos para removerlos pero en
esta tesis se hace una propuesta de método de remoción de ruido y se utiliza uno reportado en la
literatura para sustraer la fluorescencia debido a que el comportamiento es similar a los que se
obtienen en los espectros de esta tesis. En la primera sección se describe el método de reducción
de ruido utilizando wavelets de tipo Symlets y en la segunda sección se describe el método para
sustraer fluorescencia MimMax.
5.1 Reducción de ruido usando wavelets
Aunque las wavelets, como objeto de investigación organizada, tienen menos de dos décadas, se
derivan de muchos conceptos desarrollados durante un período de casi dos siglos, siendo
repetidamente redescubiertas por científicos que querían resolver problemas técnicos de diversas
disciplinas. Los procesadores de señales estaban buscando una manera de transmitir mensajes
claros a través de los hilos telefónicos. Los que realizaban prospecciones petrolíferas querían
encontrar una forma mejor de interpretar las señales sísmicas. Pese a todo, el término "wavelets"
no entró a formar parte de la terminología habitual entre los científicos hasta que la teoría se
liberó de las distintas aplicaciones en las que surgió y se sintetizó en una teoría puramente
matemática. Esta síntesis, en cambio, abrió los ojos de los científicos a nuevas aplicaciones.
A diferencia de la transformada de Fourier, en el análisis con wavelets no se asume que la señal

analizada sea periódica por lo tanto es posible estudiar señales que exhiben cambios bruscos e
incluso discontinuidades utilizando muchas menos funciones wavelet base que las que se
necesitarían si se utilizaran funciones seno y coseno para alcanzar una aproximación adecuada.
Las wavelets permiten que la información sea codificada por medio de los coeficientes de
wavelet de acuerdo a niveles de detalle o medidas de la cantidad detallada de información, es
decir permite que la información sea analizada dependiendo de las escalas o resoluciones. La
resolución se varía con las operaciones de filtrado mientras que la escala es determinada por
operaciones de descomposición o interpolación.
5.1.1. Wavelets
La wavelets se usan como funciones base para representar otras funciones tal y como se hace con
las funciones seno y coseno en la transformada de Fourier. La transformada wavelet permite un
39
análisis multi-resolución, es decir, la observación de señales en frecuencias distintas a distintas

escalas de resolución, lo que permite tener una noción del contenido en frecuencia de la señal.
Los componentes de alta frecuencia de una señal son localizados con menos error en el dominio
del tiempo mientras que los componentes de baja frecuencia son localizados mejor en el dominio
de la frecuencia. El análisis multi-resolución está diseñado para dar una resolución alta en el
dominio del tiempo y baja en el de la frecuencia para frecuencias altas y resolución alta en
frecuencia y baja en el dominio del tiempo para frecuencias bajas. Este tipo de análisis es
principalmente útil para señales que tienen componentes de alta frecuencia de corta duración y
componentes de baja frecuencia de duración prolongada [66].
La transformada wavelet es la representación de una señal en términos de una forma de onda de

longitud finita o de oscilación rápidamente decreciente y con valor medio cero, llamada wavelet
madre o función prototipo. Esta forma de onda se escala y desplaza para generar ondas que si se
superponen igualan a la señal original. Se puede decir que es una función en términos de
oscilaciones tanto en el tiempo como en la frecuencia.
1  t  k 0 s0j 
 j , k (t )   j . (5.1)
s0  s0
j

Se puede cubrir el espectro finito de la señal con el espectro de wavelets dilatadas (cambiando la
escala) en la misma forma en que cubrimos el dominio del tiempo de nuestra señal con wavelets
trasladadas. Si una wavelet puede verse como un filtro pasabanda, una serie de wavelets
dilatadas puede verse como un banco de filtros pasabanda. El factor de fidelidad Q (tasa entre la
frecuencia central del espectro y su ancho) es constante para todas las wavelets [67].
Figura 16 Espectro wavelet resultante de escalar la wavelet madre en dominio del tiempo
El análisis con wavelets permite definir una función prototipo o wavelet madre que no siempre
es la misma, es decir las funciones base no siempre son iguales a diferencia de lo que ocurre en
la transformada de Fourier donde las funciones base son siempre el seno y el coseno. Las
wavelets madre se pueden diseñar dependiendo de los gustos y las necesidades del diseñador
siempre y cuando cumplan algunas normas.
40
El análisis en el dominio del tiempo se realiza con una versión contraída o de alta frecuencia de
la wavelet madre y el análisis en frecuencia se realiza con una versión dilatada o de baja
frecuencia de la misma. Teniendo en cuenta que la señal original puede ser expresada como una
expansión o serie de wavelet (usando coeficientes en combinación lineal de funciones wavelet)
las operaciones con los datos pueden ser realizadas usando únicamente los coeficientes wavelet
correspondientes lo que hace las operaciones menos complejas que las que hay que hacer cuando
se utiliza la transformada de Fourier [68].
El análisis con wavelets emplea regiones de tamaño variable, utiliza intervalos largos de tiempo
donde se necesita mucha información que necesita baja frecuencia y pequeñas regiones donde la
información necesita altas frecuencias.
5.1.2. Wavelets discretas
Cuando se usan wavelets discretas para transformar una señal continua el resultado es una serie
de coeficientes que se conocen como la descomposición en series wavelet. Es posible reconstruir
la señal original a partir de su transformada wavelet discreta. Además esta provee suficiente
información para analizar y sintetizar una señal mientras reduce la cantidad de operaciones a
realizar pues no contiene información redundante [69].
f (t)   ( j, k) j ,k (t) (5.2)
5.1.2.1. Transformada inversa a partir de los coeficientes
La transformada de wavelet discreta de una señal x se calcula pasando la señal por una serie de
filtros. Primero se pasa por un filtro pasa bajas con respuesta al impulso g que remueve las
frecuencias por encima de la mitad de la frecuencia máxima, lo que lleva a la convolución de
ambas [70]:

y[n]  ( x  g )[ n]   x[k ]g[n  k ]
k 
(5.3)
41
La señal se descompone simultáneamente con un filtro pasa altas h. Las salidas contienen los
coeficientes detallados (del filtro pasa altas) y los coeficientes aproximados (del pasa bajas).
Después de pasar la señal por un filtro pasa bajas de media banda como el que se utilizó
anteriormente, como la frecuencia máxima se redujo a la mitad, la mitad de las muestras pueden
ser descartadas, de acuerdo con la regla de Nyquist. Por lo tanto se sub-muestrean las salidas de
los filtros por 2. Con esto la escala de la señal se duplica:

ybaja [n]   x[k ]g[2n  k ]
k 
(5.4)

yalta [n]   x[k ]h[2n  k ]
k 
(5.5)
Esta descomposición reduce la resolución en el tiempo a la mitad pues solo la mitad de las
muestras a la salida de cada filtro caracterizan la señal entera. Sin embargo, cada salida tiene la
mitad de la banda de frecuencia de la señal original por lo tanto la resolución en frecuencia se
duplicó. Con esto se reduce la incertidumbre en la frecuencia a la mitad con lo que se cumple
con el principio de incertidumbre de Heisenberg.
Después del diezmado la resolución no se ve afectada porque remover la mitad de los

componentes espectrales de la señal hace que la mitad de las muestras sean redundantes de todas
maneras, es decir, la mitad de las muestras pueden ser descartadas sin que se pierda información.
Esta es la razón por la cual la escala se duplica. La transformada wavelet consiste en un
componente aproximado final y todos los componentes de información detallada para cada nivel,
que están definidos por la salida del filtro pasa altas que constituye los coeficientes de wavelet
para el nivel correspondiente. La transformada wavelet discreta utiliza dos funciones: la función
de escalamiento asociada al filtro pasa bajas y la función wavelet asociada al filtro pasa altas.
En cada nivel de descomposición, es decir, cada vez que se repita el proceso, el filtrado y el
diezmado resultarán en la mitad de las muestras y por lo tanto reducirán la resolución en el
tiempo cada vez a la mitad, y reducirán a la mitad la banda de frecuencia con lo que se duplica
cada vez la resolución en frecuencia.
La transformada wavelet discreta de la señal original es la concatenación de los coeficientes

wavelet de cada nivel que se grafican empezando por los del último nivel de descomposición. La
transformada tendrá el mismo número de coeficientes que tiene la señal original
La localización en el tiempo de las frecuencias en la señal transformada tendrá una resolución

que depende del nivel en el que se presentan. Si la información importante de la señal está en las
frecuencias altas, como ocurre generalmente, la localización en el tiempo de estas frecuencias
42
será más precisa, este es el principio de diseño del análisis multi-resolución, y se daporque estas
frecuencias están caracterizadas por un mayor.
Las bandas de frecuencia que contengan información importante se verán como amplitudes altas
en las regiones de la transformada que contengan estas frecuencias. Por el contrario las bandas de
frecuencia que no contienen mucha información se verán como amplitudes pequeñas y esas
regiones de la señal transformada pueden ser descartadas para reducir la cantidad de datos.
Las wavelets dentro de una familia se clasifican en subclases según el número de vanishing
moments que está relacionado con el número de coeficientes y es el número que aparece al lado
del nombre de la wavelet.
La señal original debido al continuo diezmado por 2 debe ser una potencia de 2 o al menos un
múltiplo de una potencia de dos para que el proceso sea eficiente. La longitud de la señal
determina la cantidad de niveles en los que la señal puede ser descompuesta.
5.1.3. Wavelets symlets
Las wavelets Daubechies son una familia de wavelets ortogonales definidas por la transformada
discreta wavelet y caracterizadas por un número máximo de vanish moments para darles algo de
soporte. Cada una de este tipo de wavelets de esta clase, tienen una función escala (también
llamada wavelet padre) la cual genera un análisis de multi-resolución ortogonal [70].
Las symlets sonwavelets casi simétricas propuestas por Daubechies como modificación de la
familia Daubechies (db). Las propiedades de las dos familias son similares.
Las propiedades de las symlets son:
 Son casi simétricas

 Ortogonales
 Biortogonales
Figura 17 Wavelet Symlet 6, (izquierda) función de escala y (derecha) función Wavelet
43
5.1.4. Descripción del método
La espectroscopia Raman da una dependencia de intensidad de la luz esparcida inelásticamente

en desplazamiento Raman Δ (1/ λ) de los fotones después de su interacción con el material. El
espectro resultante puede ser tomado como la señal modulada f(x), donde el eje x es el cambio
Raman. El algoritmo de wavelets divide la señal f(x) en diferentes componentes de frecuencias.
La transformada de Fourier, tradicionalmente usada en procesamiento de señales, hace lo mismo,
pero no puede conservar la información de la señal en forma espacial. En contraste la
descomposición wavelets usa funciones espacialmente localizadas con valor promedio cero
(llamadas wavelets, pequeñas ondas) en vez de la convencional funciones sinusoidales de la
transformada de Fourier y hace posible tener ambas informaciones en frecuencia y espacio.
Básicamente, la señal f(x) es representada en términos de la suma de wavelets elementales [71].
La representación jerárquica de los datos es obtenida permitiendo un análisis de multi-resolución

conocido como la transformada wavelets discreta (DWT), en la cual los detalles o fluctuaciones
de diferentes niveles de resolución son representados por la superposición de wavelets con
dilatación intercambiable.
Primero introducimos el espectro que se le va a quitar el ruido, luego se realiza la

descomposición en wavelets de la señal a un nivel 5 usando symlet 6. Después se estima la
desviación estándar del ruido esto se obtiene del detalle de los coeficientes al nivel 1,
correspondiente al índice de nodo 2. Usamos el wpbmpen para seleccionar el umbral global para
quitar el ruido de la señal, usando el parámetro recomendado en este caso alpha 2. Luego se usó
wpdencmp para remover el ruido de la señal utilizando un umbral por encima del umbral suave y
manteniendo la aproximación. Finalmente se obtiene una señal sin ruido pero con fluorescencia
de fondo [72].
La figura 18 muestra el diagrama del análisis en multi-resolución de una señal, como se puede
ver la señal original se va descomponiendo en detalles y aproximaciones, hasta el nivel que se
quiera, esto sirve para determinar cuáles son las frecuencias del espectro que no se necesitan para
la reconstrucción de la señal sin ruido. En la figura 19 se muestra un ejemplo usando el espectro
del alcohol 96. En la figura 4 se muestra una descomposición que solo toma una aproximación y
los 5 detalles de la señal, esa es la descomposición que se está utilizando para quitar ruido en este
trabajo. La figura 19 muestra el espectro Raman sin ruido, como se puede ver todas las
frecuencias altas fueron removidas para obtener un buen resultado.
44
Figura 18 Descomposición de multi-resolución.
Espectro y sus ap roximaciones Espectro, Coefs y detalles

5
400
4
200 3 cfs
s 2
0 1
400
150 200
s
a 100
0
5 50
0 50
0
d
200 -50 5
a 100
-100
4
100
0
0 d
300
4
-100
200
a 100
3 100
0 0 d3
400 -100
40
a 200 20
2 0
-20 d
0 -40 2
-60
400 40
20
a 200 0 d
1 1
-20
0 -40
200 400 600 800 1000 200 400 600 800 1000
Figura 19 Ejemplo de un espectro descompuesto en multi-resolución.
45
Decomposicion al nivel 5 : s = a5 + d5 + d4 + d3 + d2 + d1 .
400
200
s
0
150
100
a5
50
0
50
0
d5
-50
-100
100
d4 0
-100
100
d3 0
-100
40
20
0
d2 -20
-40
-60
40
20
d1 0
-20
-40
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Figura 20 Descomposición de la señal usando wavelets.
500
450
400
350
300
Intensidad (U.A)
250
200
150
100
50
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Desplazam iento Ram an (cm -1)
Figura 21 Espectro Raman sin ruido.
46
Para eliminar la fluorescencia se hizo uso del método propuesto por Alex Cao [73], debido a que
fue diseñado a tipos de fluorescencia de comportamiento Gaussiano y es del tipo que se obtienen
en esta tesis.
5.2. Método adaptivo MimMax.
5.2.1. Ajuste polinomial modificado
El ajuste polinómico modificado descrito por Lieber y Mahadevan-Jansen [74] parece más
prometedor por tres razones:
 Utiliza un ajuste de mínimos cuadrados que excluye los picos Raman.

 Que funciona para una amplia proporción F/S (fluorescencia/señal).
 Que no requiere la intervención del usuario.
El método consiste en una serie de ajustes de curvas y reasignación iterativa de puntos de

control. El método inicia con un ajuste polinómico del espectro original .En la siguiente
iteración, para cada valor de x, el valor mínimo de y de cualquiera ya sea del ajuste polinómico o
el espectro original es seleccionado como punto de control para el siguiente ajuste de la curva.
El proceso se repite hasta que un criterio de convergencia especificado se cumple, o hasta que el
número máximo de iteraciones se alcance. El criterio de convergencia es que el número de los
puntos re-asignados se mantendría constante durante 10 iteraciones consecutivas o 200
iteraciones, lo que ocurra primero. A partir de aquí, vamos a eliminar el término «modificación»
y asumir que todo polinomio de ajuste mencionado a continuación es modificado a menos que se
indique lo contrario.
5.2.2. Ajuste adaptable
En la práctica, es posible encontrarse con una amplia gama de proporciones F/S. Dependiendo de
la instrumentación y el tipo de muestra, es difícil predecir la cantidad de corrección necesaria de
antemano. Se define la relación F/S como la fluorescencia máxima dividida por el esparcimiento
Raman máximo (es decir, restarse espectro) de la señal cuando se mide con respecto a un valor
mínimo de intensidad de cero. La definición establece que la razón F/S permanece constante si el
espectro se desplaza a lo largo del eje y (es decir, intensidad), ya que el perfil (fluorescencia +
esparcimiento Raman) sigue siendo idéntico.
El ajuste polinomial no se realiza sistemáticamente en todas los proporciones de F/S. Para

ilustrar, se añadió un fondo gaussiano a un espectro de tejido normalizado con dos diferentes
proporciones F/S: 10 y 100 (Fig. 22). El contorno del espectro se puede ver para bajas
47
proporciones F/S. Por otro lado, el espectro está saturado con fluorescencia en la mayor
proporción F/S. El ajuste Polinomial de cuarto y quinto orden (más comúnmente mencionado en
la literatura) se aplicaron a la fluorescencia + el espectro.
Figura 22 Espectro de la muestra con adición de fondo Gaussiano con diferentes proporciones F/S. El contorno del
espectro original visible se presenta en una proporción de 10, mientras que el otro espectro tiene una proporción de
fluorescencia de 100.
La Figura 23 muestra los residuos de los espectros normalizados restados de los ajustes
polinómicos con el original. Para F/S=10 (columna de la izquierda), el ajuste de cuarto orden
tiene un residual absoluto más pequeño que el ajuste de quinto orden. Sin embargo, para
F/S=100 (columna de la derecha), el ajuste de quinto orden resulta superior. Por consiguiente, se
puede decir que es un algoritmo adaptativo, basado en un estimado de la relación F/S en el
espectro. Así se obtienen mejores resultados que un ajuste de un solo orden a través de todas las
proporciones de F/S.
Figura 23 Se muestran los residuos de los espectros normalizados restando el ajuste del espectro original.
48
5.2.3. Ajuste Polinomial en forma restringida
Otro problema que se presenta en los ajustes polinómicos que se puede ilustrar con el ejemplo
anterior es que los puntos extremos del ajuste pueden sufrir de inestabilidad. El ajuste de quinto
orden (Fig. 22) diverge del espectro de referencia cerca de 750 cm-1 en el escenario de menor F/S
y ambos órdenes divergen en torno a 750 cm-1 cuando proporción F/S es mayor. Para minimizar
este problema, se propone modificar el ajuste polinómico mediante la inclusión de los puntos
finales de los espectros en los puntos de control para evitar que el polinomio diverja
significativamente del espectro en los dos extremos (Fig. 24). Esto ayudara a mantener el ajuste
cerca del espectro en los puntos finales.
Figura 24 Se muestra el espectro del polinomio sin restricciones (ajuste de quinto orden) y el restringido (ajusto de quinto
orden restringido) que se ajustan para remover la fluorescencia.
5.2.4. Ajuste polinómico MimMax
Hay un equilibrio con el ajuste polinómico restringido (Fig. 24), ya que introduce distorsión (es
decir, área bajo la curva) en las secciones medias del ajuste debido a la restricción. En
consecuencia, se propone una técnica de dos pasos que toma ventaja de los beneficios de cada
ajuste polinómico.
El primer paso implica la realización tanto de la forma no restringida y restringida del ajuste
polinómico de dos órdenes diferentes. Los órdenes de ajuste serán determinados por la parte
adaptativa del algoritmo basado en la relación F/S. El segundo paso toma el valor máximo entre
los ajustes iniciales como los puntos para el ajuste final (Fig. 25). Esta técnica se le llama método
49
"MimMax '. La parte 'Min' de la técnica es la primera parte del algoritmo, que toma el punto
mínimo entre el espectro y el ajuste polinómico, con la finalidad evitar el sobreajuste de los
datos. La parte "Max" de la técnica es la segunda parte del algoritmo que toma el valor máximo
entre todos los ajustes polinómicos realizados, lo que impide el bajo ajuste de los datos
asumiendo que el ajuste de la primera parte de la técnica no ha sobre ajustado los datos. Por tal
motivo el método adaptativo MimMax funciona mejor que un ajuste polinómico de orden único
en todas las proporciones de F/S.
Figura 25 Ejemplo de la forma del ajuste MimMax en un espectro con fluorescencia de fondo gaussiano.
En este capítulo se describió el método utilizado para remover el ruido y para sustraer la
fluorescencia de fondo. Los cuales son partes no deseables de un espectro Raman para poder
hacer una eficaz asignación de bandas espectrales y un ajuste adecuado de ellas. El método usado
para reducir ruido usando wavelets es muy eficaz y rápido, además que es automático solo se le
tiene introducir la señal para que el haga su trabajo. En el método de MimMax es un poquito más
lento, porque hay que asignarle el polinomio con el que debe hacer el ajuste de la fluorescencia
que se quiere remover.
50
Capítulo 6: Resultados
Capitulo 6. Resultados
En este capítulo se presentan los resultados que se obtuvieron en este trabajo. Está dividido en el
estudio del efecto del color de la piel en los espectros Raman, la realización de mapas de la piel,
imágenes OCT para ver la zona que se está midiendo, los experimentos que se realizaron con
tejidos sintéticos (phantoms) hechos con PDMS, la influencia del tipo de sangre en el
diagnóstico, los espectros de los fluidos intersticiales y finalmente el diseño de una punta de
prueba con mayor eficiencia que la que se tiene en el laboratorio.
6.1. Efectos del color de piel en los espectros Raman
Los tipos de muestras de voluntarios para tomar Espectros Raman son los tonos café, de ahí que
el comportamiento estructural de la Raman espectro tiene la misma forma. Sólo encontramos
variaciones en la intensidad. Todos estos espectros Raman se tomaron usando 150 mW y 10
segundos de tiempo de integración de acuerdo a la norma ANSI Z136.1-2007 (ver apéndice B).
Se midió en la muñeca, debido a esta parte siempre da el sol, incluso si usamos camisa de manga
larga. En la figura 26 se muestra los diferentes colores de piel de los voluntarios que participaron
en este trabajo.
Figura 26 Se muestran los distintos colores de piel de los voluntarios de este experimento.
51
7000
S1
S2
6000 S3
S4
S5
5000 S6
S7
Intensidad (U.A)
S8
4000 S9
S10
3000
2000
1000
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Desplazamiento Raman (cm )
Figura 27 Se muestra la fluorescencia del espectro Raman obtenidos de los voluntarios.
Basándonos en los resultados mostrados en la figura 27 se concluye que la coloración de la piel

influye en la señal Raman. Si se toma el espectro de un voluntario de color claro de piel se
obtendrá un mejor espectro que si se tiene un voluntario de color café oscuro. Esto se debe a que
hay mayor absorción en la piel cuando se tiene una coloración más oscura.
6.2. Mapas Raman de la piel
En la espectroscopia Raman se puede construir imágenes, cuyo contraste se basa en cualquier

propiedad de la muestra directa o indirectamente contenida en el espectro. Los dos usos
principales de formación de imágenes Raman son para determinar la composición química
relativa y la clasificación. La composición química es más comúnmente utilizada para
proporcionar contraste para la determinación de la distribución espacial de los componentes
químicos. La intensidad en cualquier píxel de la imagen es proporcional a la cantidad de
componente en el punto correspondiente a ese pixel. Del mismo modo, la relación de intensidad
de dos componentes también se puede utilizar para determinar una composición relativa.
Ejemplos importantes incluyen la vibración del compuesto y orientación de los componentes.
52
Otras propiedades químicas y físicas se pueden detectar a través de parámetros tales como el
centro de gravedad, el área, y el ancho de las bandas de Raman.
Los tres métodos generales para construir un mapa Raman fueron propuestos y demostrados en
1975 permanecen en uso hoy en día, pero con la tecnología se han ampliamente mejorado. Ellos
son el punto de enfoque y punto por punto de exploración, la línea de enfoque y análisis línea por
línea, campo amplio (también llamado global) de iluminación y detección de imágenes [75] .
6.2.1. Mapeo de punto a punto
En este método el láser es enfocado y el objeto bajo prueba es pasado por el foco del láser, o el
láser es movido sobre el objeto. Etapas motorizadas x-y son utilizadas comúnmente para mover
el objeto.
Si bien las platinas disponibles como accesorios para microscopios de investigación se pueden
colocar con precisión mejor que ± 1 micra y pueden tener incrementos de 0.1 µm, deben dejarse
en reposo durante aproximadamente 0.5 s para alcanzar esta precisión [76]. El tiempo de
estabilización puede añadir un tiempo significativo a la hora de adquisición de imágenes en
general, cuando el tiempo de integración en cada píxel es sólo un segundo o unos pocos
segundos. A pesar del problema del tiempo muerto, las platinas motorizadas siguen siendo
populares entre los vendedores y usuarios. Una razón importante es que estas platinas son útiles
tanto para la mapeo con microscópico y para el mapeo de mayor escala, debido a que los
modelos más comunes son capaces de viajar 10-20 cm en cada eje. Existen diversas
metodologías de análisis que pueden reducir el tiempo muerto. Un método consiste en utilizar
una platina de traslación más rápida. Es preferida una platina x-y conducida por traductores
piezoeléctricos, porque estas platinas se establecen en 0.001 s o menos. Mientras que pueden
hacerse en pasos tan pequeños como 10-20 nm, la mayoría es de flexión (de una pieza) y algunos
diseños pueden viajar sólo unos pocos milímetros en cualquier dirección. Alternativamente, el
haz del láser puede ser escaneado, como comúnmente se hace en microscopía confocal.
6.2.2. Escaneo de línea
El escaneo en línea ofrece un método de generación de imágenes rápida más rápida con respecto
a los otros métodos de mapeo. En este método, el láser se enfoca en forma de línea, por lo
general con una lente cilíndrica. Debido a que la lente se enfoca un haz gaussiano para una alta
relación de aspecto, sólo la parte central de la línea es utilizable. Este problema se puede superar
con una lente Powell [77], el cual enfoca el haz a un rectángulo de alta intensidad uniforme. En
la configuración de exploración más popular, la línea de haz enfocado es estacionaria y el objeto
se traslada por debajo de él. En algunas ocasiones el haz enfocado en línea se escanea a través de
53
un objeto fijo [78]. La reducción en el tiempo total de medición comparado con el escaneado
punto por punto, porque 100 o más espectros se obtienen simultáneamente. El tiempo de
medición para adquirir estos espectros puede ser corto o sólo un poco más largo que el tiempo de
medición para un solo espectro con un punto de láser enfocado. La razón es que la potencia total
láser puede ser mucho mayor en el caso de línea enfocada. Sin embargo, debido a que cada CCD
fila contiene el espectro a 1 pixel, el detector debe ser leído píxel por píxel. Para minimizar ruido
del detector CCD se leen en tasas bajas (16-50 kHz), de modo que 1-3 s se requiere para leer el
detector, en función del número de pixeles en el detector. Este tiempo se puede reducir por el
movimiento de la etapa de sincronización con la lectura de la fila inferior del detector, seguido
de desplazamiento de la imagen espectral restante una fila hacia el registro de lectura [79]. Una
alternativa, por lo menos para su uso con el láser verde, es utilizar un detector de lectura rápida.
El CCD de electrones multiplicador (EMCCD) se ha utilizado para este fin [78]. Se pueden leer a
1 MHz o más rápido. Debido a que el mecanismo de ganancia de avalancha de EMCCD presenta
muy poco ruido, la amplificación también permite la reducción de tiempos de adquisición de las
muestras que contengan esparcimiento débil. En la línea de escaneado de reproductores de
imágenes Raman, la rendija de entrada del espectrómetro se usa a menudo como el filtro espacial
que permite el funcionamiento confocal. El seccionamiento dinámico se puede conseguir si la
función de esparcimiento de punto del objetivo es de-convolucionada píxel por píxel a lo largo
de la dirección de la rendija.
6.2.3. Iluminación global
Un filtro de banda estrecha se puede usar para formación de imágenes Raman. La primera
instrumentación exitosa moderna emplea un filtro de interferencia, que puede ser inclinado para
variar la banda de paso [80]. Posteriormente, Filtros sintonizables acusto-ópticos (AOTF) [81] y
filtros de cristal líquido sintonizables (LCTF) [82] se introdujeron en formación de imágenes
Raman y proporcionado sintonizablidad electrónica. Los filtros sintonizables ha demostrado ser
más útiles para la medición de bandas aisladas. Si sólo unos pocos fotogramas son necesarios
para definir la banda, imágenes Raman globales puede ser más rápidas. Donde hay muchas
bandas superpuestas o un fondo no lineal, muchas imágenes deben ser tomadas en diferentes
desplazamientos Raman, y desaparece la ventaja del tiempo.
Cabe señalar que la transmisión del filtro acústico-óptico es de sólo 50 %, mientras que la
transmisión del filtro de cristal líquido es de aproximadamente 20-40 %. Por el contrario, un
filtro dieléctrico pasa a 80-90 % de la luz incidente. Las diferencias surgen debido a que tanto el
AOTF y LCTF operar con luz polarizada linealmente. En la mayoría de microsondas Raman,
ambos componentes de polarización del esparcimiento Raman se recogen, incluso cuando el
láser excitante está polarizado linealmente.
54
6.2.4. Datos obtenidos
Se ha construido una etapa motorizada la cual se mueve en x-y, en el eje z, el cual se emplea para
enfocar el láser se ha puesto un sensor para garantizar el punto de enfoque. La etapa motorizada
x-y se puede posicionar con exactitud de 6 micras, en el eje de enfoque podemos precisar hasta
10 micras, que es más que suficiente para garantizar el punto de enfoque de 7.5 mm. Usando el
diagrama en la figura 28 y la formula 6.1 se puede calcular la mancha que se genera en el punto
focal de la punta de prueba.
Figura 28 Arreglo óptico básico de una punta de prueba, donde D es el diámetro de la fibra de excitación, FC es la
distancia focal de la lente colimadora, FF es la distancia focal de la lente que da la distancia focal de la punta de prueba y
S es la mancha que genera el láser.
ff
s * d, (6.1)
fc
ff  7.5 mm
fc  4.9 mm
d  105  m
S  160.7143 m
Debido a lo mencionado anteriormente los mapas que se muestran en este estudio son 5 por 5
mm, con una resolución espacial de 500 micras por paso. El sistema de control de la etapa x-y
fue diseñado en LabVIEW y el sistema de enfoque fue construido, utilizando un
microcontrolador PIC16F877A. La longitud de onda de excitación utilizada para este trabajo es
785 nm, con un espectrómetro de 6 cm-1 de la resolución y de la región espectral de los intervalos
utilizados 0 a 2000 cm-1. El arreglo usado se muestra en la figura 29. La interfaz desarrollada se
muestra en la figura 30, como se puede ver se tiene un botón para mover en x y en y, también se
le puede decir cuánto quieres que se mueva y cuánto tiempo quieres que se tarde en moverse,
para esos son los botones milímetros y retardo.
55
Figura 29 Arreglo experimental empleado para hacer los mapas de la piel.
Figura 30 Imagen de la interface desarrolla en LabVIEW para realizar los mapas de la piel.
Utilizamos 5 segundos de tiempo de integración por cada cuadrícula que se muestra. Los mapas
completos toman un tiempo de 500 s para obtener la morfología completa de la piel. Se Utiliza
40 mW de potencia para cada mapa, y se toma todas nuestras muestras de 7.5 mm, que es la
distancia focal de la sonda Raman. Mostramos 20 a 50 zonas de los mapas que se presentan sólo
56
para mostrar el comportamiento de todos los datos que fueron recopilados. La Figura 31 muestra
la malla utilizada para hacer mapas de la piel, sus dimensiones son de 5 mm x 5 mm, y la
distancia entre los puntos es de 500 micras. Este tipo de asignación nos permite ver los cambios
de las lesiones de la piel, lunares, acné y cicatrices en cualquier parte del área a ser muestreada,
en la figura 32 se muestran los espectros que se van a generar en cada uno de la cuadricula que se
propone para hacer los mapas de la piel.
Figura 31Concepto de cómo se realizaron los mapas.
Figura 32 Esquema de espectros que se encuentran dentro del mapa.
La Figura 32 muestra las variaciones en las diferentes áreas de la malla cuando se construye el
mapa. Con este método de dibujo de la cuadrícula en la muestra, realizada por el sistema de
control de la etapa xy, podemos distinguir el cambio en el área de muestra. Esto permite
57
diferenciar el tejido sano y el tejido con lunares o cicatrices. Las diferencias obtenidas puede ser
debido al colágeno, en el caso de las cicatrices y ligeras variaciones cuando la piel bajo estudio
tiene lunares en la zona de interés; así, estas diferencias dependen del tamaño y el color del
lunar.
Los mapas que se muestran en este trabajo se presentan cambios en el colágeno y la amida II que
se encuentran en zonas cercanas debido a las variaciones en la superficie de la piel. Las mayores
diferencias se encuentran en las líneas espectrales son en 548, 741, 1057, 1119, 1464, 460, 564,
885, 1089, 1173, 1782 cm-1.
Figura 33 muestra el mapa de los espectros Raman en el cual se encontraron diferencias

significativas a 548, 741, 1057, 1119, 1464 cm-1. Esto es debido a que la piel de la palma no tiene
una superficie uniforme para que la razón que tienen variaciones en las líneas espectrales.
Figura 33 Mapa espectros Raman de la palma de la mano.
Figura 34 muestra los espectros Raman tomado del dorso de la mano, lo que fue tomado de un
voluntario en la mano derecha. El comportamiento de estos espectros cuatro es similar a la otra,
que muestra sólo una pequeña variación. En esta imagen se puede ver que las bandas Raman son
del mismo tamaño y ninguna variación significativa se presenta. Encontramos diferencias a 460,
564, 885, 1089, 1173 y 1782 cm-1, estos están relacionados con el colágeno 1 y amida II. Figura
35 muestra un mapa de un área de piel con similares características de las líneas espectrales, el
área de muestra estaba en el medio del dedo medio. Este mapa proporciona información acerca
de algunas variaciones de colágeno en una zona con características similares.
58
Figura 34 Mapa de espectros Raman del dorso de la mano.
Figura 35 Mapa de espectros de Raman de la piel con similares características.
Figura 35 muestra el espectro Raman obtenido al hacer un mapa de un área cercana a las
cicatrices, los espectros .Diferencias de las líneas espectrales están relacionadas con el colágeno
I. figura 36 muestra el espectro Raman de un área localizada en el dedo meñique, en la que se
59
encuentra el área de muestra 2 lunares, que tienen colores diferentes, los cambios en la
intensidad de los espectros de Raman es mayor cuando se muestra la zona de lunares.
Figura 36 Mapa de espectros Raman de los cambios por las cicatrices.
Figura 37 Mapa de espectros Raman de los cambios por los lunares.
60
De aquí se puede concluir que hay pequeñas variaciones ocasionadas por los lunares y cicatrices
que se tienen en la piel y pueden influenciar el resultado de las mediciones en el espectro Raman
que se desea obtener.
6.3. Imágenes OCT de la piel
En este trabajo se obtuvieron imágenes de OCT en 10 voluntarios con tono de piel diferente. Las
áreas en las que obtuvimos imágenes oct fueron en la uña del dedo índice, el espacio entre el
dedo índice y el dedo medio, yema del dedo medio, la mitad del dedo medio, la yema del dedo
pulgar y el espacio entre el dedo índice y el dedo pulgar fueron medidos para mostrar la
estructura superficial de las áreas que contienen los fluidos extracelulares con triglicéridos,
colesterol y glucosa que se reportan en la literatura. Usamos un OCT con 930 nm de longitud de
onda central, 1.6 mm de profundidad de la imagen, 6 mm de ancho y 6.2 µm de resolución axial.
La figura 38 muestra el color de piel de los voluntarios que participaron en este experimento.
Como se puede observar el color de piel es distinto en cada uno de ellos. Para este experimento
solo se consiguieron 3 mujeres (V3, V6 y V9). En la figura 39 se muestra las imágenes de los
voluntarios V10, V6, V9 y V4, las imágenes comparan todas las regiones que se están analizando
en este experimento. Área a) corresponde a la uña del dedo índice, b) corresponde a entre el dedo
índice y el dedo medio, c) corresponde a la yema del dedo medio, d) es un medio de dedo medio,
f) es la yema del dedo pulgar y finalmente g) corresponde a entre el dedo índice y el dedo pulgar.
Figura 38 Se muestran los diferentes colores de piel de los voluntarios para este experimento.
La figura 40 muestra las 6 áreas que se proponen mediante tomografía óptica coherente, estas
imágenes corresponden a los voluntarios V9 y V4. Esta figura muestra las diferencias
topográficas entre los voluntarios que tienes, sólo estar de acuerdo en cómo el c) y f).
61
Las figuras 41 y 42 muestran las imágenes OCT de cada uno de los voluntarios en las 6 áreas
propuestas para este experimento.
La figura 43 muestra la imagen OCT del voluntario 3(V3) en el cual se muestran que se puede
sacar la transformada de Fourier para determinar los cambios que van sucintándose conforme la
profundidad de penetración es más grande.
Figura 39 Imágenes de cuatro voluntarios dos mujeres (V6 y V9) y dos hombres.
Figura 40 Se muestras las imágenes OCT de dos voluntarios de todas las áreas que se están midiendo en este experimento.
62
Figura 41 Imágenes OCT del voluntario 1 al 5 se muestran todas las áreas donde se midió.
Figura 42 Imágenes OCT del voluntario 6 al 10 se muestran todas las áreas donde se midió.
Figura 43 Imagen OCT (arriba) y (abajo) la transformada de Fourier del área señalada con la flecha.
63
De este experimento se pueden ver las variaciones ocasionadas por esparcimiento que se tienen
en las áreas seleccionadas y donde la literatura dice que se tienen más líquidos intersticiales, que
es lo que se anda buscando en esta tesis. En base a estas imágenes se tiene muchas buenas
expectativas para obtener buena calidad de los espectros para poder identificar, algunos lípidos y
glucosa.
6.4. Efectos del colágeno en el espectro Raman
Otro de los factores a considerar en este trabajo es la humectación de la piel. Para mostrarlo se
buscaron las líneas espectrales del colágeno y se realizó un experimento donde se solicitaron
voluntarios. Aquí se muestran los resultados encontrado en 10 voluntarios, haciendo una
comparación en 5 bandas espectrales a 507, 937, 1330,1345 y 1635 cm-1. La figuras 44-47
muestran las bandas antes mencionadas, las cuales se hicieron resaltar sobreponiendo un cuadro
sobre la localización de cada una de las bandas. Los cambios entre voluntarios son bastante
notorios, principalmente en la banda localizada a 1635 cm-1.
Figura 44 Se muestras los cambios del colágeno a 507 cm-1.
64
Figura 45 Se muestra las variaciones del colágeno a 937 cm -1.
Figura 46Se muestran las variaciones espectrales de dos bandas del colágeno (1330 y 1345 cm-1).
65
Figura 47 Se muestra la línea espectral más intensa relacionada con el colágeno, la cual se encuentra en 1635 cm -1.
Como se había mencionado anteriormente la mayor diferencia se encontraron en la banda a

1635 cm-1. Esto se debe a que esta banda muestra las diferencias en el contenido de colágeno de
cada persona. Este experimento sirvió para mostrar que cuando se quiere hacer un diagnóstico
bastante preciso se tiene que tomar que considerar el factor de humectación en el área donde se
están midiendo los espectros Raman.
6.5. Efectos del tipo de sangre en el diagnostico
Existe un considerable interés en el avance de la ciencia y la tecnología de análisis

espectroscópico de tejido humano, ya sea cualitativa y cuantitativa o in vitro e in vivo.
Espectroscopia Raman se ha utilizado para analizar las estructuras de hemo y la hemoglobina en
la sangre [29], para comparar los efectos de longitud de onda en la sangre entera y oxi-
hemoglobina [83], para analizar los eritrocitos oxigenada y desoxigenada [84], y para analizar
los tintes coloreados como parte de una mancha en fibras y otras superficies [85]. Un tipo de
sangre (también llamado un grupo sanguíneo) es una clasificación de la sangre basándose en la
presencia o ausencia de sustancias antigénicas heredados en la superficie de los glóbulos rojos
(GR). Estos antígenos pueden ser proteínas, carbohidratos, glucoproteínas o glucolípidos,
dependiendo del sistema de grupo sanguíneo. Algunos de estos antígenos también están
presentes en la superficie de otros tipos de células de diversos tejidos. Los hispanos son el grupo
más propenso a tener sangre tipo O. Se ha informado de que el 71 % de los donantes de sangre
en México son de tipo O, 54 % de los donantes de sangre en Venezuela, y el 62 % en Guatemala
66
son los donantes de sangre de tipo O6. Se muestra en la tabla 6, la distribución del tipo de sangre
hispana. Esto demuestra que la mayoría de los hispanos son O +.
Tabla 6 Se muestran la distribución del tipo de sangre en la población hispana.
Tipo de sangre Población
O+ 53%
O- 4%
A+ 29%
A- 2%
B+ 9%
B- 1%
AB + 2%
AB - 0.2%
En este experimento, se realizó con 15 voluntarios. La complicación principal fue que el tipo de
sangre de la región geográfica en la que encontramos la mayoría de las personas tienen tipo O+.
Sólo encontramos 3 tipo de sangre diferente en todos los voluntarios, O+, O-y B-, con esta
pequeña población no podemos llegar a una conclusión estadística de la variación de glucosa,
colesterol y triglicéridos en función del tipo de sangre. Por esta razón, se tuvo en cuenta sólo 8
muestras y se midió la variación entre el mismo grupo sanguíneo tipo de muestras y la muestra
S6 tipo B-.
En este trabajo, utilizamos el análisis de componentes principales (PCA del acrónimo en inglés,
principal component analysis) para determinar todas las variantes de nuestras muestras. PCA
busca la proyección según la cual los datos queden mejor representados en términos de mínimos
cuadrados. El PCA se emplea sobre todo en análisis exploratorio de datos y para construir
modelos predictivos. El PCA comporta el cálculo de la descomposición en auto-valores de la
matriz de covarianza, normalmente tras centrar los datos en la media de cada atributo. PCA
construye una transformación lineal que escoge un nuevo sistema de coordenadas para el
conjunto original de datos en el cual la varianza de mayor tamaño del conjunto de datos es
capturada en el primer eje (llamado el Primer Componente Principal), la segunda varianza más
grande es el segundo eje, y así sucesivamente. Para construir esta transformación lineal debe
construirse primero la matriz de covarianza o matriz de coeficientes de correlación. Debido a la
6
www.hispanicblood.com.
67
simetría de esta matriz existe una base completa de vectores propios de la misma. La
transformación que lleva de las antiguas coordenadas a las coordenadas de la nueva base es
precisamente la transformación lineal necesaria para reducir la dimensionalidad de datos.
Además las coordenadas en la nueva base dan la composición en factores subyacentes de los
datos iniciales. Una de las ventajas del PCA para reducir la dimensionalidad de un grupo de
datos, es que retiene aquellas características del conjunto de datos que contribuyen más a su
varianza, manteniendo un orden de bajo nivel de los componentes principales e ignorando los de
alto nivel. El objetivo es que esos componentes de bajo orden a veces contienen el aspecto "más
importante" de esa información [59,86].
El protocolo se utilizó para este estudio fue la siguiente. Le pedimos voluntarios para asistir con
el estómago vacío temprano para evitar la influencia de los alimentos con alto contenido de
sacarosa. Tomando cada muestra con lancetas usadas en glucómetros comerciales. Se extrajo una
gota de sangre, que se colocó sobre una hoja de cubierta 150 micras de grosor. Una de las
consideraciones realizadas para este trabajo es tener una gota de sangre lo suficientemente gruesa
como para evitar la influencia del vidrio debido a la profundidad de penetración de la fuente de
excitación. Esta consideración debido a la fluorescencia causada por vidrio se sobrepone a todas
las líneas espectrales que necesitamos que estén en el rango de 1000 a 1800 cm-1.
La Figura 48 muestra una comparación visual de las 8 muestras. En él se destacan dos bandas
espectrales de hemoglobina y dos líneas relacionadas con la fibrina pura. Estas bandas se
destacan por ser de gran importancia en los espectros Raman de sangre previamente reportado en
la literatura [87].
Figura 48 Se muestran las bandas de hemoglobina (grises) y las de fibrina (amarillo) de los voluntarios con O+.
68
Para mostrar todas las variaciones de los espectros Raman de las 8 muestras diferentes, se
normalizaron todos los espectros a 1002 cm-1. La figura 49 muestra las variaciones cuando se
hace la normalización anteriormente mencionada.
4
S1
S2
3.5
S3
S4
3 S5
Relative Intensity (U.A)
S6
2.5 S7
S8
2
1.5
0.5
0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
-1
Raman shift (cm )
Figura 49 Se muestran las variaciones de estos espectros normalizados a 1002 cm-1.
La Figura 50 muestra la distribución y la varianza de las muestras usando el primer componente

principal y segundo.
0.6
S2
0.5 S3
0.4
S1
2nd Principal Component
0.3
0.2
0.1
0
S4
-0.1
S6
-0.2
-0.3 S7 S8 S5
-0.4
0.24 0.26 0.28 0.3 0.32 0.34 0.36 0.38 0.4 0.42
1st Principal Component
Figura 50 Se muestra las distribución de la muestras usando la componente principal 1 y la 2.
Utilizamos biplot para ayudar a la visualización de ambos, los coeficientes de los componentes
principales para cada variable y las puntuaciones (scores) de los componentes principales para
cada observación en una sola gráfica. Biplot también permite la visualización de la magnitud y el
signo de la contribución de cada variable a los dos o tres primeros componentes principales, y
cómo cada observación se representa en términos de aquellos componentes [88].
69
La Figura 51 muestra cada uno de los ocho variables, representadas en este diagrama por un
vector. La dirección y la longitud del vector indican cómo cada variable contribuye a los
principales componentes segundo y tercero en la gráfica.
S2
0.6
0.4
S6
0.2 S5
Component 3
S8
0
-0.2 S1
S7
-0.4 S4 S3
-0.6
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6

Component 2
Figura 51 Se muestra una gráfica Biplot donde se ilustran las contribuciones de cada una de las variables.
Lo mostrado en las gráficas quiere decir que hay una influencia del tipo de sangre en los
espectros, para corroborarlo se tendría que hacer más pruebas para tener una muestra estadística
más grande.
6.6. Simulaciones con tejido sintético
La fabricación de tejidos sintéticos de material polimérico es relativamente nueva, debido a que

ofrecen la posibilidad de ser fabricado en un corto período de tiempo. Su diseño no es complejo
y el costo de producción es bajo. Además, su alta transparencia, eficiencia y nula toxicidad [89],
los hacen ideales en aplicaciones de óptica biomédica [90]. Recientemente, uno de los más
activos materiales poliméricos elásticos de gran interés debido a las expectativas del mercado y
las aplicaciones en la literatura es el polidimetilsiloxano PDMS Sylgar 184 [91].
Las propiedades ópticas mostradas por tejidos sintéticos dependen de su método físico-químicas
y fabricación empleado. Es importante entender estos procesos son para producir espectros
sintéticos con propiedades ópticas similares a la piel humana. El proceso de fabricación de los
tejidos sintéticos se pueden variar, algunos de ellos implican método sol-gel, la hidrólisis y otros
usos policondensación [92]. La concentración de los componentes se puede modificar para
obtener una mezcla de ellos; usando diferentes tiempos y temperaturas de curado [93] de manera
que en combinación específica de estos parámetros en el proceso de fabricación, se puede
producir tejidos sintéticos con propiedades específicas.
70
En esta sección se propuso un método alternativo, simple y barato para producir tejidos sintéticos
de PDMS, con elementos difusores y absorbentes (con tinta, la melanina, cholesteryl (colesterol
sintético), Gliceryl (triglicéridos sintéticos)) y la caracterización física-química que exhiben
relevancia para su uso, que se determinar si son viables para la comparación óptica de
propiedades en la piel humana.
El proceso de fabricación de tejidos sintéticos basados en PDMS bajo la metodología propuesta

se debe directamente al curado fácil y manipulación de materiales. Los tejidos sintéticos
desarrollados tienen un grosor de entre 0.1 a 2 mm, y 2 a 5 cm de diámetro. El material utilizado
es PDMS Sylgard 184 comprado en Dawn Corning.
La metodología desarrollada para la fabricación consta de 4 pasos: Paso 1. Para medir los
componentes en proporción 10:1 (base: endurecedor) para el PDMS y una cantidad del 10 %
para los extras, como componentes de la tinta, Cholesteryl, Gliceryl y la melanina. Paso 2. Para
mezclar los componentes se hace una agitación manual hasta que se obtuvo una mezcla bien de
ellos (para lo cual se utilizó un vaso). Paso 3. Para eliminar burbujas de aire en la mezcla se usa
una cámara ultrasónica durante 5 minutos. Paso 4. Se vierte la mezcla en una superficie de vidrio
plana previamente limpiada con alcohol isopropílico.
Los tejidos sintéticos fueron curados dentro de una campana de flujo laminar en una posición
horizontal durante siete días a temperatura ambiente (25 °C). La campana de flujo laminar
(Labconco 36212-04) evita la contaminación por partículas sólidas (campana de flujo laminar es
de tipo 2).
La figura 52 muestra la metodología que se siguió para realizar estos tejidos sintéticos.
Figura 52 Metodología de fabricación de tejidos sintéticos de PDMS (a) medición de los componentes, (b) mezclar los
componentes, (c) extracción de burbujas en la cámara sónica y (d) verter de mezcla en un recipiente para la generación
del tejido sintético de PDMS.
71
Se fabricaron Seis tejidos sintéticos de PDMS mediante la adición de los diferentes componentes
presentes en la piel humana, tales como, la melanina, el colesterol, Gliceryl, Cholesteryl. La tinta
se utiliza como elemento absorbente. La Tabla 7 muestra la distribución y concentración de cada
uno de los componentes usados para preparar los 6 tejidos sintéticos PDMS. Las seis muestras se
fabricaron y se curaron bajo las mismas circunstancias, es decir, curado a temperatura ambiente
(25 °C) durante un período de siete días, y el uso de una campana de flujo laminar.
Tabla 7 Muestra las concentraciones de los tejidos sintéticos que se fabricaron.
# de Tejido
PDMS Tinta Melanina Cholesteryl Gliceryl
sintético
1 98% ----- 1% 1%
2 98% ----- 1% 1%
3 97% 1% 1% 1%
4 97% 1% 1% 1%
5 94% 5% 1%
6 94% 5% 1%
En la figura 53 se muestra el espectro Raman de 4 de los componentes que se mezclan en los

Tejidos sintéticos realizados, en el caso de la melanina se nota en la figura que se tiene mucha
fluorescencia y pocas bandas Raman.
Figura 53 Se muestra el espectro Raman de los componentes utilizados para realizar los tejidos sintéticos
72
En la figura 54 se muestra el perfil de 3 de lostejidos sintéticosusando un perfilómetro Wyko

Model NT profilers series of Veeco, en las figuras se muestran en el eje x el movimiento lateral
del perfilómetro y en el eje y se muestra el cambio del perfil todo esto en mm.
Figura 54 Perfil Y de 3 tejidos sintéticos. (a) tejido sintético 2, (b) tejido sintético 4 y (c) tejido sintético 6.
En la figura 55 se muestra el espectro Raman del tejido sintético1 y 2 como se puede ver en la
tabla 7 los dos tienen alto contenido de PDMS y el espectro se puede ver que las bandas más
representativas son ocasionadas por el PDMS.
Figura 55 Espectro Raman del phantom 1 y 2.
Para los demás espectros se tomó medidas en diferentes lugares [94] para determinar la
homogeneidad del tejido sintético a lo largo de todas sus dimensiones, la figura 56 muestra estas
73
mediciones. El tejido sintético 3 tiene variaciones en las zonas 2 y 5 que se deben a variaciones
en las mezclas propuestas, para los demás tejidos sintéticos este problema no fue encontrado.
Figura 56 Espectros Raman del tejido sintético 3(F3), tejido sintético 4(F4), tejido sintético 5(F5) y tejido sintético 6(F6).
Como se puede observar en estos resultados se encontró una técnica de fabricación que permite
la homogeneidad del tejido sintético a lo largo de todas sus dimensiones, el aumento de las
concentraciones de los compuestos de la piel daría mejores resultados, pero esto no se logró
hacer por la falta de presupuesto.
6.7. Espectros Raman de fluidos intersticiales
En esta sección se presentan los resultados en la obtención de espectros de la piel en las regiones
que reporta la literatura [34,95], para este experimento se tomaron espectros en medio del pulgar
y el dedo índice. También se tomaron espectros en la yema del dedo índice debido a su alta
vascularidad. Se presentan resultados de 9 voluntarios. Todos los espectros que se muestran se
les han removido el ruido y sustraído la fluorescencia, por tal motivo no tenemos influencia en su
74
color de piel en los resultados que se están presentando. Los espectros fueron divididos en 4
secciones de 176 puntos cada uno, para una mejor visualización de las bandas Raman de cada
uno de los compuestos que resaltaremos. La figura 57 muestra lo mencionado anteriormente,
pero se pueden visualizar las bandas mejor.
400 400
Intensidad (U.A)
Intensidad (U.A)
200 200
0 0
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
-1 -1
Desplazamiento Raman (cm ) Desplazamiento Raman (cm )
400 400
Intensidad (U.A)
Intensidad (U.A)
200 200
0 0
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
-1 -1
Desplazamiento Raman (cm ) Desplazamiento Raman (cm )
Figura 57 Espectros Raman de fluidos intersticiales
En la figura 58 se muestran todos los espectros obtenidos y se generaron usando una serie de
lorenzianas 3 bandas de colesterol (1433,1658 y 1739 cm-1), 4 bandas de glucosa (1065,1126,
1365 y 1456 cm-1) y 3 bandas de triglicéridos (1081, 1256 y 1437 cm-1) para comparar su
localización en el espectro Raman. Las figuras 59-61 muestran los espectros Rama de los fluidos
intersticiales y resalta un solo compuesto (colesterol, glucosa y triglicéridos).
Como se puede ver en las gráficas las bandas que se tratan de resaltar se ajustan con la lineal
espectral reportada en la literatura, por lo tanto si se tiene una muestra controlada y con variación
de los compuestos que se proponen identificar en esta tesis la realización sería posible.
75
500
muestras
450 glucosa
colesterol
400 trigliceridos
350
Intensidad (U.A)
300
250
200
150
100
50
0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
-1
Desplazamiento Raman(cm )
Figura 58 Espectros Raman de fluidos intersticiales, en donde se muestran 3 bandas importantes de glucosa, colesterol y
triglicéridos.
500
muestras
450 colesterol
400
350
Intensidad (U.A)
300
250
200
150
100
50
0
1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800
-1
Figura 59 Espectros Raman de fluidos intersticiales y colesterol.
76
500
muestras
450 glucosa
400
350
Intensidad (U.A)
300
250
200
150
100
50
0
1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500
-1
Figura 60 Espectros Raman de fluidos intersticiales y glucosa.
500
muestras
450 trigliceridos
400
350
Intensidad (U.A)
300
250
200
150
100
50
0
1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800
-1
Figura 61 Espectros Raman de fluidos intersticiales y triglicéridos.
77
6.8. Diferentes geometrías de puntas de prueba Raman
A lo largo de este trabajo de tesis y toda la literatura leída para el desarrollo de los experimentos
que se han realizado, se ha notado que lo más importante en el experimento es la punta de
prueba, mientras mejor sea el sistema de colección es decir la punta de prueba Raman será mejor
la calidad de la señal que se va obtener, pero no se está inventando el hilo negro con esta
deducción. Por tal motivo se hizo una estancia en la universidad de Michigan en el laboratorio
del Dr. Michael D. Morris 7 para hacer un diseño de una punta de prueba Raman de
desplazamiento espacial o mejor conocida como SORS (del acrónimo en inglés Spatially offset
Raman spectroscopy). Porque elegir esta universidad, esto fue debido a que en el laboratorio
Morris se desarrolló la primera punta de prueba con iluminación circular para hacer
desplazamiento espacial en 2006, la cual utilizaron para medir el hueso sin necesidad de cortar
[96]. La ventaja de hacer una punta de prueba de este tipo es que se puede medir a mayor
profundidad que con el Raman convencional. Una medición SORS hará por lo menos dos
mediciones Raman, uno en la superficie y uno en una posición desplazada de típicamente unos
pocos milímetros de distancia. Los dos espectros se pueden restar usando una escala de
sustracción para producir dos espectros que representan los espectros del subsuelo y de
superficie. Para un simple sistema de dos capas, tal como polvo en una botella de plástico, el
espectro de polvo se puede medir sin conocer el material de la botella o de su contribución
relativa de la señal. Para hacer esto sin usar una medición compensada se vería seriamente
limitada por el ruido de disparo generados por las señales Raman y de fluorescencia que se
originan en la capa superficial.
La sustracción escalada funciona bien para sistemas de dos capas pero los ejemplos más
complicados, tales como donde el material contiene varios componentes incluidos en la sub-capa
(por ejemplo, tejido vivo), puede requerir análisis multivariado. Tal como la técnica
multivariada, de análisis de componentes principales se utilizan, en la cual, es necesario tomar
varios espectros a distintas distancias de desplazamiento. A medida que aumenta la relación de
espacial offset los aumentos contribución de sub-superficie/superficie espectrales. Sin embargo,
el total de la señal también disminuye con el aumento de compensación, por lo que la relación no
se puede aumentar indefinidamente en una medición práctica [97].
Para el desarrollo de esta punta de prueba se hizo la propuesta de hacer gelatinas usando una
sustancia de alto esparcimiento y dentro un polímero en el cual se iba hacer pasar glucosa,
lípidos o cualquier otra sustancia. El polímero seleccionado fue tubos de silicona, esto es debido
a que sus bandas no interfieren con las bandas del espectro de la glucosa sólida.
Considerando todo lo anterior mencionado se decidió hacer en el diseño en dos etapas, la primera
que consiste en hacer simulaciones usando el software NIRFAST y la segunda etapa haciendo
7
Advanced Raman Microscopy & Chemical Imaging Lab
78
experimentos con gelatinas para verificar si lo simulado daba resultados correctos. El problema
fue que cuando la glucosa pasa de solida a liquida su señal espectral cambia radicalmente la
figura 62 muestra como es el cambio, esto es debido a que su estructura molecular sufre un
cambio al pasar de solido a líquido.
Figura 62 (derecha) Espectro Raman de la glucosa Solida y (izquierda) espectro Raman de la glucosa liquida.
Teniendo en cuenta todo este problema se decidió hacer la punta de prueba solo tomando en
cuenta la señal espectral del tubo de silicona, la cual tiene una banda muy bien definida la cual se
muestra en la figura 63.
Silicone band
18000
data1
16000 data2
data3
14000
data4
Relative Intensity (counts)
12000 data5
data6
10000 data7
data8
8000 data9
data10
6000
4000
2000
0
670 680 690 700 710 720 730 740 750
Raman shift(cm-1)
Figura 63 Espectro Raman de la banda más representativa de la silicona.
79
6.8.1. Simulaciones usando NIRFAST
Para hacer las simulaciones se generó en NIRFAST una malla en una forma cilíndrica con una
altura de 10 mm y 64 mm de ancho malla. Se trató de hacer este cilindro del tamaño del
contenedor pero cuando se aumenta más las dimensiones del cilindro este la distancia entre
nodos se vuelve más grande y se pierde resolución, la distancia entre los nodos que se generó es
de 0.5 mm lo cual es aceptable ya que lo reportado en la literatura la distancia mínima que se
muestra es de 1 mm [98]. La malla contiene 98, 270 nodos correspondientes a 511.151 elementos
tetraédricos lineales. El cilindro que se genera se muestra en la figura 64. El modelo fue
realizado para todas las fuentes posibles estando colocadas a la distancia del recorrido libre
medio, esto es considerando la penetración de la luz, este modelo tiene 72 fuentes. La selección
de este número está relacionada con la montura que se tenía en el laboratorio. Los detectores
están colocados sobre la superficie de la malla y de igual manera se consideran 72 posibles
posiciones de los detectores. Se utilizó la solución directa para cada una de las fuentes. Para
obtener la eficiencia de cada una de las fuentes se multiplica por cada uno de los detectores.
Luego se suma la eficiencia ocasionada por cada por la región de interés o sobre todo el modelo.
Figura 64 Cilindro generado para realizar simulación. En este cilindro se muestran 3 capas pero solo se utilizaron dos.
80
Se consideraron tres diferentes capas fueron considerados. El primero es la coeficiente de

esparcimiento de la piel, para este modelo se utilizan tres coeficiente de esparcimiento de
diferentes descritos en la literatura [99–107]. Utilizamos 0.7, 1.9, 3.5 mm-1 con un coeficiente de
absorción de 0.012 mm-1 y 3 diferentes profundidades, 1, 2 y 3 mm. Para el modelo de absorción
utilizado las mismas profundidades, coeficiente de esparcimiento de 3.5 mm-1 y coeficientes de
absorción de 0.012, 0.042 y 0.082 mm-1 y n= 1.39 [108]. En la segunda capa se utilizan los
parámetros de tubo de silicona ópticos, µs= 0.1 mm-1; µa= 0.0001 mm-1 y n= 1.4. Para la tercera
capa se utilizaron las propiedades ópticas de la glucosa µs= 0.01 mm-1; µa= 0.0001 mm-1 and
n=1.34 [109].
Figura 65 Se muestra la variación del coeficiente de esparcimiento y absorción con respecto a la profundidad. (Izquierda)
variación del coeficiente de absorción (0.012, 0.042 and 0.082 mm-1) con un coeficiente de esparcimiento de 3.5 mm-1.
(Derecha) variación del coeficiente de esparcimiento con respecto a la profundidad (0.7, 1.9 and 3.5 mm-1) coeficiente de
absorción de 0.012 mm-1.
La figura 66 muestra los modelos de absorción y esparcimiento para los parámetros antes
mencionados, en esta figura se tiene las fuentes en distintas posiciones, en eje, +2.5 y +5 mm. En
las fuentes que están fuera de la posición de la fuente del valor de esparcimiento es más alto a
1 mm de profundidad es más eficiente que el otro en la misma profundidad. La razón de ello es el
desplazamiento espacial. Como se detalla en la figura (+ 2.5 mm), que muestra que tenemos más
eficiencia a lo largo del tubo de silicona. Cuando la fuente es +5 mm del eje la eficiencia global
disminuye y se muestra que no es una buena opción para la selección de la geometría adecuada.
En la figura 67 se muestra el modelo para una las fuentes en eje, +2.5 y +5 mm y un solo
coeficiente de esparcimiento. Las geometrías mostradas son la configuración más eficiente para
esa posición de las fuentes mencionadas.
81
Figura 66 Modelos de absorción (izquierda) y (derecha) esparcimiento. También la fuente en distintas posiciones (parte
superior) de origen en 2.5 mm ejes, (centro) y origen mm (abajo) Fuente de +5 mm.
82
Figura 67 Se muestra las configuraciones más eficientes teniendo la fuente de iluminación en eje a +2.5 y 5 mm, a una
profundidad de 1 mm.
Para comparar el rendimiento de las configuraciones más eficientes se propusieron nueves

geometrías adicionales a las mostradas anteriormente. Hay que aclarar que solo se evaluaran la
fuente sobre el eje que es la que muestra mayor eficiencia en lo mostrado en la figura 67. Las
geometrías propuestas se pueden ver en la figura 68.
83
Figura 68 Se muestran las geometrías propuestas para ser comparadas con la de mayor eficiencia. Esta comparación se
hará de manera experimental.
6.8.2. Evaluación experimental de las puntas de prueba Raman
Para la sección experimental, se utilizó tejidos sintéticos con coeficiente de esparcimiento de

3.0 mm-1, con distancia distinta entre el borde de la gelatina y el tubo de silicona. Para tener un
índice de refracción constante se midió con agua y glucosa en el tubo. Además, fuera del tubo de
gelatina se midió para tener sólo el espectro de la gelatina. Para este experimento, se utilizó una
punta de prueba de 10 ramas, lo que hace que sea flexible y fácil de implementar distintas
configuraciones propuestas en la simulación. Cada una de las ramas contiene 5 fibras, así un total
84
de 50 fibras. Sin embargo, sólo 40 funcionaban apropiadamente, una de las ramas funcionaban
sólo 2 y otra de ellas sólo 3. Tres de las ramas trabajaban correctamente todas las fibras en él.
Las otras cinco ramas solo operan correctamente cuatro fibras. La Figura 69 muestra la imagen
espectral de las ramas 10 y la Figura 70 muestra espectros espacial de cada rama. La figura 71,
ilustra el esquema del experimento, las ramas de fibra, tejido sintético de gelatina y el tamaño del
tubo de silicona.
Figura 69 Se muestra la imagen espectral de las fibras 50 de las diez ramas diferentes, el orden es rama 1 en inferior y 10
en la parte superior. Esta imagen muestra el perfil espectral de fibras iluminado por una fuente de luz blanca.
Figura 70 Se muestran los diferentes perfiles espaciales de las ramas de fibras que se utilizan para este experimento.
85
Figura 71 En esta figura se muestra la distancia entre el borde del contenedor y gelatina. La figura de la parte superior
derecha muestra la montura utilizada para probar las configuraciones propuestas y las ramas de fibra. La figura de la
gelatina con el tubo de silicona y las dimensiones del tubo de silicona se muestran en la parte inferior.
Cuando empezamos este experimento, no se veía cómo la punta de cada rama se ve. En la figura
72 se muestra las 10 ramas de fibra, como se puede observar después de experimento realizado
con el tejido sintético estuvo en contacto con la gelatina, ocasionando que se tuviera gelatina en
las puntas de las fibras. Debido a eso utilizamos metanol para limpiar cada extremo de la fibra y
la se mejoró la señal Raman que se colecto después de medir los tejidos sintéticos. Por lo anterior
mencionado las ramas de fibra se deben limpiar cada vez que el experimento se lleva a cabo. La
figura 72 muestra las fibras sucias y limpias, como se puede ver como limpiando las ramas con
metanol se puede quitar toda la gelatina que estaba atrapado allí. Sin embargo, las ralladuras
todavía siguen allí, para resolver el problema de las puntas de fibra necesitan ser pulidas.
La figura 73 muestra los tejidos sintéticos líquidos y sólidos hechos para probar las distintas
geometrías propuestas para comparar la eficiencia de cada una de las configuraciones.
86
Figura 72 Se muestra fibras antes y después de la limpieza con metanol.
Figura 73 (Izquierda) Muestra el tejido sintético hecho con gelatina utilizando intralípido II. (Centro) Tejido sintético
liquido hecho con agua e intralípido II, y (derecha) se muestra el montaje experimental para medir el espectro de la fibra
usando luz blanca.
Para realizar la corrección de intensidad normalmente se utiliza luz blanca y se toma el promedio
de las contribuciones de todas las fibras. Esto funciona muy bien cuando se tiene un sistema
acoplado en una sola punta de prueba, pero cuando se tienen diferentes ramas y no todas las
87
ramas le funciona la misma cantidad de fibras eso ocasiona problemas en el espectro final que se
va a procesar. En la figura 70 se muestran las contribuciones por cada una de las ramas que se
utilizaron para este experimento, se puede ver que las contribuciones no son proporcionales por
tal motivo se implementó una corrección de intensidad asignándole pesos a cada una de las
ramas. Se calculó la desviación estándar de cada rama de la fibra y se normaliza cada rama. En
lugar de cada rama fibra tienen la misma contribución ahora cada rama tiene diferente, que
llamamos peso de cada rama. Corrección de intensidad se ve afectada de la forma que se toma
espectro de las fibras con luz blanca. Las fibras en posición diferente, la punta de doblada y sucia
son las cuestiones principales que deben tenerse en cuenta cuando este espectro es tomado. En la
figura 74 se muestra cual es el efecto de no prestar atención a lo anterior mencionado. Se ilustra
a la izquierda una medición sin considerar los factores anteriores y a la derecha considerando
todos los detalles mencionados.
Figura 74 Se muestra el perfil de intensidad de del espectro de la fibra iluminando con luz blanca de cada rama.
(Izquierda), el primer conjunto de datos que se tomaron y (derecha) los que se tomaron de forma sistemática del perfil de
intensidad.
Después de hacer las correcciones de intensidad se obtuvieron las figuras para todas las
configuraciones propuestas están son mostradas en la figura 75. Para calcular las intensidades
mostradas en la posición de cada detector es la suma de la banda de silicona que van desde 665
hasta 729 cm-1. Los números mostrados a lado de cada uno del detector es el número de rama
colocado en esa posición. La figura 65 muestra las configuraciones del 1 al 5 en la izquierda y
del 6 al 10 a la derecha.
88
Figura 75 Graficas obtenidas en el experimento.
89
Para determinar cuál de las configuraciones tiene la mayor colección se hizo la suma global de
todos los detectores de las configuraciones propuestas, en la tabla 8 se muestra estos valores. La
figura 76 muestra las variaciones de cada una de las configuraciones. En la figura 77 se muestran
las configuraciones con mejor eficiencia al ser probadas de forma experimental.
Tabla 8 Se muestra la eficiencia total de cada una de las configuraciones propuestas.
Numero de configuración Cuentas totales
Configuración 1 154030
5
x 10
1.9
1.8
1.7
Total counts
1.6
1.5
1.4
1.3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Configuration Number
Figura 76 Se muestra la gráfica de las variaciones de cada una de las configuraciones.
90
Figura 77 Se muestran las cuatro configuraciones con la mejor eficiencia en las pruebas experimentales realizadas.
Los algoritmos desarrollados para esta tesis se pueden consultar en el apéndice C.
91
Capítulo 7 Conclusiones y trabajo a futuro
Capitulo 7. Conclusiones y trabajo a futuro
En esta tesis se han presentados los diversos problemas que se tiene que resolver para la
obtención de espectros Raman en fluidos intersticiales.
Se desarrolló un Método de procesado para reducir la cantidad de ruido de disparo que se

obtenían en el espectro Raman, este método está basado en la utilización de wavelets de tipo
Symlet. Otro de los problemas que se tenían en el espectro Raman de tejidos biológicos es la alta
fluorescencia para la cual se implementó el método MimMax, el cual funciona bastante bien en
espectros Raman que tienen la fluorescencia de forma gaussiana como es el caso de los que se
obtuvieron para esta tesis.
Análisis de la influencia del color de la piel en las mediciones del espectro Raman. En los
primeros meses del doctorado se realizaron mediciones en voluntarios de distintas tonalidades de
piel, en la cual se encontraron las variaciones causadas por la melanina, la cual afecta
directamente la fluorescencia de fondo en el espectro Raman de la piel.
Visualización del área donde se mide el espectro Raman usando Tomografía óptica coherente
(OCT). Una de las inquietudes que se tienen cuando se realizan mediciones en el espectro Raman
en la piel, es como se observa el área de la piel que se toma como muestra, para resolver ese
problema se realizaron mediciones en distintas áreas de la mano donde se pretendía medir para la
obtención de espectros Raman. Estas imágenes en OCT mostraron los cambios superficiales que
presenta la piel en las regiones donde es iluminada por el láser, lo cual nos llevó a concluir que
se necesita hacer un mapeo del área para obtener mejores resultados en nuestros espectros
Raman.
Implementación del método de mapeo punto a punto, para hacer mapas espectrales de la piel.
Debido a los resultados obtenidos con las imágenes en OCT, se diseñó y fabricó una montura XY
controlada por computadora usando LabVIEW. Esta nos permite hacer mapas con una resolución
de 200 micras punto a punto.
Se desarrolló y caracterizaron simuladores de tejido sintético con base de Polidimetilsiloxano

(PDMS) mezclado con lípidos sintéticos, glucosa y melanina sintética. Los resultados
encontrados en este trabajo revelaron que se tienen que tener simuladores de mayor espesor para
evitar que el espectro Raman que se están tomando no sea del material que está debajo del tejido
sintético.
Se hizo un estudio del efecto del colágeno en la obtención de espectros Raman, en el cual se
encontró que se obtienen cambios dependiendo de la humectación de los individuos a los cuales
se les toma el espectro Raman. Para mostrar estos cambios se resaltaron 4 bandas importantes
92
Capítulo 7: Conclusiones y trabajo a futuro
donde esta reportado en la literatura que se asocian con el colágeno. Encontrándose la diferencia
principal de colágeno en 1635 cm-1.
Estudio sobre el cambio en el espectro Raman ocasionado por los distintos tipos de sangre. Para
este estudio se solicitaron voluntarios con diferentes tipos de sangre, a los cuales se les extrajo
una gota de sangre de la cual se obtuvo su espectro Raman. Se empleó la técnica de análisis de
componentes principales para hacer la clasificación de la influencia del tipo de sangre en la
medición de glucosa. Los resultados obtenidos revelaron que hay variación ocasionada por el
tipo de sangre.
Se obtuvieron espectros Raman de las partes del cuerpo donde se localizan los fluidos
intersticiales. Los resultados encontrados muestran que se puede distinguir en el espectro Raman
las bandas espectrales asociadas con el colesterol, glucosa y triglicéridos. Se tomaron 3 bandas
representativas de cada uno de los componentes que se propusieron encontrar, las cuales se
identifican con mucha claridad en los espectros que se adquirieron en esta tesis.
Estancia de investigación en la Universidad de Michigan en el Morris Laboratory. En esta

estancia se desarrollan simuladores de piel usando gelatina e intralípidos, siendo medidos con
espectrómetros Raman de alta resolución. Además de hacerse la Simulación de puntas de prueba
Raman con diferentes geometrías usando Nirfast (un programa basado en modelado de
elementos finitos para modelar el transporte de luz infrarroja en el tejido), y para ser probadas
con simuladores biológicos con diferentes propiedades ópticas (cambios en coeficientes de
esparcimiento y coeficientes de absorción de la piel reportados en la literatura). Todo lo antes
mencionado con el objetivo de desarrollar una punta de prueba Raman con desplazamiento
espacial, la cual se determinó usando un método de evaluación global del número de cuentas
totales alcanzadas por cada una de las ramas de la punta de prueba.
La espectroscopia Raman tiene demasiadas aplicaciones, en esta tesis solo se abordó la

aplicación en tejidos biológicos, esta técnica también puede ser utilizada para desarrollar
sensores de contaminantes en el agua, aplicación en calidad de polímeros, en semiconductores,
en evaluación de calidad de nanotubos, en la industria petrolera, farmacéutica, en las ciencias
forenses, en los materiales arqueológicos y la determinación de materiales en pinturas artísticas
por mencionar algunas en el amplio campo de la aplicaciones de la espectroscopia Raman.
Trabajo a futuro
Los alcances obtenidos en esta tesis, nos permiten proponer algunos aspectos que podrían ayudar
a la obtención más refinada de los espectros Raman, tales como:
1. La implementación de un sistema de autoenfoque de la punta de prueba considerando un

sistema de inclinación de 45 grados del sensor con respecto de la punta de prueba. Es
necesaria esta inclinación para no tener errores de paralaje o errores de distintas
distancias de la punta de prueba con la muestra y el sensor con la muestra.
93
Capítulo 7 Conclusiones y trabajo a futuro
2. Se requiere de una nueva punta de prueba para mejorar la colección del espectro, es decir
obtener una mayor cantidad de información. Lo cual ayudaría a disminuir el tiempo de
exposición y la potencia con la cual se excita la muestra.
3. Obtener acceso a un banco de sangre con el cual se podría hacer una mayor estadística de
las variaciones de la glucosa influenciada por el tipo de sangre de las personas.
4. Realizar un estudio más detallado sobre la influencia de la hidratación de las personas en
las bandas Raman del espectro obtenido.
5. Desarrollar un sistema de calibración multivariable para la cuantificación de la glucosa en
la sangre y de los lípidos propuestos.
6. Realizar un estudio con sangre con distintas concentraciones de glucosa para optimizar el
método de calibración.
7. Desarrollar tejidos sintéticos con mayor espesor y mayor control de las sustancias que se
están mezclando.
8. Fabricar un sistema de movimiento centrífugo para obtener el espectro de la sangre más
rápido y evitar que la sangre se vea afectada por cambios de temperatura, debido a
tiempos de exposición prolongados.
94
Capítulo 8: Referencias
Capitulo 8. Referencias
[1] D. Stasic, T. J. Farrell, and M. S. Patterson, “The use of spatially resolved fluorescence and reflectance to
determine interface depth in layered fluorophore distributions,” Phys Med Biol48(21), 3459–3474 (2003).
[2] D. Arifler, R. A. Schwarz, S. K. Chang, and R. Richards-Kortum, “Reflectance spectroscopy for diagnosis
of epithelial precancer: model-based analysis of fiber-optic probe designs to resolve spectral information
from epithelium and stroma,” Applied optics44(20), 4291–4305 (2005).
[3] J. Popp, C. Krafft, and T. Mayerhöfer, “Modern Raman spectroscopy for biomedical applications,” Optik &
Photonik6(4), 24–28 (2011) [doi:10.1002/opph.201190383].
[4] C. Kendall, J. Day, J. Hutchings, B. Smith, N. Shepherd, H. Barr, and N. Stone, “Evaluation of Raman probe
for oesophageal cancer diagnostics,” The Analyst135(12), 3038 (2010) [doi:10.1039/c0an00536c].
[5] I. Barman, G. P. Singh, R. R. Dasari, and M. S. Feld, “Turbidity-Corrected Raman Spectroscopy for Blood
Analyte Detection,” Anal. Chem.81(11), 4233–4240 (2009) [doi:10.1021/ac8025509].
[6] N. Stone, R. Baker, K. Rogers, A. W. Parker, and P. Matousek, “Subsurface probing of calcifications with
spatially offset Raman spectroscopy (SORS): future possibilities for the diagnosis of breast cancer,”
Analyst132(9), 899–905 (2007) [doi:10.1039/B705029A].
[7] A. Saha, I. Barman, N. C. Dingari, S. McGee, Z. Volynskaya, L. H. Galindo, W. Liu, D. Plecha, N. Klein, et
al., “Raman spectroscopy: a real-time tool for identifying microcalcifications during stereotactic breast core
needle biopsies,” Biomedical Optics Express2(10), 2792 (2011) [doi:10.1364/BOE.2.002792].
[8] J. Chaiken, W. Finney, P. E. Knudson, R. S. Weinstock, M. Khan, R. J. Bussjager, D. Hagrman, P.
Hagrman, Y. Zhao, et al., “Effect of hemoglobin concentration variation on the accuracy and precision of
glucose analysis using tissue modulated, noninvasive, in vivo Raman spectroscopy of human blood: a small
clinical study,” J Biomed Opt10(3), 031111 (2005) [doi:10.1117/1.1922147].
[9] J. Chaiken, J. Goodisman, B. Deng, R. J. Bussjager, and G. Shaheen, “Simultaneous, noninvasive
observation of elastic scattering, fluorescence and inelastic scattering as a monitor of blood flow and
hematocrit in human fingertip capillary beds,” J Biomed Opt14(5), 050505 (2009) [doi:10.1117/1.3233629].
[10] J. Chaiken, B. Deng, R. J. Bussjager, G. Shaheen, D. Rice, D. Stehlik, and J. Fayos, “Instrument for near
infrared emission spectroscopic probing of human fingertips in vivo,” Rev Sci Instrum81(3), 034301 (2010)
[doi:10.1063/1.3314290].
[11] J. Chaiken and J. Goodisman, “On probing human fingertips in vivo using near-infrared light: model
calculations,” J Biomed Opt15(3), 037007 (2010) [doi:10.1117/1.3431119].
[12] J. Chaiken, B. Deng, J. Goodisman, G. Shaheen, and R. Bussjager, “Glucose and Other Measurements,” in
Applied Industrial Optics: Spectroscopy, Imaging and Metrology, p. AIMD3, Optical Society of America
(2011).
[13] K. E. Shafer-Peltier, C. L. Haynes, M. R. Glucksberg, and R. P. Van Duyne, “Toward a glucose biosensor
based on surface-enhanced Raman scattering,” Journal of the American Chemical Society125(2), 588–593
(2003).
[14] D. A. Stuart, C. R. Yonzon, X. Zhang, O. Lyandres, N. C. Shah, M. R. Glucksberg, J. T. Walsh, and R. P.
Van Duyne, “Glucose sensing using near-infrared surface-enhanced Raman spectroscopy: gold surfaces, 10-
day stability, and improved accuracy,” Analytical chemistry77(13), 4013–4019 (2005).
[15] D. A. Stuart, J. M. Yuen, N. Shah, O. Lyandres, C. R. Yonzon, M. R. Glucksberg, J. T. Walsh, and R. P.
Van Duyne, “In vivo glucose measurement by surface-enhanced Raman spectroscopy,” Analytical
chemistry78(20), 7211–7215 (2006).
[16] O. Lyandres, J. M. Yuen, N. C. Shah, R. P. VanDuyne, J. T. Walsh, and M. R. Glucksberg, “Progress
Toward an In Vivo Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Glucose Sensor,” Diabetes Technol Ther10(4),
257–265 (2008) [doi:10.1089/dia.2007.0288].
[17] J. M. Yuen, N. C. Shah, J. T. Walsh Jr, M. R. Glucksberg, and R. P. Van Duyne, “Transcutaneous glucose
sensing by surface-enhanced spatially offset Raman spectroscopy in a rat model,” Anal. Chem.82(20), 8382–
8385 (2010) [doi:10.1021/ac101951j].
[18] K. Ma, J. M. Yuen, N. C. Shah, J. T. Walsh Jr, M. R. Glucksberg, and R. P. Van Duyne, “In vivo,
transcutaneous glucose sensing using surface-enhanced spatially offset Raman spectroscopy: multiple rats,
95
Capítulo 8:Referencias
improved hypoglycemic accuracy, low incident power, and continuous monitoring for greater than 17 days,”
Anal. Chem.83(23), 9146–9152 (2011) [doi:10.1021/ac202343e].
[19] A. J. Berger, I. Itzkan, and M. S. Feld, “Feasibility of measuring blood glucose concentration by near-
infrared Raman spectroscopy,” Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy53(2), 287–292 (1997).
[20] A. J. Berger and M. S. Feld, “Analytical Method of Estimating Chemometric Prediction Error,” Appl.
Spectrosc.51(5), 725–732 (1997).
[21] A. J. Berger, T. W. Koo, I. Itzkan, G. Horowitz, and M. S. Feld, “Multicomponent blood analysis by near-
infrared Raman spectroscopy,” Applied optics38(13), 2916–2926 (1999).
[22] A. M. K. Enejder, T. W. Koo, J. Oh, M. Hunter, S. Sasic, M. S. Feld, and G. L. Horowitz, “Blood analysis
by Raman spectroscopy,” Optics letters27(22), 2004–2006 (2002).
[23] I. Barman, C.-R. Kong, N. C. Dingari, R. R. Dasari, and M. S. Feld, “Development of robust calibration
models using support vector machines for spectroscopic monitoring of blood glucose,” Anal Chem82(23),
9719–9726 (2010) [doi:10.1021/ac101754n].
[24] I. Barman, C.-R.Kong, G. P. Singh, R. R. Dasari, and M. S. Feld, “Accurate spectroscopic calibration for
noninvasive glucose monitoring by modeling the physiological glucose dynamics,” Anal. Chem.82(14),
6104–6114 (2010) [doi:10.1021/ac100810e].
[25] A. R. de Paula Jr. and S. Sathaiah, “Raman spectroscopy for diagnosis of atherosclerosis: a rapid analysis
using neural networks,” Medical Engineering & Physics27(3), 237–244 (2005)
[doi:10.1016/j.medengphy.2004.10.007].
[26] G. V. Nogueira, L. Silveira, A. A. Martin, R. A. Zângaro, M. T. T. Pacheco, M. C. Chavantes, and C. A.
Pasqualucci, “Raman spectroscopy study of atherosclerosis in human carotid artery,” J Biomed Opt10(3),
031117 (2005) [doi:10.1117/1.1908129].
[27] S. W. E. van de Poll, K. Kastelijn, T. C. Bakker Schut, C. Strijder, G. Pasterkamp, G. J. Puppels, and A. van
der Laarse, “On-line detection of cholesterol and calcification by catheter based Raman spectroscopy in
human atherosclerotic plaque ex vivo,” Heart89(9), 1078–1082 (2003).
[28] J. W. Chan, D. Motton, J. C. Rutledge, N. L. Keim, and T. Huser, “Raman Spectroscopic Analysis of
Biochemical Changes in Individual Triglyceride-Rich Lipoproteins in the Pre- and Postprandial State,” Anal.
Chem.77(18), 5870–5876 (2005) [doi:10.1021/ac050692f].
[29] A. Maton, Human Biology and Health, 3rd ed., Pearson Prentice Hall (1997).
[30] A. Oikarinen, “Connective tissue and aging,” International Journal of Cosmetic Science26(2), 107–107
(2004) [doi:10.1111/j.1467-2494.2004.213_6.x].
[31] D. P. L. MD, J. G. M. J. MD, D. P. Lookingbill, and J. G. Marks, Principles of Dermatology, 3rd ed.,
Saunders (2000).
[32] R. Weller, J. A. A. Hunter, J. Savin, and M. Dahl, Clinical Dermatology, 4th ed., Wiley-Blackwell (2008).
[33] A. R. of the P. on Macronutrients, S. on U. R. L. of N. and I. and U. of D. R. Intakes, and S. C. on the S. E.
of D. R. Intakes, Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrate, Fiber, Fat, Fatty Acids, Cholesterol,
Protein, and Amino Acids, National Academies Press (2005).
[34] E. N. Marieb, Essentials of Human Anatomy & Physiology, 7th ed., Benjamin Cummings (2002).
[35] K. Zierler, “Whole body glucose metabolism,” Am. J. Physiol.276(3 Pt 1), E409–426 (1999).
[36] V. V. Tuchin, Ed., Handbook of Optical Sensing of Glucose in Biological Fluids and Tissues, 1st ed., Taylor
& Francis (2009).
[37] I. Hanukoglu, “Steroidogenic enzymes: structure, function, and role in regulation of steroid hormone
biosynthesis,” J. Steroid Biochem. Mol. Biol.43(8), 779–804 (1992) [doi:10.1016/0960-0760(92)90307-5].
[38] D. L. Nelson and M. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition with CDROM, Fourth
Edition, W. H. Freeman (2004).
[39] M. A. Lampe, A. L. Burlingame, J. Whitney, M. L. Williams, B. E. Brown, E. Roitman, and P. M. Elias,
“Human stratum corneum lipids: characterization and regional variations,” J. Lipid Res.24(2), 120–130
(1983).
[40] V. V. Tuchin, Handbook of Optical Biomedical Diagnostics, V. V. Tuchin, Ed., SPIE Publications (2002).
[41] E. Smith and G. Dent, Modern Raman Spectroscopy: A Practical Approach, 1st ed., Wiley (2005).
[42] C. V. Raman and K. S. Krishnan, “A new type of secondary radiation,” Nature121(3048), 501–502 (1928).
[43] D. A. Long, The Raman Effect: A Unified Treatment of the Theory of Raman Scattering by Molecules, 1st
ed., Wiley (2001).
[44] J. R. Ferraro, Introductory Raman Spectroscopy, Second Edition, 2nd ed., Academic Press (2002).
[45] I. R. Lewis and H. Edwards, Handbook of Raman Spectroscopy, 1st ed., CRC Press (2001).
96
[46] N. B. Colthup, L. H. Daly, and S. E. Wiberley, Introduction to Infrared and Raman Spectroscopy, Third
Edition, 3rd ed., Academic Press (1990).
[47] A. Fadini, Vibrational spectroscopy: Methods and applications, English ed, Halsted Press (1989).
[48] R. Sarpeshkar, T. Delbruck, and C. A. Mead, “White noise in MOS transistors and resistors,” IEEE Circuits
and Devices Magazine9(6), 23 –29 (1993) [doi:10.1109/101.261888].
[49] R. L. McCreery, Raman Spectroscopy for Chemical Analysis, 1st ed., Wiley-Interscience (2000).
[50] F. M. Requena, Espectroscopia, Pearson Publications Company (2005).
[51] L. D. Landau, Mechanics, Third Edition, Elsevier Science Ltd (1981).
[52] E. B. Wilson, J. C. Decius, and P. C. Cross, Molecular Vibrations: The Theory of Infrared and Raman
Vibrational Spectra, Dover Publications (1980).
[53] G. Socrates, Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies: Tables and Charts, 3rd Edition, 3rd
ed., John Wiley & Sons (2001).
[54] J. De Gelder, K. De Gussem, P. Vandenabeele, and L. Moens, “Reference database of Raman spectra of
biological molecules,” Journal of Raman Spectroscopy38(9), 1133–1147 (2007).
[55] A. Tfayli, O. Piot, F. Draux, F. Pitre, and M. Manfait, “Molecular characterization of reconstructed skin
model by Raman microspectroscopy: Comparison with excised human skin,” Biopolymers87(4), 261–274
(2007).
[56] P. Larkin, Infrared and Raman Spectroscopy; Principles and Spectral Interpretation, 1st ed., Elsevier
(2011).
[57] J. M. Schmitt, “Optical coherence tomography (OCT): a review,” Selected Topics in Quantum Electronics,
IEEE Journal of5(4), 1205–1215 (1999).
[58] H. Yabushita, B. E. Bouma, S. L. Houser, H. T. Aretz, I.-K.Jang, K. H. Schlendorf, C. R. Kauffman, M.
Shishkov, D.-H.Kang, et al., “Characterization of Human Atherosclerosis by Optical Coherence
Tomography,” Circulation106(13), 1640–1645 (2002) [doi:10.1161/01.CIR.0000029927.92825.F6].
[59] J. E. Jackson, A User’s Guide to Principal Components, Wiley-Interscience (2003).
[60] S. R. Arridge, “Optical tomography in medical imaging,” Inverse problems15(2), R41 (1999).
[61] M. Schweiger, S. R. Arridge, M. Hiraoka, D. T. Delpy, and others, “The finite element method for the
propagation of light in scattering media: boundary and source conditions,” MEDICAL PHYSICS-
LANCASTER PA-22, 1779–1792 (1995).
[62] H. Dehghani, B. Brooksby, K. Vishwanath, B. W. Pogue, and K. D. Paulsen, “The effects of internal
refractive index variation in near-infrared optical tomography: a finite element modelling approach,” Physics
in medicine and biology48(16), 2713 (2003).
[63] S. R. Arridge, M. Schweiger, M. Hiraoka, D. T. Delpy, and others, “A finite element approach for modeling
photon transport in tissue,” MEDICAL PHYSICS-LANCASTER PA-20, 299–299 (1993).
[64] K. D. Paulsen and H. Jiang, “Spatially varying optical property reconstruction using a finite element
diffusion equation approximation,” Medical Physics22, 691 (1995).
[65] T. J. Farrell, M. S. Patterson, B. Wilson, and others, “A diffusion theory model of spatially resolved, steady-
state diffuse reflectance for the noninvasive determination of tissue optical properties in vivo,” Med.
Phys19(4), 879–888 (1992).
[66] S. Mallat, A Wavelet Tour of Signal Processing, Third Edition: The Sparse Way, 3rd ed., Academic Press
(2008).
[67] J. S. Walker, A Primer on Wavelets and Their Scientific Applications, Second Edition, 2nd ed., Chapman
and Hall/CRC (2008).
[68] A. Boggess and F. J. Narcowich, A First Course in Wavelets with Fourier Analysis, 2nd ed., Wiley (2009).
[69] Y. Nievergelt, Wavelets Made Easy, Corrected, Birkhäuser (1999).
[70] I. Daubechies, Ten Lectures on Wavelets, 1st ed., SIAM: Society for Industrial and Applied Mathematics
(1992).
[71] C. Camerlingo, F. Zenone, G. M. Gaeta, R. Riccio, and M. Lepore, “Wavelet data processing of micro-
Raman spectra of biological samples,” Measurement Science and Technology17(2), 298–303 (2006)
[doi:10.1088/0957-0233/17/2/010].
[72] A. E. Villanueva-Luna, J. Castro-Ramos, S. Vazquez-Montiel, A. Flores-Gil, J. A. Delgado-Atencio, and E.
E. Orozco-Guillen, “Fluorescence and noise subtraction from Raman spectra by using wavelets,” Optical
memory & neural networks19(4), 310–317 (2010).
[73] A. Cao, A. K. Pandya, G. K. Serhatkulu, R. E. Weber, H. Dai, J. S. Thakur, V. M. Naik, R. Naik, G. W.
Auner, et al., “A robust method for automated background subtraction of tissue fluorescence,” Journal of
Raman Spectroscopy38(9), 1199–1205 (2007) [doi:10.1002/jrs.1753].
97
Capítulo 8:Referencias
[74] C. A. Lieber and A. Mahadevan-Jansen, “Automated Method for Subtraction of Fluorescence from
Biological Raman Spectra,” Appl. Spectrosc.57(11), 1363–1367 (2003).
[75] M. Delhaye and P. Dhamelincourt, “Raman microprobe and microscope with laser excitation,” Journal of
Raman Spectroscopy3(1), 33–43 (1975) [doi:10.1002/jrs.1250030105].
[76] S. Schlücker, M. D. Schaeberle, S. W. Huffman, and I. W. Levin, “Raman Microspectroscopy: A
Comparison of Point, Line, and Wide-Field Imaging Methodologies,” Anal. Chem.75(16), 4312–4318
(2003) [doi:10.1021/ac034169h].
[77] K. A. Christensen and M. D. Morris, “Hyperspectral Raman Microscopic Imaging Using Powell Lens Line
Illumination,” Appl. Spectrosc.52(9), 1145–1147 (1998).
[78] K. Golcuk, G. S. Mandair, A. F. Callender, N. Sahar, D. H. Kohn, and M. D. Morris, “Is photobleaching
necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?,” Biochim. Biophys.Acta1758(7), 868–873
(2006) [doi:10.1016/j.bbamem.2006.02.022].
[79] S. Bernard, O. Beyssac, and K. Benzerara, “Raman mapping using advanced line-scanning systems:
geological applications,” Appl Spectrosc62(11), 1180–1188 (2008) [doi:10.1366/000370208786401581].
[80] D. N. Batchelder, C. Cheng, and G. David Pitt, “Molecular imaging by Raman microscopy,” Advanced
Materials3(11), 566–568 (1991) [doi:10.1002/adma.19910031112].
[81] E. N. Lewis, P. J. Treado, and I. W. Levin, “A Miniaturized, No-Moving-Parts Raman Spectrometer,” Appl.
Spectrosc.47(5), 539–543 (1993).
[82] H. R. Morris, C. C. Hoyt, and P. J. Treado, “Imaging Spectrometers for Fluorescence and Raman
Microscopy: Acousto-Optic and Liquid Crystal Tunable Filters,” Appl. Spectrosc.48(7), 857–866 (1994).
[83] B. R. Wood, P. Caspers, G. J. Puppels, S. Pandiancherri, and D. McNaughton, “Resonance Raman
spectroscopy of red blood cells using near-infrared laser excitation,” Anal Bioanal Chem387(5), 1691–1703
(2007) [doi:10.1007/s00216-006-0881-8].
[84] P. C. White, C. Rodger, V. Rutherford, Y. Finnon, W. E. Smith, and M. P. Fitzgerald, “Surface-enhanced
resonance Raman scattering (SERRS) spectroscopy: a powerful technique for the forensic analysis of
colorants?,” 77–86 (1999) [doi:10.1117/12.334517].
[85] O. S. Khalil, “Spectroscopic and clinical aspects of noninvasive glucose measurements,” Clin.Chem.45(2),
165–177 (1999).
[86] A. Afifi, S. May, and V. A. Clark, Practical Multivariate Analysis, Fifth Edition, 5th ed., Chapman and
Hall/CRC (2011).
[87] H. Sato, H. Chiba, H. Tashiro, and Y. Ozaki, “Excitation wavelength-dependent changes in Raman spectra
of whole blood and hemoglobin: comparison of the spectra with 514.5-, 720-, and 1064-nm excitation,” J
Biomed Opt6(3), 366–370 (2001) [doi:10.1117/1.1380668].
[88] J. Gower, S. G. Lubbe, and N. L. Roux, Understanding Biplots, 1st ed., Wiley (2011).
[89] B. W. Pogue and M. S. Patterson, “Review of tissue simulating phantoms for optical spectroscopy, imaging
and dosimetry,” Journal of biomedical optics11(4), 041102–041102 (2006).
[90] R. Bays, G. Wagnières, D. Robert, J. F. Theumann, A. Vitkin, J. F. Savary, P. Monnier, and H. van den
Bergh, “Three-dimensional optical phantom and its application in photodynamic therapy,” Lasers in surgery
and medicine21(3), 227–234 (1997).
[91] A. Santiago-Alvarado and S. Vázquez-Montiel, “Propiedades físico-químicas de membranas PDMS
empleadas en lentes líquidas,” Superficies y vacío(3), 61–66 (2009).
[92] R. J. Cooper, R. Eames, J. Brunker, L. C. Enfield, A. P. Gibson, and J. C. Hebden, “A tissue equivalent
phantom for simultaneous near-infrared optical tomography and EEG,” Biomed Opt Express1(2), 425–430
(2010) [doi:10.1364/BOE.1.000425].
[93] A. Santiago-Alvarado, S. Vázquez-Montiel, J. González-García, B. I. G. Licona-Morán, J. A. Rayas-
Álvarez, and G. Castro-González, “Fabricación y caracterización de membranas elásticas de PDMS para
lentes líquidas con longitud focal variable (LLLFV),” membranes16, 653–658 (2005).
[94] A. E. Villanueva-Luna, J. Castro-Ramos, S. Vazquez-Montiel, A. Flores-Gil, J. A. Delgado Atencio, and C.
M. Ortiz-Lima, “Mapping skin using Raman spectroscopy,” 2011, 790610–790610–7
[doi:10.1117/12.874268].
[95] T.-W.Koo, “Measurement of blood analytes in turbid biological tissue using near-infrared Raman
spectroscopy,” Thesis, Massachusetts Institute of Technology (2001).
[96] M. V. Schulmerich, K. A. Dooley, M. D. Morris, T. M. Vanasse, and S. A. Goldstein, “Transcutaneous fiber
optic Raman spectroscopy of bone using annular illumination and a circular array of collection fibers,”
Journal of biomedical optics11, 060502 (2006).
98
[97] N. A. Macleod and P. Matousek, “Deep Noninvasive Raman Spectroscopy of Turbid Media,” Appl.
Spectrosc.62(11), 291A–304A (2008).
[98] H. Dehghani, M. E. Eames, P. K. Yalavarthy, S. C. Davis, S. Srinivasan, C. M. Carpenter, B. W. Pogue, and
K. D. Paulsen, “Near infrared optical tomography using NIRFAST: Algorithm for numerical model and
image reconstruction,” Commun Numer Methods Eng25(6), 711–732 (2008) [doi:10.1002/cnm.1162].
[99] S. Wan, R. Anderson, and J. A. Parrish, “Analytical modeling for the optical properties of the skin with in
vitro and in vivo applications,” Photochemistry and Photobiology34(4), 493–499 (1981).
[100] M. Kohl, M. Cope, M. Essenpreis, and D. Böcker, “Influence of glucose concentration on light scattering in
tissue-simulating phantoms,” Optics letters19(24), 2170–2172 (1994).
[101] S. P. Lin, L. Wang, S. L. Jacques, and F. K. Tittel, “Measurement of tissue optical properties by the use of
oblique-incidence optical fiber reflectometry,” Applied optics36(1), 136–143 (1997).
[102] J. R. Mourant, I. J. Bigio, D. A. Jack, T. M. Johnson, and H. D. Miller, “Measuring absorption coefficients
in small volumes of highly scattering media: source-detector separations for which path lengths do not
depend on scattering properties,” Applied optics36(22), 5655–5661 (1997).
[103] C. R. Simpson, M. Kohl, M. Essenpreis, and M. Cope, “Near-infrared optical properties of ex vivo human
skin and subcutaneous tissues measured using the Monte Carlo inversion technique,” Physics in Medicine
and Biology43, 2465 (1998).
[104] I. V. Meglinski and S. J. Matcher, “Determination of absorption coefficient of skin melanin in visible and
NIR spectral region,” in Proceedings of SPIE3907, p. 143 (2000).
[105] I. V. Meglinski and S. J. Matcher, “Quantitative assessment of skin layers absorption and skin reflectance
spectra simulation in the visible and near-infrared spectral regions,” Physiological measurement23, 741
(2002).
[106] A. N. Bashkatov, E. A. Genina, V. I. Kochubey, and V. V. Tuchin, “Optical properties of human skin,
subcutaneous and mucous tissues in the wavelength range from 400 to 2000 nm,” Journal of Physics D:
Applied Physics38, 2543 (2005).
[107] V. V. Tuchin, A. N. Bashkatov, E. A. Genina, V. I. Kochubey, V. V. Lychagov, S. A. Portnov, N. A.
Trunina, D. R. Miller, S. Cho, et al., “Finger tissue model and blood perfused skin tissue phantom,” in
Proceedings of SPIE7898, p. 78980Z (2011).
[108] G. Zonios, J. Bykowski, and N. Kollias, “Skin melanin, hemoglobin, and light scattering properties can be
quantitatively assessed in vivo using diffuse reflectance spectroscopy,” Journal of Investigative
Dermatology117(6), 1452–1457 (2001).
[109] J. S. Maier, S. A. Walker, S. Fantini, M. A. Franceschini, and E. Gratton, “Possible correlation between
blood glucose concentration and the reduced scattering coefficient of tissues in the near infrared,” Optics
letters19(24), 2062–2064 (1994).
99
Apéndice A: Lista de publicaciones
Apéndice A: Lista de publicaciones

1. “Low abundances of synthetics lipids in phantoms”, A.E. Villanueva-Luna, A. Santiago-
Alvarado, J. Castro-Ramos, S. Vazquez-Montiel, A. Flores-Gil, J. Aguilar Soto, J.A Delgado-
Atencio, Design and Performance Validation of Phantoms Used in Conjunction with Optical
Measurement of Tissue III, Proc. SPIE 8229A (2012).
2. “Raman spectroscopy of blood in-vitro”, A.E. Villanueva-Luna, J. Castro-Ramos, S. Vazquez-
Montiel, A. Flores-Gil, C.M. Ortiz Lima, J.A Delgado-Atencio, Optical Diagnostics and Sensing
XI: Toward Point-of-Care Diagnostics; and Design and Performance Validation of Phantoms
Used in Conjunction with Optical Measurement of Tissue III, Proc. SPIE 8229B, (2012).
3. Adrian E. Villanueva- Luna, Alberto Jaramillo-Nuñez, Daniel Sanchez-Lucero, Carlos M.
Ortiz-Lima, J. Gabriel Aguilar-Soto, Aaron Flores-Gil & Manuel May-Alarcon, De-Noising
Audio Signals Using MATLAB Wavelets Toolbox, Edited by Ali H. Assi,Engineering
Education and Research Using MATLAB, (pp. 25-54), September, 2011, Printed in Croatia,
Published by InTech.
4. “Raman spectra and optical coherent tomography images of skin”, A. E. Villanueva-Luna, J.
Castro-Ramos, S. Vazquez-Montiel, A. Flores-Gil, J.A. Delgado-Atencio, A. Vázquez-Villa,
Photonic Therapeutics and Diagnostics VII. Edited by Kollias, Nikiforos; Choi, Bernard; Zeng,
Haishan; Kang, Hyun Wook; Knudsen, Bodo E.; Wong, Brian J.; Ilgner, Justus F. R.; Gregory,
Kenton W.; Tearney, Guillermo J.; Marcu, Laura; Hirschberg, Henry; Madsen, Steen J.;
Mandelis, Andreas; Mahadevan-Jansen, Anita; Jansen, E. Duco. Proceedings of the SPIE,
Volume 7883, pp. 788310-788310-9 (2011).
5. “Mapping skin using Raman spectroscopy”, A.E. Villanueva-Luna, J. Castro-Ramos, S.
Vazquez-Montiel, A. Flores-Gil, J.A Delgado-Atencio, C.M. Ortiz Lima, Optical Diagnostics and
Sensing XI: Toward Point-of-Care Diagnostics; and Design and Performance Validation of
Phantoms Used in Conjunction with Optical Measurement of Tissue III. Edited by Nordstrom,
Robert J.; Coté, Gerard L. Proceedings of the SPIE, Volume 7906, pp. 790610-790610-7 (2011).
6. "Fabrication and characterization of phantoms made of polydimethylsiloxane (PDMS)",A. E.
Villanueva-Luna, A. Santiago-Alvarado, J. Castro-Ramos, B. Licona-Moran, S. Vazquez-
Montiel, A. Flores-Gil and J. A. Delgado-Atencio, Proc. SPIE 7906, 79060I (2011).
7. “Fluorescence and Noise Subtraction from Raman Spectra by Using Wavelets” A.E. Villanueva-
Luna, J. Castro-Ramos, S. Vazquez-Montiel, A. Flores-Gil, J.A Delgado-Atencio , E.E Orozco-
Guillen , Optical Memory and Neural Networks (Information Optics), Volume 19 Number 4,
2010.
8. “Diagnóstico de lesiones en piel a partir de espectros de reflexion difusa empleando algoritmos
computacionales: un estudio preliminar”E. E. Orozco, J. A. Delgado, S. Vázquez, J. Castro, A.
E. Villanueva y F. Gutiérrez., Rev. Cub. Física vol. 27 No. 1 (2010) p.66-69.
9. “Comparison of different kind of skin using Raman spectroscopy” Villanueva-Luna, A.E.;
Castro-Ramos, J.; Vazquez-Montiel, S.; Flores Gil, A.; Delgado-Atencio, J.A., Optical
Diagnostics and Sensing X: Toward Point-of-Care Diagnostics. Edited by Coté, Gerard L.
Proceedings of the SPIE, Volume 7572, pp. 75720M-75720M-8 (2010).
100
Apéndice B: ANSI Z136.1-2007

La norma encargada de regular el uso seguro de los láseres fue creada por la Instituto de
estándares nacional Americano (ANSI del acrónimo en inglés American National Standars
Institute), con la intención de proporcionar la clasificación de los láseres, efectos biológicos y la
máxima exposición permitida para el ojo y en el caso que nos interesa que es la piel. La
ANSI Z136.1-2007 proporciona las siguientes ecuaciones para calcular el máximo exposición
permitida, como se mostrara a continuación se tienen 3 diferentes ecuaciones para los distintos
tiempos. Y una ecuación más para el factor de corrección (CA) el cual incrementa en el infrarrojo
cercano en la banda espectral de (0.7-1.4 µm) basado en la reducción de las propiedades de
absorción de la los pigmentos de melanina granulados encontrados en la piel y el pigmento
retinal del epitelium.
C A  10 2(  0.7 ) para   0.7 a 1.05  m ( B1)

  0.4 to 1.4  m T  10 9 a 10 7 s MPE  2C A x 10 2 ( J / cm 2 ) (B2)
7 0.25 2
  0.4 to 1.4  m T  10 a 10s MPE  1.1C At ( J / cm ) ( B3)
2
  0.4 to 1.4  m T  10 a 30000s MPE  0.2C A ( W / cm ) ( B4)
Para esta tesis se utiliza la ecuación B4 y se asumió un spot de 200 µm de forma circular, se
calculó el área para esa geometría y se obtiene:
A   r 2   (100  m)2  31415.9265  m2
Luego se calculó para un láser con longitud de onda de λ=0.785 µm
C A  102(0.7850.7 )  1.4791
MPE  0.2C A  0.29582( W / cm2 ) para 500 min(30000s ).
Inmediatamente se convierte de W a mW:
1000 mW
MPE  0.29582 ( W / cm2 ) *  295.82 ( mW / cm2 ) for 500 min .
1W
Después se convierte de cm2 a µm2:

1 cm2 1 mm2
MPE  295.82 *  0.0000029582(mW /m2 ) para 500min.
100 mm2 1000000 m2
101
Finalmente se calcula el MPE para el área del spot del laser
MPE( A)  31415.9265 * 0.0000029582  0.0929345937723 mW para 500min.
Como no se quiere exponer a una persona a un tiempo de 500 min solo se quiere escalar la
misma cantidad de energía en 1 minuto se hizo el siguiente calculo
Para un MPE de 1 minuto:
MPE  0.0929345937723 * 500  46.4672968 (mW ) para 1min.
También se calculó para solo 10 segundos
MPE  46.4672968 * 6  278.803708 mW para 10s.
Hay que hacer la aclaración que esta potencia solo puede ser utilizado para tomar un solo
espectro Raman debido a que si se toman más de uno se estaría sobrepasando la potencia
máxima permitida y podría ocasionar enrojecimiento de la piel.
102
Apéndice C: Programas escritos para esta tesis

Lista de programas
1. Programa para remover el ruido

2. Programa para remover fluorescencia
3. Programa para generar lorentzianas
4. Programa para generar graficas agrupando etiquetas
5. Programa para generar mapas
6. Programa para generar el cilindro a simular en NIRFAST
7. Programa para generar la matriz de la eficiencia
8. Programa para generar las figuras de las geometrías
Programa para remover el ruido
function [final,value]=tesissmooth(rawaxis,raw_spectrum,smooth)
% This fuction denoise Raman spectra using wavelet, in this case
% I am using symlets wavelets. you need to load the spectrum in workspace.
% example: [final,value]=wavsingle(Iparacetamol(:,1),Iparacetamol(:,2),'hd')
wav=rawaxis;
intensity=raw_spectrum;
% Perform a wavelet packet decomposition of the signal
% at level 5 using sym6.
wname = 'sym6'; lev = 5;
tree = wpdec(intensity,lev,wname);
% Estimate the noise standard deviation from the
% detail coefficients at level 1,
% corresponding to the node index 2.
det1 = wpcoef(tree,2);
sigma = median(abs(det1))/0.6745;
% Use wpbmpen for selecting global threshold
% for signal de-noising, using the recommended parameter.
103
alpha = 2;
thr = wpbmpen(tree,sigma,alpha);
% Use wpdencmp for de-noising the signal using the above
% threshold with soft thresholding and keeping the approximation.
keepapp = 1;
switch smooth
case {'hd'}
xd = wpdencmp(tree,'h','threshold',thr,keepapp);
case {'st'}
xd = wpdencmp(tree,'s','nobest',thr,keepapp);
otherwise
disp('WTF')
end
final=[wav,xd];
value=SNR(intensity,xd);
subplot(2,1,1);
plot(wav,intensity)
xlim([300 1800])
%xlim([250 1550])
title('signal', 'Fontangle','italic','fontweigh','bold','FontName','Times new roman','fontsize',12)
ylabel('Intensity (Counts)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',8)
legend ('noise')
subplot(2,1,2);
plot(wav,xd,'r')
legend ('denoised')
xlim([300 1800])
%xlim([250 1550])
104
title('señal sin ruido', 'Fontangle','italic','fontweigh','bold','FontName','Times new roman','fontsize',12)
xlabel('Desplazamiento Raman (cm^-^1)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',8)
ylabel('Intensity (A.U)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',8)
end
Programa para remover fluorescencia
function [Y,indata]=BGMimMax(indata,Porder)
% Based on "A robust method for automated background subtraction of tissue fluorescence." Alex Cao, 2007, JRS.
% usage: [indata]=BGMimMax(indata,Porder)
%BGMimMax(alcohol96,10)
% where:
% indata is a [n x m] matrix with n being the wavelength/wavenumber axis
% and m being the number of spectra (m >= 1).
% Porder is the polynomial order for background correction, default == 3
% two polynomial orders are actually used, Porder and Porder+1. Both
% are optimized and also pinned at the edges during optimization
% using the MimMax method.
if ~exist('Porder','var')
Porder = 3;
end
for i=1:size(indata,2)
data = indata(:,i);
ndata = numel(data);
numbins = floor(ndata/30);
noise = min(std(reshape(data(1:numbins*30),[30,numbins])));
all_points = 1:numel(data);
selected_points = true(size(data));
prev_err = inf;
curr_err = realmax;
105
while (prev_err > curr_err) & (sum(selected_points) > (Porder*5))
% get the polynomial fits for the two selected orders with end without
% the endpoitns fixed.
local_SP = find(selected_points);
% [P,S,MU] = POLYFIT(X,Y,N)
% [Y,DELTA] = POLYVAL(P,X,S,MU)
[P,S,MU] = polyfit(local_SP,data(local_SP),Porder);
[Y(:,1)] = polyval(P,all_points,S,MU);
[P,S,MU] = polyfit(local_SP,data(local_SP),Porder+1);
local_SP = selected_points;
local_SP([1,end]) = true; % always select the ends
local_SP = find(local_SP);
[P,S,MU] = polyfit(local_SP,data(local_SP),Porder);
[P,S,MU] = polyfit(local_SP,data(local_SP),Porder+1);
% hold off;
% plot(data);
% hold on;
% plot(Y);
Y = max(Y,[],2);
% plot(Y,'k');
selected_points = selected_points & ((Y + noise) > data);
prev_err = curr_err;
curr_err = sum((data(selected_points)-Y(selected_points)).^2)/sum(selected_points);
% pause(0.25);
end
106
indata(:,i) = data - Y;
% figure;
plot(data-Y)
end
Programa para generar lorentzianas
x=basedata(:,1);
% g5=2*gaussmf(x,[3 1065]);
% g6=0.5*gaussmf(x,[3 1126]);
% g7=gaussmf(x,[3 1365]);
% g8=0.5*gaussmf(x,[3 1456]);
% t1=gaussmf(x,[4 1081]);
% t3=2*gaussmf(x,[4 1256]);
% t4=1.2*gaussmf(x,[4 1437]);
% c4=1.2*gaussmf(x,[4 1433]);
% c5=gaussmf(x,[4 1658]);
% c6=0.7*gaussmf(x,[4 1739]);
A=[2,2.6,7]; % Total area under the curve from baseline
w=[10,13,24];% bandwidth of the peak at FWHM
%x0=[1065,1126,1365,1456];% position of the peak
%x0=[1087,1254,1430];% position of the peak
x0=[1437,1653,1735];% position of the peak
y=zeros(704,3);
for i=1:3
y(:,i)=10*(2.*A(i)./pi).*(w(i)./(4.*(x-x0(i)).^2+w(i).^2)); % lorentian curve
end
y0=sum(y,2); % sum of all peaks
%yr1=awgn(y0,20,'measured');
y0=130*y0;
107
plot(basedata(:,1),basedata(:,2:19))
hold on
plot(x,y0,'LineWidth',2,'Color',[0 0 0])
xlim([1000 1800])
Programa para generar graficas agrupando etiquetas
hSLines = plot(basedata(:,1),basedata(:,2:19));
hold on
hCLines = plot(x,yg,'LineWidth',2,'Color',[1 0 0]);
hbLines=plot(x,yc,'LineWidth',2,'Color',[0 0 0]);
hkLines=plot(x,yt,'LineWidth',2,'Color',[0 0 1]);
xlim([1000 1800])
ylim([0 510])
xlabel('Desplazamiento Raman(cm^-^1)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',10)
ylabel('Intensidad (U.A)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',10)
hSGroup = hggroup;
hCGroup = hggroup;
hbGroup = hggroup;
hkGroup = hggroup;
set(hSLines,'Parent',hSGroup)
set(hCLines,'Parent',hCGroup)
set(hbLines,'Parent',hbGroup)
set(hkLines,'Parent',hkGroup)
% Include these hggroups in the legend:
set(get(get(hSGroup,'Annotation'),'LegendInformation'),...
'IconDisplayStyle','on');
set(get(get(hCGroup,'Annotation'),'LegendInformation'),...
set(get(get(hbGroup,'Annotation'),'LegendInformation'),...
108
set(get(get(hkGroup,'Annotation'),'LegendInformation'),...
legend('muestras','glucosa','colesterol','trigliceridos')
Programa para generar mapas
d=0:5/888:5;
x=s1m(:,1);
figure(1)
imagesc(x,d,s1m')
colorbar
xlabel('Desplazamiento Raman(cm^-^1)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',12)
ylabel('Distancia(mm)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',12)
ylabel(colorbar,'Intensidad(U.A)','Fontangle','italic','FontName','Times new roman','fontsize',12)
%print -painters -dpng -r2000 mapa2.png
Programa para generar el cilindro a simular en NIRFAST
varb = load_mesh('C:\Users\A.E\Documents\MATLAB\nirfast\test\b1');
xpts = varb.nodes(:,1);
ypts = varb.nodes(:,2);
zpts = varb.nodes(:,3);
plot3(xpts,ypts,zpts,'.')
% regionlabel = 1; % tubing
% cylinder_position = [3.1/2,33*2,0,0,0];
% model = selectsubregion(model, regionlabel, 'x-cylinder', cylinder_position);
% regionlabel = 2; % glucose solution
% cylinder_position = [1.7/2,33*2,0,0,0];
% model = selectsubregion(model, regionlabel, 'x-cylinder', cylinder_position);
109
currentregion = find(model.region==0);
model.mua(currentregion) = X;
model.mus(currentregion) = X;
model.ri(currentregion) = X;
val.mua=0.012;
val.mus=3.55;
val.ri=1.44;
varb = set_mesh(varb,0,val);
% varb.kappa=(1./(3.*(varb.mua+varb.mus)));
% varb.c=(3e11/varb.ri);
xpos = 0; ypos=0; zpos = 5.6; diam = 1.5;
xpos1 = 0; ypos1=0; zpos1 = 5.6; diam1 = 1;
size(varb.mus);
size(varb.nodes);
varb.mus(1:5,:);
labeled = sqrt(((ypts-ypos)).^2 + (((zpts-zpos)).^2))<diam;
labeled1 = sqrt(((ypts-ypos1)).^2 + (((zpts-zpos1)).^2))<diam1;
hold on
plot3(xpts(labeled),ypts(labeled),zpts(labeled),'ro')
plot3(xpts(labeled1),ypts(labeled1),zpts(labeled1),'go')
axis equal
% optical properties of silicon tube
val1..mus(labeled) = 48;
val1.mua(labeled) = 0.000155;
val1.ri(labeled)=3.6565;
%optical properties of glucose
val2.mus(labeled1) = 30;
val2.mua(labeled1) = 0.000155;
110
val2.ri(labeled1)=3.6565;
a=find(varb.mus>1);
b=find(varb.mus == 48);
varb.kappa(labeled)=(1./(3.*(varb.mua(labeled)+varb.mus(labeled))));
varb.c(labeled)=(3e11/varb.ri(labeled));
d=find(varb.mus==30);
% varb.kappa(d)=(1./(3.*(varb.mua(labeled1)+varb.mus(labeled1))));
% varb.c(d)=(3e11/varb.ri(labeled1));
varb.region(a)=0;
varb.region(b)=1;
varb.region(d)=2;
Programa para calcular la eficiencia
function [region0efficiency, region1efficiency, relativeefficiency] =

calculate_model_efficiency(model,sourcedata,measdata)
num_sources = size(sourcedata.phi,2);
num_dets = size(measdata.phi,2);
region0efficiency = zeros(num_sources, num_dets);
region1efficiency = zeros(num_sources, num_dets);
relativeefficiency = zeros(num_sources, num_dets);
for i=1:1:72
for j=1:1:72
current_model=sourcedata.phi(:,i).*measdata.phi(:,j);
region0efficiency(i,j) = sum(current_model(model.region==0));
region1efficiency(i,j) = sum(current_model(model.region==1));
% ea1(i,j)=sum(h(model.b,j))/sum(h(model.a,j));
% ea(i,j)=sum((h(model.b,j)));
%model1.eff1r[]=ea(:,j);
end
111
end
relativeefficiency = region1efficiency./region0efficiency;
Programa para generar la matriz de la eficiencia
load regions1
load regions2
load regions3
load coordinates
coords = [];
coords(:,1)=cx;
coords(:,2)=cy;
% coords(:,1)=cxh;
% coords(:,2)=cyh;
r0eff = zeros(72,72,3,3);
r1eff = zeros(72,72,3,3);
r2eff = zeros(72,72,3,3);
releff = zeros(72,72,3,3);
releffg = zeros(72,72,3,3);
depth = 1; scatt = 1;
[r0eff(:,:,depth,scatt), r1eff(:,:,depth,scatt),r2eff(:,:,depth,scatt), releff(:,:,depth,scatt),releffg(:,:,depth,scatt)] =

calculate_model_efficiency(model1a, model1a.sourced, model1a.colld);
[r0eff(:,:,depth,scatt), r1eff(:,:,depth,scatt),r2eff(:,:,depth,scatt), releff(:,:,depth,scatt),releffg(:,:,depth,scatt)]=



calculate_model_efficiency(model1b, model1b.sourced, model1b.colld);
112



calculate_model_efficiency(model1c, model1c.sourced, model1c.colld);


plotcylindermodel_w_grid(log10(shiftdim(squeeze(releff(35,:,:,:)),1)), coords)
% % example of single source in pattern:
% plotcylindermodel((relativeefficiency(36,:)), coords)
% data(1,1,:) = model1.effr(36,:);
% data(2,1,:) = model1.effr2(36,:);
% data(3,1,:) = model1.effr3(36,:);
% plotcylindermodel_w_grid(log10(data), coords)
% source_fiber = 35;
% depth = 1;
% r1eff(1,depth,:) = model1.effa(source_fiber,:);
% r1eff(2,depth,:) = model1.effa2(source_fiber,:);
% releff(1,depth,:) = model1.effr(source_fiber,:);
% releff(2,depth,:) = model1.effr2(source_fiber,:);
113
% depth = 2;
% depth = 3;
% r0eff = r1eff./releff;
% plotcylindermodel_w_grid(log10(r0eff), coords)
Programa para generar las figuras de las geometrías
load coordinates
angles = 0:pi/36:2*pi;
figure (1)
plot(33*sin(angles),33*cos(angles))
line([-33 33],[1.535 1.535],'Color','r','LineStyle',':','LineWidth',1)
line([-33 33],[-1.535 -1.535],'Color','r','LineStyle',':','LineWidth',1)
hold on;
cirsize = 0.5;
% Source 1
plot(cirsize*sin(angles)+cx1(43),cirsize*cos(angles)+cy(43));
114
rectangle('Position',[-0.4,-0.4,0.8,0.8],...
'Curvature',[0,0],...
'LineWidth',0.5,'LineStyle','-')
% Source 2
% plot(cirsize*sin(angles)+cx1(37),cirsize*cos(angles)+cy(37));
% rectangle('Position',[4.6,2.1,0.8,0.8],...
% 'Curvature',[0,0],...
% 'LineWidth',0.5,'LineStyle','-')
% % Source 3
% plot(cirsize*sin(angles)+cx1(44),cirsize*cos(angles)+cy(44));
% rectangle('Position',[-0.4,4.6,0.8,0.8],...
% 'Curvature',[0,0],...
% 'LineWidth',0.5,'LineStyle','-')
s=43;
%x=[49,50,44,42,36,37,48,35,51,56]; %on axis
%x=[56,50,49,36,30,37,42,23,69,62];
%x=[56,50,30,49,36,37,69,23,17,42];
%x=[69,56,62,63,17,23,24,30,10,4];
%x=[69,63,62,56,17,23,24,11,10,4];
%x=[36,43,30,31,44,29,38,42,35,50];%plus 2.5
%x=[36,43,49,42,29,23,30,35,56,17];
%x=[37,36,43,49,50,42,56,30,38,51];% plus 5
%x=[36,49,43,42,30,56,23,29,62,69];
% geometries
%geometry 1
%x=[30,31,29,36,37,49,50,55,56,57];
% %x=[35,38,42,36,37,49,50,44,48,51];
115
% %x=[30,44,42,36,37,49,50,45,56,41];
% x=[69,56,30,17,4,37,50,63,24,11];
% %x=[30,37,44,51,50,36,42,49,56,35];
x=[49,50,56,37,62,36,69,42,23,30];% geometry 1
%x=[49,50,56,37,57,36,55,31,29,30];% geometry 2
%x=[50,30,56,37,69,24,63,11,4,17]; %geometry 3
%x=[49,36,50,37,56,42,51,30,35,44];% geometry 4
%x=[56,63,62,30,69,24,10,23,4,17];% geometry 5
%x=[42,43,49,36,56,35,17,29,23,30];%geometry 6
d=2;
sc=3;
for j=1:1:10;
patch(cirsize*sin(angles)+cx1(x(j)),cirsize*cos(angles)+cy(x(j)),log10(releff(s,x(j),d,sc)));
colorbar
xlabel('X position (mm)')
ylabel('Y position (mm)')
axis equal
xlim([-22 17])
ylim([-10 10])
end
% patch(cirsize*sin(angles)+cx1(x(1)),cirsize*cos(angles)+cy(x(1)),log(r2eff(s,x(1),d,sc)));
116
% %colorbar
% xlabel('X position (mm)')
% ylabel('Y position (mm)')
% %title('configuration 1 (1mm)')
% axis equal
% xlim([-12 12])
% ylim([-10 10])
117
Articulo original de Raman
118
Rev. Cub. Física vol. 27 No. 1 (2010) p.66-69 Revista Cubana de Física
ISSN: 0253-9268. Original paper
Calle I No. 302 e/ 15 y 17
Vedado, La Habana. CP 10400
TECNOLASER www.fisica.uh.cu/biblioteca/revcubfi/index.htm
2009
Diagnóstico de lesiones en la piel a partir de

espectros de reflexión difusa empleando algoritmos
computacionales: un estudio preliminar
E. E. Orozcoa, b, J. A. Delgadoa,c, S. Vázqueza, J. Castroa , A. E. Villanuevaa y F. Gutiérrez.
a) Instituto Nacional de Astrofísica Óptica y Electrónica, C.P 72000 Puebla, México. b) Facultad Expe-
rimental de Ciencia y Tecnología, Depto. de Física, Universidad de Carabobo, C.P.2005 Valencia-
Venezuela; eeorozco@uc.edu.ve†, c) Depto. de Física, Centro de Aplicaciones Tecnológicas y Desarrollo
Nuclear, CEADEN-CITMA, La Habana, Cuba, d) Centro de Estudios y Prevención del Cáncer
(CEPREC), Oaxaca, México.
†autor para la correspondencia
Recibido el 15/04/2009. Aprobado en versión final el 18/02/2010.
Sumario. La determinación del espectro de reflexión difusa de la piel humana en el rango espectral de 400 nm-1000 nm
empleando espectrómetros de fibras ópticas es una técnica no invasiva ampliamente usada para estudiar los parámetros
ópticos de este órgano, brinda información sobre las propiedades de absorción y de esparcimiento de la luz que pueden
ser empleadas para estudiar la morfología y fisiología del tejido y poder detectar y diagnosticar enfermedades de la piel
en su etapa inicial. En este trabajo se propone un algoritmo computacional para la selección de los atributos más rele-
vantes de los espectros de reflexión difusa en la piel humana obtenidos con un sistema experimental que consta básica-
mente de un espectrómetro, una fuente de luz blanca y una sonda de fibra óptica bifurcada que permite enviar y colectar
la luz. Para clasificar la señal espectral se ha diseñado una interfaz gráfica en Matlab2006© que hace uso de las máqui-
nas de soporte vectorial y se ha utilizado un algoritmo de selección de atributos que permite alcanzar una sensibilidad y
especificidad superior al 80% y una exactitud en la clasificación del 85%.
Abstract. The determination of diffuse reflection spectrum on human skin in the spectral range from 400nm-1000nm
using an optical fiber spectrometers is a non-invasive technique widely used to study the optical parameters of this tis-
sue, provides information about the absorption and scattering properties of light that can be employed to study the mor-
phology and physiology of the tissue and to detect and diagnose skin diseases in early stages. In this paper a computa-
tional algorithm for the selection of the most important attributes of diffuse reflection spectra of human skin obtained
with an experimental system that basically consists of a spectrometer, a white light source and bifurcated fiber optic
probe that allows send and collect light. To classify the spectral signal was designed a Matlab2006© graphical interface
which use support vector machines and algorithm for selecting attributes that allows to achieve a sensitivity and speci-
ficity exceeding 80% and 85% of accuracy in the classification.
Palabras clave. Tissue Damage 87.85.em, Pattern Recognition 42.30.Sy, Cancer 87.19.xj
1 Introducción principalmente del color y el borde, la biopsia aún se

mantiene como la regla de oro para obtener un diagnós-
El diagnóstico de lesiones pigmentadas en la piel se hace tico fiable. Por esta razón en los últimos años se han
generalmente mediante la apreciación visual empleando desarrollado investigaciones empleando técnicas ópticas
el método ABCD1 (asimetría, borde, color, dimensión), no invasivas que permiten diagnosticar lesiones y extraer
RCF vol. 27, No. 1, 2010. p.66
ISSN 1060992X, Optical Memory and Neural Networks (Information Optics), 2010, Vol. 19, No. 4, pp. 310–317. © Allerton Press, Inc., 2010.
Fluorescence and Noise Subtraction from Raman Spectra

by Using Wavelets
A. E. VillanuevaLunaa, J. CastroRamosa, S. VazquezMontiela, A. FloresGilb,
J. A. DelgadoAtencioa, and E. E. OrozcoGuillenc
aInstitutoNacional de Astrofíisica, Óptica y Electrónica. Luis Enrique Erro no. 1, Tonantzintla, Puebla, México
b
Universidad Autónoma del Carmen. C. 56, no. 4 por Avenida Concordia Cd. del Carmen, Campeche, México
cFacultad Experimental de Ciencia y Tecnología, Departamento de Física, Universidad de Carabobo,
C.P. 2005 ValenciaVenezuela
email: euge69869@yahoo.com
Received June 11, 2010; in final form July 26, 2010
Abstract—We develop a technique to remove the fluorescence background in the Raman spectrum.
The technique is based in wavelets theory, using symlets and biorthogonals wavelets, allowing us to
obtain better accuracy in the determination of spectral peaks. We test the method in Raman spectra
from 300–1800 (cm–1) range, of different biological samples, which were excited with a 785 nm laser,
and we were able to make assignation of spectral peaks of cow bone, diiodine drug, pig and chicken
bone. Our results of peaks assignation are somewhat comparable with those obtained with spectral
software, which is specialized to analyze astronomical spectra, that is based in polynomial fitting.
However, our method is friendly and easy to apply to Raman spectra.
Keywords: Raman Effect, denoising, fluorescence, wavelets.

DOI: 10.3103/S1060992X10040089
1. INTRODUCTION
Raman spectroscopy is an important analytical technique for chemical and biological analysis due to
the large amount of information that is obtained from the molecular structures, surface processes and
reactions in the interface that is extracted from the experimental data. In recent years have been applied
in medicine [1–3].
When the energy of the incident photon is unchanged after the collision with the molecule, the scat
tered photon has the same energy as the incident photon. This is Rayleigh scattering [4]. When energy is
transferred from the photon to the molecule or vice versa, the scattered photon has less or more energy
than the incident photon. This is Raman scattering. A Raman spectrum is a graph of scattered intensity as
a function of the difference in energy between the incident and scattered photons. The loss (or gain) in
energy of the photons corresponds to the difference in the levels of initial and final vibrational energy of
the molecule involved in the interaction. [5]. Raman signals are very weak and usually require medium
powerful sources and sensitive detectors. Typically, the Raman peaks are spectrally narrow and in many
cases may be associated with the vibration of a particular chemical bonding in the molecule.
The Raman signal is usually inherently weak, because low intensity laser light excitation has to be
employed in order to avoid tissue damage. Finally, the weak Raman signal interferes with fluorescence
emission. The effects of fluorescence can be eliminated by using nearinfrared excitation light, such as
that provided by the Nd:YAG laser or by using quenching processes [6]. Approaches using numerical data
processing have also been proposed for noise–signal ratio reduction, such as those employing the maxi
mum entropy method [7, 8]. Alternatively, Hasegawa has proposed the use of a numerical signal process,
principal component analysis (PCA), for separating the Raman spectrum from the fluorescence back
ground [9, 10]. An exhaustive overview of numerical data processing for removing background signals
from the Raman spectra has recently been reported by Schulze [11]. Among the various numerical filter
ing processes, the wavelet transform method has recently been proposed for suppressing noncorrelated
noise [12] and background [13] signals in the Raman spectra. Automated method for fluorescence sub
traction, based on a modification to least squares polynomial curve fitting was proposed for Mahadevan
310
Comparison of different kinds of skin using Raman spectroscopy
A. E. Villanueva-Luna1,*, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil1,2, J.A. Delgado-Atencio1
1
Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica Luis Enrique Erro #1, Tonantzintla, Puebla,
México.
2
Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida Concordia Cd. del Carmen, Campeche,
México.
Keywords: Raman spectroscopy, Symlets wavelets, Biorthogonals Wavelets, skin, cross

correlation.
Abstract
In this work we developed a novel technique to remove the fluorescence background in the
Raman spectrum. This technique permit us to obtain better accuracy in the spectrum peaks,
it is based in the wavelets theory, using symlets and biothogonals wavelets, therefore it is
adapting with the Raman Spectrum. We use a spectral range from 300 to 1800(cm-1), 785
nm laser excitation source and Oceans optics spectrometer was used. The experimental
samples were people with different kinds of skin, like brown, black and white. We compare
the differences between each Raman spectra, which permitted us to identified persons due
to accuracy of Raman spectroscopy. This results shows that Raman spectroscopy has
greatly precision in this field of biomedical optics.
1. Introduction
Raman spectroscopy is a sensitive, chemical specific analytical technique capable of
providing highly detailed biochemical information on tissue samples in vivo. Previous
experiments have demonstrated the ability of Raman spectroscopy to distinguish between
normal and malignant tissues[1–6] and in different grades of abnormal breast tissue.[7,8] It
has recently been shown that Raman spectroscopy is capable of distinguishing the two
types of calcification in excised breast tissue with a high degree of accuracy.[7] However,
until recently, it could be applied for probing tissue in depths of only several hundred
micrometers, due to the diffusely scattering nature of tissue preventing the formation of
sharp optical images required by confocal Raman microscopy. Raman spectroscopy, when
deployed in its conventional backscattering geometry to deep layer probing of turbid media
has an exceptionally strong bias to the surface layers of a sample, as we have shown earlier
[9]. This applies to both Raman and fluorescence signals and is highly undesirable in
noninvasive deep tissue Raman spectroscopy. Consequently, the Raman contributions from
the inner sample regions are often overwhelmed by those originating from the surface
layers e.g., melanin in surface layers of skin, leaving information relating to the internal
composition of the simple masked.
Optical Diagnostics and Sensing X: Toward Point-of-Care Diagnostics, edited by Gerard L. Coté,
Proc. of SPIE Vol. 7572, 75720M · © 2010 SPIE · CCC code: 1605-7422/10/$18 · doi: 10.1117/12.842843
Proc. of SPIE Vol. 7572 75720M-1

Mapping skin using Raman spectroscopy
A.E. Villanueva-Luna1*, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil2, J.A Delgado-
Atencio1, C.M. Ortiz-Lima1.
1
Departamento de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis Enrique
Erro #1 Tonantzintla, Puebla, Mexico.
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida Concordia Cd.
del Carmen, Campeche, México.
ABSTRACT
In this work we carried out a comparison and localization of skin Raman spectra. Measurements were made in regions where
Raman scatter is caused by the excitation source; we used the spectra overlap in a comparative way. Ten volunteers with
different skin colors participated in the experiment; body parts sampled were palm and dorsum of the hand. The excitation
wavelength used for this work was 785nm. A spectrometer with 6cm-1 resolution and spectral region range 0 to 2000 cm-1
was utilized. We used Matlab® to overlap and compare the differences between Raman spectra form different samples. We
found spectral variations that were caused by differences on the surface of the skin, such as scars and moles. This work helps
to identify potential undesirable behavior on the epidermis.
Key words: Raman spectroscopy, point to point method, skin.
I. INTRODUCTION
Raman spectroscopy can be used to construct images and maps, whose contrast is based on any sample property directly or
indirectly contained in the spectrum. The two major uses of Raman mapping are for determining relative chemical
composition and classifying them. Chemical composition is most commonly used to provide contrast in finding out spatial
distributions of chemical components. The intensity ratio of two components can also be used to determine their relative
composition. Some of the physical properties that influence the spectrum of a component are used to generate contrast.
Important examples include lattice strain and component orientation. Further chemical and physical properties can be
detected through parameters such as the center of gravity, area, and width of Raman bands [1].
The use of Raman imaging and microspectroscopy to monitor cellular events in living cells and its potential benefits to
biomedical applications was demonstrated by swain and Stevens [2]. NIR-FT-Raman spectroscopy was used to analyze
carotenoids in situ in intact plant material in which the pigments were present as traced components; it was aimed to obtain
spectra which provide reliable information regarding the structure of the analyzed carotenoids. Moreover, Raman mapping
technique was applied by Schultz et al. [3] to obtain deeper knowledge of the individual carotenoid distribution in various
intact plant tissues. Some selected Raman microspectroscopic maps, allowing 2 and 3-dimensional images of the investigated
plant samples, were obtained. The whole mapping area can be as big as 75mm x 650mm with increments of at least 5mm;
this was showed by Baranska et al. [4]. Kraft et al. [5] showed the first Raman spectroscopic maps on thin tissue sections on
primary intracranial tumors, such as schwannomas, meningeomas and gliomas, which were recorded in mapping mode. He
used cluster analyses on selected wavenumber regions and the results were applied for evaluation. The pseudocolor maps of
the cluster memberships and the cluster-averaged spectra were compared; after that, he reported mapping of mouse brain
tissue using a fiber optic probe. This probe was 12.7mm x 76 mm, therefore it was not suitable for endoscopic applications
such as for oesopheageal pre-cancer and cancer [6].
Veirs et al. [7] developed an analysis technique that enables us to produce maps of a chemical or physical property of a solid
sample, thousand times faster than single point techniques. Although they have used these data collection and analysis
methods only for Raman scattering, this is a general purpose approach and could be adapted to analyze data from other
spectroscopic techniques. Wood et al. [8] showed how Raman spectroscopy can be used to assess localized strains; first,
using this technique to calibrate doping profiles in silicon. Doping, itself, is the major contributor to strain in a device when
Optical Diagnostics and Sensing XI: Toward Point-of-Care Diagnostics; and Design and Performance Validation of
Phantoms Used in Conjunction with Optical Measurement of Tissue III, edited by Robert J. Nordstrom, Gerard L. Coté,
Proc. of SPIE Vol. 7906, 790610 · © 2011 SPIE · CCC code: 1605-7422/11/$18 · doi: 10.1117/12.874268
Proc. of SPIE Vol. 7906 790610-1
Downloaded from SPIE Digital Library on 04 May 2011 to 200.23.5.100. Terms of Use: http://spiedl.org/terms
Fabrication and characterization of phantoms made of
polydimethylsiloxane (PDMS)
A.E. Villanueva-Luna1*, A. Santiago-Alvarado2, J. Castro-Ramos1, B. Licona-Moran2, S.
Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil3, J.A Delgado-Atencio1.
1
Coordinación de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis Enrique
2
Universidad Tecnológica de la Mixteca, Carre. Acatlima Km. 2.5 Huajuapan de León,
Oaxaca. México.
3
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen, C. 56 #4 por Avenida Concordia
Cd. del Carmen, Campeche, México.
ABSTRACT
The transparent elastomer Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 is increasingly used in optical applications, as in
the manufacture of microlens, waveguides (optical fibers) and elaborated phantoms (simulator of biological tissue); The
wide range of applications is due to its excellent physic-chemical properties, its low cost, easy operation and null
toxicity. This paper describes the manufacturing process and physic-chemical characterization of Phantoms prepared
with PDMS as grid and doped with some elements present as Gliceryl, ink, glucose 10% and melanin provided by sigma
aldrich. We made phantoms with different concentrations and elements; we measured their profiles, and thicknesses.
Finally, we obtained their Raman Spectra. We present the experimental results obtained of the physic-chemical
parameters of the phantoms and the conclusions.
Keywords: PDMS, phantoms, Raman spectroscopy.

.
1. INTRODUCTION
The development of synthetic tissue (phantoms) to simulate the optical properties of biological tissues has become very
common in the literature due to these tissues can be used to experiment and calibrate the instruments used to assess tissue
in vivo or to simulate the optical behavior of certain tissues such as human skin [1], pancreas [2], breast structure etc. [3];
to do these, it has been developed various types of phantoms, such as liquids, rigid and soft phantoms, which are
prepared to simulate biological tissues that are object of study . Main contribution of phantoms is to reduce exposure to
radiation in living tissue and to allow the calibration of measurement instruments.
Fabrication of phantoms of polymeric material is relatively new; they offer the possibility of being manufactured and
endured in a short period of time. Their design is not complex and the production cost is low. In addition, their high
transparency, efficiency, and null toxicity [4], make them ideal in biomedical optics applications [5].
Recently one of the most active polymeric elastic materials of great interest due to market expectations and applications
reported in the literature is that called as polydimethylsiloxane PDMS Sylgar 184 [6, 7]. In the area of biomedical optics
it has been reported phantoms made with PDMS, ink and titanium oxide (TiO2) [5].
The optical properties exhibited by phantoms depend on their physical-chemical and manufacturing method employed. It
is important to understand these processes to produce synthetic phantoms with optical properties similar to human skin.
The manufacturing process of phantoms can be varied; some of them involve Sol-Gel method, other use hydrolysis and
polycondensation [8]. The concentration of components can be changed to obtain a mixture of them; using different
curing times and temperatures [9] so at specific combination of these parameters in the manufacturing process, it can be
produced phantoms with specific properties.
This paper proposes an alternative method, simple and no expensive to produce Phantoms PDMS-based, with elements
diffusers and absorbers (using ink, melanin, cholesterol, Gliceryl, glucose) and the physics-chemical characterization that
exhibit relevance for their use, which will determine whether these are viable phantoms optical comparison of properties
on human skin. Finally, it is summarized the parameters measured in phantoms made with different concentrations and
Proc. of SPIE Vol. 7906, 79060I · © 2011 SPIE · CCC code: 1605-7422/11/$18 · doi: 10.1117/12.874285
Proc. of SPIE Vol. 7906 79060I-1
Downloaded from SPIE Digital Library on 02 Sep 2011 to 141.211.69.111. Terms of Use: http://spiedl.org/terms
Raman spectra and optical coherent tomography images of skin
Atencio1, A.Vazquez-Villa1.
1
Coordinación de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis
Enrique Erro #1 Tonantzintla, Puebla, Mexico.
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida
Concordia Cd. del Carmen, Campeche, México.
ABSTRACT
The optical coherence tomography images are useful to see the internal profile and the structure of material samples. In
this work, OCT images were recorded in 10 volunteers with different skin tone which were related to Raman spectra.
The areas where we obtained OCT images and Raman spectra were a) index finger nail, b) between index finger and
middle finger, c) middle finger tip, d) half of middle finger, e) the thumb finger tip and f) between index finger and
thumb, areas measured were for the purpose of finding extracellular fluids with contain triglycerides, cholesterol and
glucose that are reported in the literature. The excitation wavelength used for this work was 785 nm, a spectrometer of
6 cm-1 resolution. The spectral region used ranges from 300 to 1800 cm-1. We use an OCT with 930 nm of Central
Wavelength, 1.6 mm of Image Depth, 6 mm of image width and 6.2 µm of axial resolution.
Key words: Skin, Raman spectroscopy, OCT, Wavelets.
1. Introduction
Optical imaging and spectroscopy have both been used to detect disease based on the analysis of tissue microstructure
and biochemical composition, no one method has demonstrated the spatial sensitivity and rapid data acquisition needed
for screening in combination with the high specificity required for reliable multiclass discrimination. Spectroscopy
excels at detecting molecular markers of disease with high specificity, while imaging excels in detecting tissue
microstructure with high sensitivity. In particular, near-infrared (NIR) Raman spectroscopy (RS) has been used for in
vivo detection of cancers in various organs [1]. RS is sensitive to vibrational modes in tissue and produces fingerprint
spectra characteristic of specific molecules and their environments, thus realizing unparalleled molecular specificity. A
recent comparison of Raman, fluorescence, and diffuse reflectance spectroscopy for breast cancer detection
demonstrated the superior specificity of RS in classifying disease [2]. The weak nature of RS requires integration times
of 3–30 s, limiting the technique to point measurements and motivating the need for image guidance to improve
sampling accuracy. A combined confocal microscopy–confocal RS device was developed to guide RS acquisition with
images of tissue microstructure [3], but confocal imaging depth in epithelial tissues is limited to ≈250 µm and the
transverse field-of-view (FOV) is limited to ≈500 µm. Combining the molecular specificity of RS with an imaging
method that has increased depth and larger FOV will yield a valuable tool for the early detection of disease. Optical
coherence tomography (OCT) can image over larger transverse areas of tissue (>5 mm) with micrometer scale
resolution, real-time speed, and sensitivity to microstructural features of disease [4].
Raman spectra of whole blood, serum, and Hb with the visible and NIR excitation have been reported also a
comparison of Raman spectra of whole blood and Hb with visible excitation, excitation in the 700–860 nm region, and
1064 nm excitation were made [5]. Using three set of experiments varying blood glucose concentration. In the first set,
large variations of blood glucose concentration (≈400mg/dl) and used 2100 OCT A scans for signal averaging. In the
second set, variations of blood glucose concentration by approximately 200mg/dl and used 8400 A scans for signal
averaging. In the third set improving OCT blood glucose monitoring by increasing and controlling skin temperature
under the OCT probe, results obtained suggest that the accuracy of OCT-based glucose monitoring is approaching that
of standard invasive and minimally invasive techniques [6]. There are a few articles which reviews many of the recent
advances in optical glucose sensing including optical absorption spectroscopy, polarimetry, Raman spectroscopy, and
fluorescent glucose sensing. Also a review of calibration and data processing methods useful for optical techniques are
Photonic Therapeutics and Diagnostics VII, edited by N. Kollias, et al., Proc. of SPIE Vol. 7883,
788310 · © 2011 SPIE · CCC code: 1605-7422/11/$18 · doi: 10.1117/12.874280
ENGINEERING
EDUCATION AND
RESEARCH USING MATLAB
Edited by Ali H. Assi
Contents
Preface IX
Chapter 1 Modeling and Simulation of Multiphase

Machines in the Matlab/Simulink Environment 1
Alberto Tessarolo
Chapter 2 De-Noising Audio Signals

Using MATLAB Wavelets Toolbox 25
Adrian E. Villanueva- Luna, Alberto Jaramillo-Nuñez,
Daniel Sanchez-Lucero, Carlos M. Ortiz-Lima,
J. Gabriel Aguilar-Soto, Aaron Flores-Gil and Manuel May-Alarcon
Chapter 3 A Matlab® Approach for

Implementing Control Algorithms in Real-Time: RTWT 55
Andres Hernandez, Adrian Chavarro and Robin De Keyser
Chapter 4 MatLab in Model-Based Design

for Power Electronics Systems 71
Adriano Carvalho and Maria Teresa Outeiro
Chapter 5 Mixed-Signal Circuits Modelling

and Simulations Using Matlab 113
Drago Strle
Chapter 6 Control Optimization Using MATLAB 149

Patic Paul Ciprian, Duta Luminita and Pascale Lucia
Chapter 7 MATLAB GUI Application for Teaching Electronics 171

Ali H. Assi, Maitha H. Al Shamisi and Hassan A. N. Hejase
Chapter 8 MATLAB-Assisted Regression Modeling of

Mean Daily Global Solar Radiation in Al-Ain, UAE 195
Hassan A. N. Hejase and Ali H. Assi
2
De-Noising Audio Signals

Using MATLAB Wavelets Toolbox
Adrian E. Villanueva- Luna1, Alberto Jaramillo-Nuñez1,
Daniel Sanchez-Lucero1, Carlos M. Ortiz-Lima1,
J. Gabriel Aguilar-Soto1, Aaron Flores-Gil2 and Manuel May-Alarcon2
1Instituto Nacional de Astrofisica, Optica y Electronica (INAOE)
2Universidad Autonoma del Carmen (UNACAR)
Mexico
1. Introduction
Based on the fact that noise and distortion are the main factors that limit the capacity of data
transmission in telecommunications and that they also affect the accuracy of the results in
the signal measurement systems, whereas, modeling and removing noise and distortions are
at the core of theoretical and practical considerations in communications and signal
processing. Another important issue here is that, noise reduction and distortion removal are
major problems in applications such as; cellular mobile communication, speech recognition,
image processing, medical signal processing, radar, sonar, and any other application where
the desired signals cannot be isolated from noise and distortion.
The use of wavelets in the field of de-noising audio signals is relatively new, the use of this
technique has been increasing over the past 20 years. One way to think about wavelets
matches the way how our eyes perceive the world when they are faced to different
distances. In the real world, a forest can be seen from many different perspectives; they are,
in fact, different scales of resolution. From the window of an airplane, for instance, the forest
cover appears as a solid green roof. From the window of a car, the green roof gets
transformed into individual trees, and if we leave the car and approach to the forest, we can
gradually see details such as the trees branches and leaves. If we had a magnifying glass, we
could see a dew drop on the tip of a leaf. As we get closer to even smaller scales, we can
discover details that we had not seen before. On the other hand, if we tried to do the same
thing with a photograph, we would be completely frustrated. If we enlarged the picture
"closer" to a tree, we would only be able to see a blurred tree image; we would not be able to
spot neither the branch, nor the leaf, and it would be impossible to spot the dew drop.
Although our eyes can see on many scales of resolution, the camera can only display one at
a time.
In this chapter, we introduce the reader to a way to reduce noise in an audio signal by using
wavelet transforms. We developed this technique by using the wavelet tool in MATLAB. A
Simulink is used to acquire an audio signal and we use it to convert the signal to a digital
format so it can be processed. Finally, a Graphical User Interface Development Environment
(GUIDE) is used to create a graphical user interface. The reader can go through this chapter
systematically, from the theory to the implementation of the noise reduction technique.
Low abundances of synthetics lipids in phantoms
A.E. Villanueva-Luna1*, A. Santiago-Alvarado2, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A.
Flores-Gil3, J. Aguilar Soto1, J.A Delgado-Atencio1.
1
2
Oaxaca. México.
3
Abstract
Phantoms simulate optical characteristics of tissues. Phantoms use to mimic light distributions in living tissue. Several
Phantoms compositions made of silicone, polyester, polyurethane, and epoxy resin have been described in the literature.
These kinds of phantoms have the problem of long time preservation. In this work, we describe the fabrication and
characterization of phantoms with low concentrations of synthetic lipid using Raman spectroscopy. We fabricate four
phantoms made of Polydimethylsiloxane (PDMS). These phantoms have synthetic lipid content of cholesterol and
triglycerides.
The size of our phantoms is 1 x 1 cm and 5 mm of thickness.We used the point-to-point mapping technique. Finally, we
compared advantages and performance of made PDMS and gelatin phantoms.
Keywords: PDMS, Raman spectroscopy, Mapping, cholesterol, triglycerides.
1. Introduction
There are many varieties of phantoms such as those made of gelatin, polyurethane, silicon, PDMS, etc. These varieties
try to minimize animal usage. A polydimethylsiloxane (PDMS)-based liver phantom was developed to mimic the optical
properties of porcine liver [1]. PDMS tissue phantoms to simulate melanomas of different thicknesses [2]. PPTR, OCT
and US measurements to recorded from PDMS tissue phantoms and results to compare in terms of axial imaging range,
axial resolution and imaging time [3]. PDMS is popular in the fabrication of microfluidic devices, phantom’s PDMS are
expected to provide powerful tools not only to better understand the biophysical behavior of blood flow in microvessels,
but also for disease diagnosis. PDMS polymers have many useful properties, including good optical transparency and
biocompatibility, easily reversible sealing to glass, elasticity, replication of fine and complex geometries, permeability to
gases, thermal stability, and low cost [4-7]. Because of these properties, this material was suitable for studying several
phenomena. PDMS phantoms are suitable for optical fluorescence imaging systems based on quantum dot
nanofluorophores in aqueous solution, and illustrate examples of phantom designs and measurements [8].
In this work, we present the fabrication and characterization of phantoms with low concentrations of synthetic lipid using
Raman spectroscopy. We fabricate four phantoms made of Polydimethylsiloxane (PDMS), as well as we fabricate the
same amount of phantoms with gelatin, these phantoms have synthetic lipid content of cholesterol and triglycerides. Our
phantoms size is 1 cm x 1 cm and 5 mm of thickness, and they were mapped using the point-to-point mapping technique.
Finally, we compared advantages and performance of phantoms made of PDMS and gelatin.
Optical Diagnostics and Sensing XII: Toward Point-of-Care Diagnostics; and Design and Performance Validation of
Phantoms Used in Conjunction with Optical Measurement of Tissue IV, edited by Robert J. Nordstrom, Gerard L. Coté,
Proc. of SPIE Vol. 8229, 82290S · © 2012 SPIE · CCC code: 1605-7422/12/$18 · doi: 10.1117/12.908386
Proc. of SPIE Vol. 8229 82290S-1
Downloaded from SPIE Digital Library on 28 Feb 2012 to 141.211.69.62. Terms of Use: http://spiedl.org/terms
Raman spectroscopy of blood in-vitro
A.E. Villanueva-Luna1*, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil2, C.M. Ortiz-
Lima1, J.A Delgado-Atencio1.
1
Departamento de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida Concordia
Abstract
We present Raman spectra from a sample of 8 volunteers that have different type of blood. The experimental data were
carried out using a 785 nm excitation laser and an ocean optics spectrometer of 6 cm -1 resolution, with a used spectral
region from 1000 to 1800 cm-1. We find Raman features at 1000 and 1542 cm-1 regarded with hemoglobin and its
derivatives. Also we find Raman features at 1248 and 1342 cm-1 that are now regarded with pure fibrin. In this work, we
use Principal Component analysis (PCA) to determine all variations of our samples, which allows us to define a
classification of the influence of the blood type. Finally, we found vibrational lines of cholesterol, glucose and
triglycerides that are reported in literature.
Keywords: Blood, Raman spectroscopy, sensors, PCA.
1. Introduction
There is considerable interest in advancing the science and technology of spectroscopic analysis of human tissue, either
qualitative and quantitative or in vitro and in vivo.
Raman spectroscopy has been used to analyze the structures of heme and hemoglobin in blood [1], to compare the
wavelength effects on whole blood and oxy-hemoglobin [2], to analyze oxygenated and deoxygenated erythrocytes [3],
and to analyze colored dyes as part of a stain on fibers and other surfaces [4].
Blood is a specialized bodily fluid in animals that delivers necessary substances such as nutrients and oxygen to the cells
and transports metabolic waste products away from those same cells.
A blood type (also called a blood group) is a classification of blood based on the presence or absence of inherited
antigenic substances on the surface of red blood cells (RBCs). These antigens may be proteins, carbohydrates,
glycoproteins or glycolipids, depending on the blood group system. Some of these antigens are also present on the
surface of other types of cells of various tissues. Several of these red blood cell surface antigens can stem from one allele
(or very closely linked genes) and collectively form a blood group system [5].
Hispanics are the most likely group to have O blood type. It is reported that 71% of blood donors in Mexico are type O;
54% of blood donors in Venezuela, and 62% in Guatemala are type O blood donors [6]. We show in the table 1 the
Hispanic blood type distribution. It shows that most of the Hispanic people are O+.
*
Correspondence to eug69869@yahoo.com
Proc. of SPIE Vol. 8229, 82291D · © 2012 SPIE · CCC code: 1605-7422/12/$18 · doi: 10.1117/12.908689
Proc. of SPIE Vol. 8229 82291D-1
Rev. Cub. Física vol. 27 No. 1 (2010) p.66-69 Revista Cubana de Física
ISSN: 0253-9268. Original paper
Calle I No. 302 e/ 15 y 17
Vedado, La Habana. CP 10400
TECNOLASER www.fisica.uh.cu/biblioteca/revcubfi/index.htm
2009
Diagnóstico de lesiones en la piel a partir de

espectros de reflexión difusa empleando algoritmos
computacionales: un estudio preliminar
E. E. Orozcoa, b, J. A. Delgadoa,c, S. Vázqueza, J. Castroa , A. E. Villanuevaa y F. Gutiérrez.
a) Instituto Nacional de Astrofísica Óptica y Electrónica, C.P 72000 Puebla, México. b) Facultad Expe-
rimental de Ciencia y Tecnología, Depto. de Física, Universidad de Carabobo, C.P.2005 Valencia-
Venezuela; eeorozco@uc.edu.ve†, c) Depto. de Física, Centro de Aplicaciones Tecnológicas y Desarrollo
Nuclear, CEADEN-CITMA, La Habana, Cuba, d) Centro de Estudios y Prevención del Cáncer
(CEPREC), Oaxaca, México.
†autor para la correspondencia
Recibido el 15/04/2009. Aprobado en versión final el 18/02/2010.
Sumario. La determinación del espectro de reflexión difusa de la piel humana en el rango espectral de 400 nm-1000 nm
empleando espectrómetros de fibras ópticas es una técnica no invasiva ampliamente usada para estudiar los parámetros
ópticos de este órgano, brinda información sobre las propiedades de absorción y de esparcimiento de la luz que pueden
ser empleadas para estudiar la morfología y fisiología del tejido y poder detectar y diagnosticar enfermedades de la piel
en su etapa inicial. En este trabajo se propone un algoritmo computacional para la selección de los atributos más rele-
vantes de los espectros de reflexión difusa en la piel humana obtenidos con un sistema experimental que consta básica-
mente de un espectrómetro, una fuente de luz blanca y una sonda de fibra óptica bifurcada que permite enviar y colectar
la luz. Para clasificar la señal espectral se ha diseñado una interfaz gráfica en Matlab2006© que hace uso de las máqui-
nas de soporte vectorial y se ha utilizado un algoritmo de selección de atributos que permite alcanzar una sensibilidad y
especificidad superior al 80% y una exactitud en la clasificación del 85%.
Abstract. The determination of diffuse reflection spectrum on human skin in the spectral range from 400nm-1000nm
using an optical fiber spectrometers is a non-invasive technique widely used to study the optical parameters of this tis-
sue, provides information about the absorption and scattering properties of light that can be employed to study the mor-
phology and physiology of the tissue and to detect and diagnose skin diseases in early stages. In this paper a computa-
tional algorithm for the selection of the most important attributes of diffuse reflection spectra of human skin obtained
with an experimental system that basically consists of a spectrometer, a white light source and bifurcated fiber optic
probe that allows send and collect light. To classify the spectral signal was designed a Matlab2006© graphical interface
which use support vector machines and algorithm for selecting attributes that allows to achieve a sensitivity and speci-
ficity exceeding 80% and 85% of accuracy in the classification.
Palabras clave. Tissue Damage 87.85.em, Pattern Recognition 42.30.Sy, Cancer 87.19.xj
1 Introducción principalmente del color y el borde, la biopsia aún se

mantiene como la regla de oro para obtener un diagnós-
El diagnóstico de lesiones pigmentadas en la piel se hace tico fiable. Por esta razón en los últimos años se han
generalmente mediante la apreciación visual empleando desarrollado investigaciones empleando técnicas ópticas
el método ABCD1 (asimetría, borde, color, dimensión), no invasivas que permiten diagnosticar lesiones y extraer
RCF vol. 27, No. 1, 2010. p.66
parámetros ópticos en tejidos biológicos2-4. Vapnik11 y han ganado mucha popularidad debido a sus
La Espectroscopia de Reflexión Difusa (ERD) es una características y rendimiento, éstas permiten enfrentar
técnica óptica no invasiva que ha sido ampliamente usa- problemas de clasificación en dominios complejos y
da para la caracterización de los tejidos biológicos5-8. pueden ser usadas para extraer información relevante a
Con la ERD se puede obtener información sobre las pro- partir de conjuntos de datos y construir algoritmos de
piedades de absorción y de esparcimiento del tejido. El clasificación eficientes y rápidos para datos masivos.
principio fundamental para diagnosticar enfermedades
con técnicas espectroscópicas consiste en construir algo-
ritmos robustos que permitan extraer las características
más importantes de la señal espectral y correlacionarlas
con su respectiva patología9.
Las Máquinas se Soporte Vectorial (MSV), son una
herramienta computacional empleada para discriminar
patrones o conjuntos de identidades que comparten algu-
na característica que las diferencia de otras. El objetivo
de este trabajo es implementar un sistema de clasifica-
ción empleando MSV para diferenciar el tejido biológico
sano del tejido lesionado a partir del espectro de re-
flexión difusa en la piel, para ello se propone pre-
procesar la señal espectral y seleccionar los atributos
más relevantes con un algoritmo de búsqueda como el
Best-First y finalmente colocar todos los procesos com-
putacionales en una interfaz gráfica que permita al usua-
rio leer los datos obtenidos mediante ERD y clasificarlos
para diagnosticar lesiones en piel.
2 Materiales y método
Figura 1. Diagrama esquemático del arreglo experimental
La colección de los espectros de reflexión difusa en la
piel humana fue obtenida de 95 pacientes voluntarios
que asistieron a una campaña de prevención del cáncer
de piel promovida por el Centro de Estudios y Preven-
Figura 2. Hiperplano
ción de Cáncer (CEPREC) en la ciudad de Juchitán de de separación
Zaragoza en el estado de Oaxaca, México.
Sistema Experimental. El arreglo experimental
empleado se muestra en la figura 1 y consiste de un es-
pectrómetro USB4000 equipado con un detector CCD
Toshiba de 3648 píxeles, una fuente de luz HL2000 op- Las MSV, aplicadas a problemas de clasificación,
timizada para el VIS-NIR (360-2000nm), una sonda de mapean los datos a un espacio de características alto-
fibra óptica bifurcada (R600\7\VIS\125F), un patrón de dimensional, donde se puede encontrar más fácilmente
reflexión (Teflón) y un computador con el software un hiperplano de separación. Este mapeo puede ser lle-
SpectraSuite que calcula automáticamente el porcentaje vado a cabo aplicando una función tipo Kernel que trans-
de luz reflejada mediante la siguiente expresión mate- forma implícitamente el espacio de entrada en un espacio
mática10. de características de mayor dimensión. El hiperplano de
S(λ ) − D(λ ) separación es calculado maximizando la distancia de los
%R(λ ) = × 100% (1) patrones más cercanos.
R mr (λ ) − D(λ ) Considerando un conjunto de datos de entrenamiento
donde S(λ ) es la señal del medio analizado (Piel) para {x i , yi } con i = 1,....m, yi ∈ {−1,1} y x i ∈ R d . Existe
cada longitud de onda (λ ) , D(λ ) es la señal de oscuri-
un hiperplano, como se muestra en la figura 2, que sepa-
dad y R mr (λ ) es la muestra de referencia. ra las etiquetas positivas y negativas tales que:
Es importante mencionar que el espectro de reflexión w ⋅ x i + b ≥ 1 − ξi para y i = 1
difusa se ha medido cinco veces en el sito de la lesión y (2)
en una zona adyacente a la misma. w ⋅ x i + b ≤ −1 − ξi para y i = −1 (3)
ξi ≥ 0, ∀i , donde w es la normal al hiperplano y ξi
3 Máquinas de soporte vectorial son las variables introducidas por los errores de clasifi-
cación en calidad de violaciones del hiperplano de forma
Los fundamentos de la MSV han sido desarrollados por
tal que ∑ ξi sea la cota de error de clasificación.
RCF vol. 27, No. 1, 2010. p.67
4 Pre-procesado de la señal espectral y mediante el clasificador (MSV). Para tener una certera
selección de atributos estimación de la calidad del subconjunto de característi-
cas seleccionado, se usa la técnica de validación cruzada
Una forma general de llevar a cabo el proceso de clasifi- con K particiones y determinamos el error promedio que
cación consiste en la separación de elementos de un hemos obtenido al realizar las K pruebas, así obtenemos
una aproximación del error del clasificador. La exactitud
conjunto {x} en diferentes subconjuntos
del clasificador empleando k=10 fue de 84.128.
x i = {1, 2...m} denominados clases, con base en las ca-
racterísticas medidas de los elementos de x . Determi-
nando las propiedades del subconjunto en los cuales
puede ser clasificado el conjunto original (modelo), los
elementos de éste son comparados con cada modelo pa-
ra indicar a cuál clase pertenecen.
Una vez obtenidos los cinco espectros de reflexión di-
fusa (E1,…E5), se procede a eliminar la columna corres-
pondiente a la longitud de onda en cada espectro me-
diante un programa implementado en Matlab©, poste-
riormente se calcula el promedio %R de las cinco medi-
das realizadas y finalmente se normaliza el promedio ob-
tenido % R N , el siguiente paso es seleccionar del total de
3161 elementos (atributos) los más relevantes (AR) de
forma que se pueda reducir la cantidad de atributos para
emprender el proceso de clasificación empleando MSV.
Figura 3. Esquema general del Pre-procesado de los datos.
En la figura 3 se describe en forma de esquema este pro-
ceso.
El proceso de selección de los atributos más relevan-
tes de la columna normalizada con la información de la
reflexión se llevó a cabo empleando el software de códi-
go abierto WEKA, para el cual se deben preparar pre-
viamente los datos con las características exigida por el
programa, este proceso fue realizado mediante un pro-
grama implementado en Matlab©. El algoritmo de bús-
queda empleado es un algoritmo de búsqueda incremen-
tal que utiliza información de búsquedas previas a pro-
blemas similares de forma más rápida que realizando ca-
da búsqueda partiendo de cero12. En este caso se ha em-
pleado Best-First, el cual busca en el espacio de los sub-
conjuntos de atributos utilizando la estrategia greedy
Hill-climbing con backtracking. La dirección de la bús-
queda realizada por Best-First fue hacia adelante par-
tiendo del conjunto vacío de atributos. Figura 4. Espectros de reflexión difusa para un tejido sin le-
sión y uno lesionado.
5 Resultados
Los espectros de reflexión difusa de un tejido lesionado
y una zona circundante sin lesión, se muestran en la fi-
gura 4. En ésta se puede apreciar cómo la señal espectral
es menor en el tejido lesionado, además en el espectro
del tejido sano se observa el típico patrón “W” relacio-
nado con la presencia de la sangre en la dermis en la re-
gión entre 500 nm y 600 nm.
En el proceso de aprendizaje y prueba del sistema de
clasificación con MSV cada espectro fue tratado como
un vector de 14 atributos, después de haber realizado el
respectivo proceso de selección de atributos para obtener
los más relevantes.
Una vez generada la función modelo con el conjunto Figura 5. Imagen de la interfaz gráfica desarrollada en Ma-
de entrenamiento, procedemos a realizar la evaluación tlab.
RCF vol. 27, No. 1, 2010. p.68

El análisis de la validez de una prueba diagnóstica Referencias
puede obtenerse calculando los valores de la sensibilidad
y la especificidad13. La sensibilidad es la probabilidad 1. T. B. Fitzpatrick, R. A. Johnson, K. Wolf and D. Suur-
de clasificar correctamente a un individuo enfermo y por mond, “Atlas en color y sinopsis de dermatología clínica”,
lo tanto indica la capacidad para detectar la enfermedad McGraw Hill Interamericana, Madrid (2001).
y se puede determinar mediante la siguiente expresión: 2. Y. N. Mirabal, S. K. Chang, E. N. Atkinson, A. Mal-
pica, M. Follen, and R. R. Richards-Kortum, “Reflectance
VP spectroscopy for in vivo detection of cervical precancer” J.
Sensibilidad = (4)
VP + FN Biomed. Opt. 7, 587-594 (2002).
donde VP son los verdaderos positivos y FN los falsos 3. F. Koenig, R. Larne, H. Enquist, F. J. McGovern, K. T.
negativos, por su parte la especificidad es la probabilidad Schomacker, N. Kollias, and T. F. Deutsch, “Spectroscopic
de clasificar correctamente a un individuo sano, y se cal- measurement of diffuse reflectance for enhanced detection of
cula con la siguiente expresión: bladder carcinoma,” Urology 51, 342-345 (1998).
4. M. C. Skala, G. M. Palmer, K. M. Vrotsos, A. Gen-
VN dron-Fitzpatrick, and N. Ramanujam, “Comparison of a physi-
Especificidad = (5)
VN + FP cal model and principal component analysis for the diagnosis
en este caso VN son los verdaderos negativos y FP los of epithelial neoplasias in vivo using diffuse reflectance spec-
falsos positivos. troscopy” Opt. Express 15, 7863-7875 (2007).
Finalmente los resultados obtenidos para clasificar 20 5. V. P. Wallace, D. C. Crawford, P. S. Mortimer, R. J.
Ott and J. C. Bamber, “Spectrophotometric assessment of pig-
espectros: 10 con lesiones y 10 sin lesiones son los si-
mented skin lesions: methods and feature selection for evalua-
guientes: Sensibilidad: 81.81%; Especificidad: 88.88%; tion of diagnostic performance”, Phys. Med. Biol. 45, 735-
Exactitud: 85%. 751(2000).
En la figura 5 se muestra la interfaz gráfica que fue 6. J. J. Scarisbrick, C. D. O. Pickard, A. C. Lee, G. M.
diseñada en Matlab para procesar y clasificar los espec- Briggs, K. Johnson, S. G. Bown, M. Novelli, M. R. S.
tros de reflexión difusa. Como se puede apreciar en la fi- Keshtgar, I. J. Bigio, R. Yu, “Elastic scattering spectroscopy in
gura, la interfaz cuenta con dos botones que permiten the diagnosis of pigmented lesions: comparison with clinical
cargar los datos de la señal espectral: uno para el sitio de and histopathological diagnosis", Proc. SPIE 5141, 147-156
referencia (sano) y otro para la lesión, un tercer botón (2003).
7. I. J. Bigio and J. R. Mourant, “Ultraviolet and visible
que permite mostrar en pantalla las gráficas de los datos
spectroscopies for tissue diagnostics: fluorescence spectros-
cargados, así como también la fotografía del área de es- copy and elastic-scattering spectroscopy'', Phys. Med. Biol. 42,
tudio, y por último, el botón más importante que corres- 803-813 (1997).
ponde a la clasificación del espectro que se ha cargado 8. M. G. Muller, T. A. Valdez, I. Georgakoudi, V. Back-
con la etiqueta de lesión. man, C. Fuentes, S. Kabani, N. Laver, Z. Wang, C. W. Boone,
R. R. Dasary, S. M. Shapshay, S. M. Feld, “Spectroscopic de-
6 Conclusiones tection and evaluation of morphologic and biochemical
changes in early human oral carcinoma”, Cancer 97, 1681-
1692 (2003).
El estudio presentado demuestra que la técnica de es-
9. W. Lin, X Yuan, P Yuen, WI Wei, J Sham. PC Shi,
pectroscopia de reflexión difusa es una técnica óptica
“Classification of in vivo autofluorescence spectra using sup-
no invasiva que acompañada de un sistema de clasifi- port vector machines”. J Biomed. Opt.9, 180-186 (2004).
cación eficiente permite diferenciar el tejido sano del 10. Oceans Optics, SpectraSuite Installation and Operation
tejido lesionado. El resultado de 85% de exactitud en Manual, Document Number 000-20000-300-02-0607.
la clasificación demuestra que las Máquinas de Sopor- 11. V. Vapnik, Controlling the Generalization Ability of
te Vectorial pueden ser empleadas como una herra- Learning Processes in The Nature of Statistical Learning The-
mienta para discriminar lesiones en la piel. Finalmente ory, pp. 93-99 (Springer-Verlag, 2000).
la Interfaz gráfica desarrollada permite a los usuarios 12. Sven Koenig, Maxim Likhachev, Yaxin Liu, David
no familiarizados con las herramientas computaciona- Furci, “Incremental Heuristic Search in Artificial Intelligence”,
Artificial Intelligence Magazine 25, (2), 99-112, (2004).
les empleadas, poder clasificar lesiones a partir de los
13. D. G. Altman., J.M. Bland., “Statistics Notes: Diagnos-
espectros de reflexión difusa. tic tests 2: predictive values”. British Medical Journal, 9, 309,
(1994).
RCF vol. 27, No. 1, 2010. p.69

ISSN 1060992X, Optical Memory and Neural Networks (Information Optics), 2010, Vol. 19, No. 4, pp. 310–317. © Allerton Press, Inc., 2010.
Fluorescence and Noise Subtraction from Raman Spectra

by Using Wavelets
A. E. VillanuevaLunaa, J. CastroRamosa, S. VazquezMontiela, A. FloresGilb,
J. A. DelgadoAtencioa, and E. E. OrozcoGuillenc
aInstitutoNacional de Astrofíisica, Óptica y Electrónica. Luis Enrique Erro no. 1, Tonantzintla, Puebla, México
b
Universidad Autónoma del Carmen. C. 56, no. 4 por Avenida Concordia Cd. del Carmen, Campeche, México
cFacultad Experimental de Ciencia y Tecnología, Departamento de Física, Universidad de Carabobo,
C.P. 2005 ValenciaVenezuela
email: euge69869@yahoo.com
Received June 11, 2010; in final form July 26, 2010
Abstract—We develop a technique to remove the fluorescence background in the Raman spectrum.
The technique is based in wavelets theory, using symlets and biorthogonals wavelets, allowing us to
obtain better accuracy in the determination of spectral peaks. We test the method in Raman spectra
from 300–1800 (cm–1) range, of different biological samples, which were excited with a 785 nm laser,
and we were able to make assignation of spectral peaks of cow bone, diiodine drug, pig and chicken
bone. Our results of peaks assignation are somewhat comparable with those obtained with spectral
software, which is specialized to analyze astronomical spectra, that is based in polynomial fitting.
However, our method is friendly and easy to apply to Raman spectra.
Keywords: Raman Effect, denoising, fluorescence, wavelets.

DOI: 10.3103/S1060992X10040089
1. INTRODUCTION
Raman spectroscopy is an important analytical technique for chemical and biological analysis due to
the large amount of information that is obtained from the molecular structures, surface processes and
reactions in the interface that is extracted from the experimental data. In recent years have been applied
in medicine [1–3].
When the energy of the incident photon is unchanged after the collision with the molecule, the scat
tered photon has the same energy as the incident photon. This is Rayleigh scattering [4]. When energy is
transferred from the photon to the molecule or vice versa, the scattered photon has less or more energy
than the incident photon. This is Raman scattering. A Raman spectrum is a graph of scattered intensity as
a function of the difference in energy between the incident and scattered photons. The loss (or gain) in
energy of the photons corresponds to the difference in the levels of initial and final vibrational energy of
the molecule involved in the interaction. [5]. Raman signals are very weak and usually require medium
powerful sources and sensitive detectors. Typically, the Raman peaks are spectrally narrow and in many
cases may be associated with the vibration of a particular chemical bonding in the molecule.
The Raman signal is usually inherently weak, because low intensity laser light excitation has to be
employed in order to avoid tissue damage. Finally, the weak Raman signal interferes with fluorescence
emission. The effects of fluorescence can be eliminated by using nearinfrared excitation light, such as
that provided by the Nd:YAG laser or by using quenching processes [6]. Approaches using numerical data
processing have also been proposed for noise–signal ratio reduction, such as those employing the maxi
mum entropy method [7, 8]. Alternatively, Hasegawa has proposed the use of a numerical signal process,
principal component analysis (PCA), for separating the Raman spectrum from the fluorescence back
ground [9, 10]. An exhaustive overview of numerical data processing for removing background signals
from the Raman spectra has recently been reported by Schulze [11]. Among the various numerical filter
ing processes, the wavelet transform method has recently been proposed for suppressing noncorrelated
noise [12] and background [13] signals in the Raman spectra. Automated method for fluorescence sub
traction, based on a modification to least squares polynomial curve fitting was proposed for Mahadevan
310
FLUORESCENCE AND NOISE SUBTRACTION FROM RAMAN SPECTRA 311
Jansen [14]. Camerlingo proposed a method for extract the signal without fluorescence background using
biorthogonal wavelets [15].
In this paper is proposed a method to subtract efficient fluorescence and shot noise, using symlets and
biorthogonals wavelets due to ability for adapting different variations of Raman spectra, our method is adap
tive, easy to use and friendly access, moreover, this method can help to recognize easily spectral lines in
Raman spectra and shows how it works well compared with an astronomical software such as IRAFTERM®.
In section two review key concepts of wavelets are described, moreover the processing method. In sec
tion three experimental setup is shown. In the section four results and different spectral lines assignation
are given. In last section conclusions are presented.
2. DATA PROCESSING METHOD

Raman spectroscopy gives the dependence of the intensity due to inelastic scattered light on the
Raman shift (1/λ) of photons after their interaction with the material. The resulting spectrum can be
assimilated as a space modulated signal f(x) where the Raman shift stands for the space coordinate x. The
wavelet algorithm cuts up the signal f(x) into different frequency components. The Fourier transform, tra
ditionally used in signal processing, does the same, though it cannot conserve information on the spatial
signal form. In contrast, wavelet decomposition uses spatially localized functions with average zero value
(namely wavelets, small waves). Basically, the signal f(x) is represented in terms of the sum of elementary
wavelets and decomposed into two signals, one containing the low frequency components and the other
the fluctuations. A hierarchical representation of the data set is thus obtained allowing a multiresolution
analysis, known as discrete wavelet transform (DWT), in which details or fluctuations of different levels of
resolution are represented by the superposition of wavelets with suitable dilation [15].
2.1. Theory of Wavelet Transforms

The WT of a onedimensional signal f(t) can be defined by
W f ( a, b ) = 〈 f ( t ), ψ a, b〉 = f ( t )ψ ⎛ ⎞ dt,

1 t–b
aR ∫ ⎝ a ⎠
(1)
where a, b ∈ R and a ⫽ 0. Ψa, b(t) denotes a kernel of WT, or wavelet basis. Let a = 2m, b = n2m and Ψm, n(t) =
2–m/2Ψ(2–mt – n), m, n ∈ Z, then the discrete form of Eq. (1) can be described as
+∞
∫ f ( t )ψ
– m/2
W f ( m, n ) = 2 m, n ( t ) dt. (2)
–∞
For a set of given discrete orthonormal basis, Ψm, n(t), the signal f(t) can be decomposed as
f(t) = ∑
m, n ∈ Z
〈 f ( t ), ψ m, n ( t )〉 ψ m, n ( t ). (3)
A discrete fast algorithm was proposed by Mallat [16], where the discrete signal f(t) is assumed to be
0
described by { C n }, n ∈ Z and m, n(x) can be described by a family of discrete filters H = {hl}, l ∈ Z and
0
G = {gm}, m ∈ Z, then C n can be decomposed as
+∞
∑h
m m–1
Cn = k – 2n C k , (4)
k = –∞
+∞
∑g
m m–1
Dn = k – 2n C k , (5)
k = –∞
where m is the decomposition scale, Cm

and D m represent the lowpass and highpass components of the
signal, called mth scale discrete approximation and discrete detail, respectively.
According to the theory of the wavelet transform, C m and D m correspond to the low and highfre
quency components of C m – 1, respectively, i.e. Cm is the component of C m – 1 with its frequency lower than
2m, and Dm is the component with its frequency between 2m and 2m + 1.
OPTICAL MEMORY AND NEURAL NETWORKS (INFORMATION OPTICS) Vol. 19 No. 4 2010
312 VILLANUEVALUNA et al.
2.2. Characterization of Noise

Proper data filtering requires a good understanding of the nature of noise. In Raman spectroscopy,
noise contains contributions from a number of sources, but in dispersive CCD Raman spectrometers noise
is usually governed by the sample shot noise limit σy [4] described by the equation.
σy = S + B, (6)
where S is the Raman signal and B is the background signal. Different types of noise can be presented in
a measured spectrum. Depending on the time dependence of its statistics, noise can be classified as sta
tionary (homoscedastic) or nonstationary (heteroscedastic) if any of these statistics is time varying.
Raman spectra with minimized instrumental sources of noise and noise controlled by signal and back
ground exhibit nonstationary behavior. To detect nonstationary noise behavior, information on the time
dependence of the noise is necessary. Since the WT provides information in the time and frequency
domain, it is well suited to obtain this information.
2.3. Denoising
Multiscale filtering using wavelets is based on the observation that random noise in a signal is present
in all the coefficients while deterministic changes are captured in a small number of relatively large coef
ficients. Hence noise is removed by a threestep method:
(1) The noisy signal is transformed into the time–frequency domain by decomposing the signal into a
set of orthonormal wavelet basis functions.
(2) The detail coefficients are thresholded by suppressing coefficients below a selected threshold value.
(3) The thresholded coefficients are transformed back into the original domain to obtain the original
spectra without the noise.
2.4. Threshold Selection and Thresholding

Selecting the threshold value is a critical step in the filtering process since the accuracy of the recon
structed signal depends on the optimized criterion. Several methods have been proposed for threshold selec
tion [17]. Standard methods include a level by level timedependent threshold [18], which is one of the most
commonly used in signal denoising. For suppression coefficients there are two main approaches in WT: hard
thresholding and soft thresholding [19]. In addition to these two methods, another recent method also takes
into account the information about the neighbouring detail coefficients [20]. The main difference that the
authors propose is to threshold the empirical detail coefficients in groups rather than individually [13].
Our processing method follows two stages; in the first stages, the Raman spectrum is denoised by sym
lets wavelets due to their properties. They are nearly symmetric, orthogonal and biorthogonal [21]. We use
sym 6, these symlets are part of the wavelets toolbox of Matlab® (Mathworks Inc.). The choice of perfect
level depends of shape of Raman spectrum. More levels imply lost of information. Using level 5 was
enough for high denoising in Raman spectrum.
In the second stage, we use Biorthogonal wavelets based on the Bspline functions which were
employed in order to ensure symmetry and the precise reconstruction of the signal [22, 23]. The approx
imation coefficients are filtered using a soft thresholding whereas the detail coefficients are filtered using
a hard thresholding. Hence to remove background from the spectrum, the approximation coefficients
related to the background are set to zero, and those related to the signal are shrunk. This strategy is optimal
for signals with a uniform background; however, this is not the case for Raman signals, which have been
proven to have a fluctuating background.
The data were processed numerically by using the software package “wavelet toolbox”, part of the MATLAB
2006a® program (by The MathWorks Inc.). The decomposition of the signal was performed up to the level
n = 8 using biorthogonal wavelets Bior 6.8, with 6th and 8th order filter algorithms involving 17 and 11 data
points, respectively [15]. Starting from the decomposed parts, the signal can be reconstructed by inverted dis
crete wavelet transform (IDWT). If the last approximation component is not included in the IDWT process,
then the smoother part of the signal is removed. In the case of a Raman spectrum, this background signal
component is mainly caused by light diffusion and fluorescence processes.
PC spectrometer
RIPRPB
LASER
sample
Fig. 1. Experimental setup.
1.00
(a)
Relative intensity, a. u
0.95
0.90
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Raman shift, cm–1
1.00
(b)
0.98
0.96
0.94
0.92
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
1.0
(c)
0.5
–0.5
–1
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
Fig. 2. Different stages of processing Raman spectra. (a) raw data, (b) denoising signals and (c) data using biortogonals
wavelets.
1.0
(a)
0.8
0.6
0.4
0.2
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
1.0
(b)
0.5
–0.5
–1.0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
1.0
(c)
0.8
0.6
0.4
0.2
–0.2
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
Fig. 3. Diiodine. (a) Original spectrum, (b) processing Raman spectrum, and (c) astronomical software spectrum.
3. EXPERIMENTAL METHOD
The Raman spectrometer employed for this work was the QE6500 by Oceans Optics, this spectrometer
has a resolution of 0.14–7.7 nm FWHM (~6 cm–1), also enables integration time from 8 ms to 15 min, we
used the spectral ranges that goes from 300 to 1800 cm–1. The arrangement covers an experimental laser
as excitation source of 785 nm. We used inphotonics Raman probe RIPRPB with two fibers, one is a col
lector and the other one is used for the excitation source, core diameter are 200 μm and 90 μm respectively.
This Raman probe has a focal length of 7.5mm. Figure 1 shows the experimental setup that was employed.
Figure 2 describes different stages of processing Raman spectra. Figure 2a shows the raw data, in
Fig. 2b we show the Raman spectrum without noise using sym 6 and Fig. 3c shows the final spectrum that
1.0
(а)
0.8
0.6
0.4
0.2
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
1.0
(b)
0.5
–0.5
–1.0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
Fig. 4. Pig bone (a) Original spectrum, (b) processing Raman spectrum.
was obtained using biorthogonals wavelets. All spectrums that we acquire were using powers between 30 to
120 mW and integration times from 1 to 40 s.
4. RESULTS
Several Raman spectrums were analyzed using proposed processing method with different samples. It
shows the Raman spectra that got from Raman spectrum after 40 seconds of integration time. Spectral
assignations were obtained using a trial version of RAMalyze [24].
The diiodine drug spectrum is complicated to describe in shape, it’s necessary a high order polynomial
function. Figure 3 shows the final spectrum and principals spectral lines that are 385, 503, 625 and
895 cm–1 that correspond, Si–O–C Def, C–Br Stretch, C–C Def and Ring, C–H Bend, Alkene and
OOP respectively.
Figure 3b shows the proposed processing method and 3c shows results obtained in astronomical soft
ware. As seen in Fig. 3b spectrum bands that are between 400 and 600 cm–1, with proposed processing
method was enhance, making them better able to distinguish the main spectral line which retains its char
acteristics and the other lines can be easily distinguished.
The pig bone has a different fluorescence background its Raman spectrum is shown in Fig. 4b which
shows several principals spectral lines at 382, 647, 735, 953, 1043, 1165, and 1653 cm–1 that correspond
C–CN deformation, O=C–N– Bend, C–H Rock, C Skeletal and Secondary OH, C–O Stretch, C–CO
and Skeletal and C=O Stretch and Amido respectively.
Using astronomical software Legendre functions of 25 orders for diiodine. Spline 3 function of 3 orders
and boxcar 5 to obtain similar results in pig bone was needed. To use astronomical software it is necessary
to know very well the software and have large enough experience in processing spectrum.
1.00
(a)
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
1.0
(b)
0.5
–0.5
–1.0
–1.5
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift, cm–1
Fig. 5. Chicken bone, (a) raw data and (b) processed data.
The chicken bone has a different fluorescence background its Raman spectrum is shown in figure 5b
which shows several principals spectral lines at 564, 726, 897, 957, 1063, 1251, 1296 and 1633 cm–1 that
correspond C–H Rock, C–H Bend, Alkene and OOP, C Skeletal and Secondary OH, C–O Stretch,
C–H/C–S, CH2 Wagging, C–H Bend and CH3, C=O Stretch and Amido respectively.
The advantages of this processing method does not need find any polinomial, it is adapted for any spec
trum, and it is possible remove background fluorescence and shot noise that appear in the Raman spec
trum. This technique can be the easy to programming and it is an alternative for enhance Raman spec
trums. Astronomical software is a complex and not friendly software.
5. CONCLUSIONS
We compare the peaks determination of our method, with that obtained with the astronomical soft
ware, and the results are somewhat comparable. Instead of use largeorder polinomial function to fit the
spectrum, our method basically removes background fluorescence and shot noise using lower levels of
wavelet. The method allows us to determine with large accuracy the well documented peaks of different
biological samples.
REFERENCES
1. MahadevanJansen, A. and RichardsKortum, R., Raman Spectroscopy for Detection of Cáncer and Precan
cers, J. Biomed. Optics, 1996, vol. 1 pp. 31–70.
2. Koo, T.W., Berger, A.J., Itzkan, I., Horowitz, G., and Feld, M.S., Reagentless Blood Analysis by NearInfrared
Raman Spectroscopy, Diabetes Technology and Therapeutics, 1999, vol. 1, no. 2, pp. 153–157.
3. Shih, W.C., Bechtel, K., and Feld, M.S., Intrinsic Raman Spectroscopy for Quantitative Biological Spectros
copy, Part II: Experimental Applications, MS. Optics Express, 2008, vol. 16, no. 17, pp. 12737–12745.
4. Requena, A.Y. and Zúñiga, J., Espectroscopía, España: Prentice Hall, 2004.
5. Smith, E. and Dent, G., Modern Raman Spectroscopy: Practical Approach, USA, 2005.
6. Ke, W. and Wu, J., Comparison of Several Methods of Fluorescence Quenching in Protein Molecules Spectro
chim., Acta A 51 L25, 1995.
7. Greek, L., Shane, L., Schulze, H.G., Blades, M.W., Bree, A.V., Gorzalka, B.B., and Turner, R.F.B., SNR
Enhancement and Deconvolution of Raman Spectra Using a TwoPoint Entropy Regularization, Appl. Spec
trosc., 1995, vol. 49, p. 425.
8. Craggs, C., Galloway, K.P., and Gardiner, D.J., Maximum Entropy Methods Applied to Simulated and
Observed Raman Spectra, Appl. Spectrosc. 1996, vol. 50 p. 43.
9. Venkatakrishna, K., Kurien, J., Pai, K.M., Valiathan, M., Kumar, N.N., Krishna, C.M., Ullas, G., and
Kartha, V.B., Optical Pathology of Oral Tissue: a Raman Spectroscopy Diagnostic Method, Curr. Sci., 2001,
vol. 80, p. 665.
10. Hasegawa, T., Nishijo, J., and Umemura, J., Separation of Raman Spectra from Fluorescence Emission by
Principal Component Analysis, Chem. Phys. Lett., 2000, vol. 317, p. 642.
11. Schulze, G., Jirasek, A., Yu, M.M.L., Lim, A., Turner, R.F.B., and Blades, M.W., Investigation of Selected
Baseline Removal Techniques as Candidates for Automated Implementation, Appl. Spectrosc., 2005, vol. 56,
p. 54.
12. Cai, W., Wang, L., Pan, Z., Zuo, J., Xu, C., and Shao, X., Application of the Wavelet Transform Method in
Quantitative Analysis of Raman Spectra, J. Raman Spectrosc., 2001, vol. 32, p. 207.
13. Cai, T.T., Zhang, D., and BenAmotz, D., Enhanced Chemical Classification of Raman Images Using Multi
resolution Wavelet Transformation, Appl. Spectrosc., 2001, vol. 55, p. 1124.
14. Lieber, C.A. and MahadevanJansen, A., Automated Method for Subtraction of Fluorescence from Biological
Raman Spectra, Applied Spectroscopy, 2003, vol. 7, no. 11.
15. Camerlingo, C., Zenone, F., Gaeta, G.M., Riccio, R., and Lepore, M., Wavelet Data Processing of Micro
Raman Spectra of Biological Samples, Meas. Sci. Technol., 2006, vol. 17, pp. 298–303.
16. Mallat, S., Wavelets Tours of Signal Processing, Academic press, 1999.
17. Walczak, B., Wavelets in Chemistry, Amsterdam: Elsevier, 2000.
18. Misiti, M., Misiti, Y., Oppenheim, G., and Poggi, J.M., Wavelet Toolbox User’s Guide, Massachusetts: Math
Works, 2000.
19. Alsberg, B.K., Woodward, and Kell, D.B., An Introduction to Wavelet Transform for Chemometricians,
Chemom. Intell. Lab. Syst., 1997, vol. 37.
20. Cai, T.T., On Block Thresholding in Wavelet Regression: Adaptivity, Block Size, and Threshold Level, Stat. Sin.,
2002, vol. 12, pp. 1241–1273 .
21. Swee, E.G.T. and Elangovan, S., Applications of Symlets for Denoising and Load Forecasting (Proc. of the IEEE
Signal Processing Workshop On), 1999.
22. Cohen, A., Daubechies, I., and Feauveau, J., Biorthogonal Bases of Compactly Supported Wavelets, Commun.
Pure Appl. Math., 1992, vol. 45, pp. 485–493.
23. Daubechies, I., Ten Lectures on Wavelets (CBMSNSF Series in Applied Mathematics, vol. 61), Philadelphia,
PA: SIAM, 1992.
24. http://www.labcognition.com/.
Comparison of different kinds of skin using Raman spectroscopy
A. E. Villanueva-Luna1,*, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil1,2, J.A. Delgado-Atencio1
1
Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica Luis Enrique Erro #1, Tonantzintla, Puebla,
México.
2
Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida Concordia Cd. del Carmen, Campeche,
México.
Keywords: Raman spectroscopy, Symlets wavelets, Biorthogonals Wavelets, skin, cross

correlation.
Abstract
In this work we developed a novel technique to remove the fluorescence background in the
Raman spectrum. This technique permit us to obtain better accuracy in the spectrum peaks,
it is based in the wavelets theory, using symlets and biothogonals wavelets, therefore it is
adapting with the Raman Spectrum. We use a spectral range from 300 to 1800(cm-1), 785
nm laser excitation source and Oceans optics spectrometer was used. The experimental
samples were people with different kinds of skin, like brown, black and white. We compare
the differences between each Raman spectra, which permitted us to identified persons due
to accuracy of Raman spectroscopy. This results shows that Raman spectroscopy has
greatly precision in this field of biomedical optics.
1. Introduction
Raman spectroscopy is a sensitive, chemical specific analytical technique capable of
providing highly detailed biochemical information on tissue samples in vivo. Previous
experiments have demonstrated the ability of Raman spectroscopy to distinguish between
normal and malignant tissues[1–6] and in different grades of abnormal breast tissue.[7,8] It
has recently been shown that Raman spectroscopy is capable of distinguishing the two
types of calcification in excised breast tissue with a high degree of accuracy.[7] However,
until recently, it could be applied for probing tissue in depths of only several hundred
micrometers, due to the diffusely scattering nature of tissue preventing the formation of
sharp optical images required by confocal Raman microscopy. Raman spectroscopy, when
deployed in its conventional backscattering geometry to deep layer probing of turbid media
has an exceptionally strong bias to the surface layers of a sample, as we have shown earlier
[9]. This applies to both Raman and fluorescence signals and is highly undesirable in
noninvasive deep tissue Raman spectroscopy. Consequently, the Raman contributions from
the inner sample regions are often overwhelmed by those originating from the surface
layers e.g., melanin in surface layers of skin, leaving information relating to the internal
composition of the simple masked.
Optical Diagnostics and Sensing X: Toward Point-of-Care Diagnostics, edited by Gerard L. Coté,
Proc. of SPIE Vol. 7572, 75720M · © 2010 SPIE · CCC code: 1605-7422/10/$18 · doi: 10.1117/12.842843

In this paper, Raman spectra were obtained from 10 different individuals taken as samples
to make the necessary comparisons which were made using cross-correlation. When
performing the cross correlation between samples, Raman spectra were processed using the
wavelet transforms technique, which combine symlets and biorthogonals wavelets. After
performing the cross correlation a comparison between the Raman spectrum of the sample
clearer and darker were found differences of intensity will be described principally.
2. Data processing method
Raman spectroscopy gives the dependence of the intensity due to inelastic scattered light on
the Raman shift (1/λ) of photons after their interaction with the material. The resulting
spectrum can be assimilated as a space modulated signal f(x) where the Raman shift stands
for the space coordinate x. The wavelet algorithm cuts up the signal f(x) into different
frequency components. The Fourier transform, traditionally used in signal processing, does
the same, though it cannot conserve information on the spatial signal form. In contrast,
wavelet decomposition uses spatially localized functions with average zero value (namely
wavelets, small waves). Basically, the signal f(x) is represented in terms of the sum of
elementary wavelets and decomposed into two signals, one containing the low frequency
components and the other the fluctuations. A hierarchical representation of the data set is
thus obtained allowing a multi-resolution analysis, known as discrete wavelet transform
(DWT), in which details or fluctuations of different levels of resolution are represented by
the superposition of wavelets with suitable dilation [10].
2.1 Theory of wavelet transforms
The WT of a one-dimensional signal f (t) can be defined by
1 ⎛t −b⎞
W f (a, b) = f (t ),ψ a ,b =
a
∫ f (t )ψ ⎜⎝
R
⎟dt ,
a ⎠
(1)
where a, b ∈ R and a ≠ 0. Ψ a, b(t) denotes a kernel of WT, or wavelet basis. Let a = 2m,
b=n2m and Ψ m, n (t)= 2-m/2Ψ(2-mt-n), m, n ∈ Z, then the discrete form of equation (1) can be
described as
+∞
W f (m, n) = 2− m /2 ∫
−∞
f (t )ψ m ,n (t )dt. (2)
For a set of given discrete orthonormal basis, Ψm,n(t), the signal f(t) can be decomposed as

f (t ) = ∑
m ,n∈Z
f (t ),ψ m, n (t ) ψ m, n (t ). (3)
A discrete fast algorithm was proposed by Mallat [11], where the discrete signal f(t) is
assumed to be described by {C0n}, n ∈ Z and Ψm.n(x) can be described by a family of
discrete filters H={hl}, l ∈ Z and G= {gm}, m ∈ Z, then C0n can be decomposed as
+∞
Cnm = ∑h
k =−∞
k −2 n Ckm −1 , (4)
+∞
Dnm = ∑g
k =−∞
k −2 n Ckm −1 , (5)
where m is the decomposition scale, Cm and Dm represent the low-pass and high-pass
components of the signal, called mth scale discrete approximation and discrete detail,
respectively.
According to the theory of the wavelet transform, Cm and Dm correspond to the low- and
high-frequency components of Cm-1, respectively, i.e. Cm is the component of Cm-1 with its
frequency lower than 2m, and Dm is the component with its frequency between 2m and 2m+1.
The data were processed numerically by using the software package ‘wavelet toolbox’, part
of the MATLAB 2006a® program (by The MathWorks Inc.). The decomposition of the
signal was performed up to the level n = 8 using biorthogonal wavelets Bior 6.8, with 6th
and 8th order filter algorithms involving 17 and 11 data points, respectively[10]. Starting
from the decomposed parts, the signal can be reconstructed by inverted discrete wavelet
transform (IDWT). If the last approximation component is not included in the IDWT
process, then the smoother part of the signal is removed. In the case of a Raman spectrum,
this background signal component is mainly caused by light diffusion and fluorescence
processes.
3. Experimental method
The Raman spectrometer employed for this work was the QE6500 of Oceans Optics, this
spectrometer has a resolution of 0.14-7.7 nm FWHM (~ 6cm-1), also enables integration
time from 8 ms to 15 min , we used the spectral ranges that goes from 300 to 1800 cm-1.
The arrangement covers an experimental laser as excitation source of 785 nm. We used
inphotonics Raman probe RIP-RPB with two fibers, one is a collector and the other one is
used for the excitation source, core diameter are 200 μm and 90 μm respectively. This
Raman probe has a focal length of 7.5mm. Figure 1 shows the experimental setup that was
employed.

Figure 1 experimental setup
4. Results
In this is section will describe the Raman spectra obtained from people who were used as
sample.
In Mexico is difficult to find individuals with white Caucasian skin, as such what was taken
as white skin, is a type of brown skin clear. The types of samples of volunteers to take
Raman spectra are shades of brown, for that reason the structural behavior of the Raman
spectrum has the same form. We only find variations in intensity. All these Raman spectra
were taken using 150mW and 10 seconds of integration time. We measure at wrist, because
this part always gives the sun even if we use long-sleeved shirt. Table 1 shows the different
skin tones used to make this work, it can be seen that there is no similar single equal signs.
Table 1 Different kind of skins that were used as samples
S1 S6
S2 S7
S3 S8
S4 S9
S5 S10
We compare the spectra obtained from different volunteers. This comparison was done
using cross-correlation method.
Cross correlation consider two real valued functions f and g that differ only by a shift along
the x-axis. One can calculate the cross-correlation to figure out how much g must be shifted

along the x-axis to make it identical to f. The formula essentially slides the g function along
the x-axis, calculating the integral of their product for each possible amount of sliding.
When the function s match, the value of f*g is maximized. The reason for this is that when
lumps (positives areas) are aligned, they contribute to making the integral larger. Also,
when the troughs (negative areas) align, they also make a positive contribution to the
integral because the product of two negative numbers is positive. Table 2 shows the cross
correlation performed on all samples between them. In this table you can see that the best
case is cross-correlation between samples S6 and S2, which has a value of 0.9618, which is
very good. The worst case is between samples S4 and S10, which has a value of 0.6064.
Table 2 Results of comparison between samples
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
S1 1 0.9324 0.9549 0.8014 0.7787 0.8959 0.9365 0.8455 0.8507 0.7646
S2 0.9324 1 0.92 0.8939 0.8008 0.9618 0.9076 0.9164 0.8874 0.7043
S3 0.9549 0.92 1 0.771 0.7066 0.8746 0.9181 0.8068 0.7872 0.6497
S4 0.8014 0.8939 0.771 1 0.8502 0.9164 0.8053 0.8481 0.9118 0.6064
S5 0.7787 0.8008 0.7089 0.8502 1 0.8340 0.8819 0.7845 0.9524 0.7868
S6 0.8959 0.9618 0.8746 0.9164 0.8340 1 0.8961 0.9243 0.9053 0.6862
S7 0.9365 0.9076 0.9181 0.8053 0.8819 0.8961 1 0.8536 0.9068 0.7959
S8 0.8455 0.9164 0.8068 0.8481 0.7845 0.9243 0.8536 1 0.8718 0.7819
S9 0.8507 0.8874 0.7872 0.9118 0.9524 0.9053 0.9068 0.8718 1 0.7924
S10 0.7646 0.7646 0.6497 0.6064 0.7868 0.6862 0.7959 0.7819 0.7924 1
Figure 2 shows the major event of cross-correlation was obtained, as shown in the figure
are very similar between the Raman spectra, thus sampling it was obtained mathematically
by making the cross correlation is correct. Figure 3 show the worst case cross correlation
was obtained and this figure show that differences are substantial and Raman spectra
intensities are appreciable.
200 300
S2 S4
Relative intensity (A.U)
S6 200 S10
100
100
0
0
-100
-100
-200 -200
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift (cm -1) Ram an shift (cm -1)
Figure 2 The best cross correlation that was found between Figure 3 The worst case of cross correlation that was found
S6 and S2 between S4 and S10

Figure 4 shows the comparison between samples S4, S10 and S1, in which one can see that
the sample S1 is an individual with lighter skin tone than other 2 samples.
Figure 5 compares samples of individuals with fair skin, as you can see the behavior of its
Raman spectrum is similar, can be found only small variations in intensity between
samples.
300 200
S1 S2

200 S4 S6
S10 100 S8
100
0
0
-100
-100
-200 -200
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Ram an shift (cm -1) Raman shift (cm -1)
Figure 4 Raman spectra of similar color samples Figure 5 Raman spectra of clear Brown samples
In Figure 6 the comparison was made between samples of dark tone, this comparison
reveals a similarity in the structural form between the spectra being compared.
In Figure 7, A randomized comparison was made between 3 different samples, this

comparison was made to illustrate the differences that can be obtained without knowing
that we are comparing these samples.
300 200
S5 S1
S7
200 S2
S9 100 S8
100
0
0
-100 -100
-200 -200
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Ram an shift (cm -1) Ram an shift (cm -1)
Figure 6 Raman spectra of dark brown samples Figure 7 Raman spectra of S1, S2 and S8
In Figure 8 the comparison was made between the skin sample that had light brown and
dark brown sample. Raman spectra after being processed by wavelet shows variations in
intensity, these variations were found at different Raman shift, these peaks are located at
540, 662,678,892,946,1255 and 1500 cm-1.

200
S2

S10
100
-100
-200
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift (cm -1)
Figure 8 a comparison between sample clear brown and dark brown
All differences of intensities are due to kinds of skins that were used as samples. This
differences are at 540 cm-1 is ν(S-S) trans-gauche-trans (aminoacid cysteine), 662 cm-1 is
C-S stretching mode of cystine (collagen type I), Polypeptides amide IV bend and Glycerol.
ν(C-S) gauche (aminoacid methionine), 678 cm-1 is Ring breathing modes in the DNA
bases G (ring breathing modes in the DNA bases)/C-20-endo-anti, 803 cm-1 is ν sym O-P-O
and DNA,892 cm-1 is DNA,946 is C-C (protein), 1255 cm-1 is Lipids and Amide III (arising
from coupling of C-N stretching & N-H bonding; can be mixed with vibrations of side
chains), 1500 cm-1 is NH3 and Amide II (largely due to a coupling of CN stretching & in-
plane bending of the N-H group, is not often used for structural studies per se because it is
less sensitive & is subject to interference from absorption bounds of amino acid side chain
vibrations).
5. Conclusions
The peak of the melanin wanted to find was not significant enough to highlight in this
paper. The results show that the processing method used highlights the peaks and are easier
to identify. For this reason it is easier to recognize peaks due to lipids, proteins, amino acids
and polypeptides.
The results found show the versatility for using Raman spectroscopy for biological
applications, this study found differences in intensity of the Raman spectrums obtained.
The processing methods employed are useful to show Raman bands that are relevant to the
analysis. We found at 946 cm-1 main variation.

6. References
[1]Weng, S. F. , Ling, X. F. , and Song, Y. Y. , “FTIR fiber optics and FT-Raman
spectroscopic studies for the diagnosis of cancer,” Am. Clin. Lab. 19, 20 (2000).
[2]Dukor,R. K. , Liebman, M. N. , and Johnson, B. L, “A new, nondestructive
method for analysis of clinical samples with FT-IR microspectroscopy. Breast
cancer tissue as an example,” Cell Mol. Biol. (Paris) 44, 211–217 (1998).
[3]Bakker Schut, T. C. ,Witjes, M. J. H. ,Sterenborg, H. J. C. M. ,Speelman, O. C ,
Roodenburg,J. L. N. ,Marple, E. T. ,Bruining, H. A. , and Puppels, G. J. , “In vivo
detection of dysplastic tissue by Raman spectroscopy,” Anal. Chem. 72, 6010–
6018, (2000).
[4] Mahadevan-Jansen, A. and Richards-Kortum,R. R. , “Raman spectroscopy for
the detection of cancers and precancers,” J. Biomed. Opt. 1, 31–70 (1996).
[5]Stone, N. Kendall, C.,Shepherd, N.,Crow, P. , and Barr, H. , “Near-infrared
Raman spectroscopy for the classification of epitelial pre-cancers and cancers,” J.
Raman Spectrosc. 33, 564–573 (2002).
[6]Stone, N. Kendall, C. , Smith, J. ,Crow, P. , and Barr, H. , “Raman spectroscopy
for identification of epithelial cancers,” Faraday Discuss. 126, 141–157 (2003).
[7]Haka, A. S. ,Shafer-Peltier,K. E. ,Fitzmaurice, M. , Crowe, J. ,Dasari, R. R. , and
Feld, M. S. , “Identifying differences in microcalcifications in benign and malignant
breast lesions by probing differences in their chemical composition using Raman
spectroscopy,” Cancer Res. 62, 5375–5380 (2002).
[8]Rehman, S. , Revell, P. A. , and Rehman, I. , “Analysis of breast cáncer tissues
by Fourier transform infrared rapid scan imaging,” J. Clin. Oncol. 23, 216S–216S
(2005).
[9]Matousek, P. and Parker, A. W. , “Bulk Raman analysis of pharmaceutical
tablets,” Appl. Spectrosc. 60, 1353–1357 (2006).
[10] Camerlingo,C., Zenone, F., Gaeta, G.M. , Riccio, R.,Lepore, M., "Wavelet data
processing of micro-Raman spectra of biological samples", Meas. Sci. Technol. 17,
298-303 (2006).
[11]S. Mallat,[Wavelets tours of signal processing], Academic press,(1999).

Mapping skin using Raman spectroscopy
Atencio1, C.M. Ortiz-Lima1.
1
Departamento de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis Enrique
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida Concordia Cd.
del Carmen, Campeche, México.
ABSTRACT
different skin colors participated in the experiment; body parts sampled were palm and dorsum of the hand. The excitation
wavelength used for this work was 785nm. A spectrometer with 6cm-1 resolution and spectral region range 0 to 2000 cm-1
was utilized. We used Matlab® to overlap and compare the differences between Raman spectra form different samples. We
found spectral variations that were caused by differences on the surface of the skin, such as scars and moles. This work helps
to identify potential undesirable behavior on the epidermis.
Key words: Raman spectroscopy, point to point method, skin.
I. INTRODUCTION
Raman spectroscopy can be used to construct images and maps, whose contrast is based on any sample property directly or
indirectly contained in the spectrum. The two major uses of Raman mapping are for determining relative chemical
composition and classifying them. Chemical composition is most commonly used to provide contrast in finding out spatial
distributions of chemical components. The intensity ratio of two components can also be used to determine their relative
composition. Some of the physical properties that influence the spectrum of a component are used to generate contrast.
Important examples include lattice strain and component orientation. Further chemical and physical properties can be
detected through parameters such as the center of gravity, area, and width of Raman bands [1].
The use of Raman imaging and microspectroscopy to monitor cellular events in living cells and its potential benefits to
biomedical applications was demonstrated by swain and Stevens [2]. NIR-FT-Raman spectroscopy was used to analyze
carotenoids in situ in intact plant material in which the pigments were present as traced components; it was aimed to obtain
spectra which provide reliable information regarding the structure of the analyzed carotenoids. Moreover, Raman mapping
technique was applied by Schultz et al. [3] to obtain deeper knowledge of the individual carotenoid distribution in various
intact plant tissues. Some selected Raman microspectroscopic maps, allowing 2 and 3-dimensional images of the investigated
plant samples, were obtained. The whole mapping area can be as big as 75mm x 650mm with increments of at least 5mm;
this was showed by Baranska et al. [4]. Kraft et al. [5] showed the first Raman spectroscopic maps on thin tissue sections on
primary intracranial tumors, such as schwannomas, meningeomas and gliomas, which were recorded in mapping mode. He
used cluster analyses on selected wavenumber regions and the results were applied for evaluation. The pseudocolor maps of
the cluster memberships and the cluster-averaged spectra were compared; after that, he reported mapping of mouse brain
tissue using a fiber optic probe. This probe was 12.7mm x 76 mm, therefore it was not suitable for endoscopic applications
such as for oesopheageal pre-cancer and cancer [6].
Veirs et al. [7] developed an analysis technique that enables us to produce maps of a chemical or physical property of a solid
sample, thousand times faster than single point techniques. Although they have used these data collection and analysis
methods only for Raman scattering, this is a general purpose approach and could be adapted to analyze data from other
spectroscopic techniques. Wood et al. [8] showed how Raman spectroscopy can be used to assess localized strains; first,
using this technique to calibrate doping profiles in silicon. Doping, itself, is the major contributor to strain in a device when
Proc. of SPIE Vol. 7906, 790610 · © 2011 SPIE · CCC code: 1605-7422/11/$18 · doi: 10.1117/12.874268
measuring doping with spatial resolution of 1 µm, when using a nondestructive technique. Three different Raman
microspectroscopic imaging methodologies, using a single experimental configuration, are compared; namely, point and line
mapping, as representatives of serial imaging approaches, and direct or widefield Raman imaging employing liquid-
crystalline tunable filters. These three methodologies are surveyed on this work, just as they were presented by Schluker et al.
[9]. In addition, Feasibility of mapping when using a Raman probe for automated classification of tissue pathology is
presented. Raman mapping using a miniature probe has real clinical applications for in vivo pathology mapping and in
surgical margin assessments. Pathology assessment of excised tissue of resected oesophageal specimens following radical
and palliative oesophagectomy procedures for both pathology diagnosis and margin assessment was reviewed by Stone et al.
[10].
different skin colors participated in the experiment; body parts sampled were palm and dorsum of the hand.
II. Mapping Methods
The three general methods for constructing a Raman maps and image proposed and demonstrated in 1975 remain in use
nowadays, but with vastly improved technology. They are point focusing and point-by-point scanning, line focusing and line-
by-line scanning, and widefield illumination and imaging detection (also called global illumination).
Line scanning offers a more rapid image generation method. In this method the laser is focused on a line, usually with a
cylinder lens. Due to lens focuses a Gaussian beam to a high aspect ratio, only the central portion of the beam is usable. This
problem can be overcome with a Powell lens [11], which does focus the beam into a uniform intensity high aspect rectangle.
In the most popular scanning configuration, the line-focused beam is stationary and the object is translated beneath it.
In global illumination a narrowband filter can be used for Raman imaging. The first successful modern instrumentation
employed an interference filter, which could be tilted to vary the passband [12]. Subsequently, acousto-optic tunable filters
(AOTF) [13] and liquid crystal tunable filters (LCTF) [14] were introduced into Raman imaging that provided electronic
tunabililty. The tunable filter approach has proven most useful for measurement of isolated bands. If only a few frames are
needed to define the band, global Raman imaging can be quite rapid. Where there are many overlapping bands or a non-linear
background, many images must be taken at different Raman shifts, and the time advantage disappears.
In point by point mapping, either laser is point focused, and the object under test is translated past the laser focus, or the focus
is raster scanned across the object. Motor-driven x–y stages are the most commonly used devices for translating the object.
While the stages available as accessories for research microscopes can be positioned with accuracy better than ±1 μm and can
be stepped in 0.1μm increments, they must be allowed to settle for about 0.5 s to achieve this accuracy [8]. The settling time
can add significant delay to the overall image acquisition, when the integration time at each pixel is only a second or a few
seconds. Despite the dead time problem, motor-driven stages remain popular with vendors and end users. An important
reason is that the stages are useful both for microscopic mapping and for larger scale mapping, because the most common
models are capable to move 10–20cm in each axis.
There are several scan methodologies that reduce dead time. One method is to use a faster translation stage. An x–y stage
driven by piezoelectric translators is preferred, because these stages settle in 0.001s or less. While they can be incremented in
steps as small as 10–20nm, most of them are flexure (one-piece) designs and are capable to move only a few millimeters in
either direction. Alternatively, the laser beam itself can be scanned, as commonly done in confocal microscopy. Crossed
galvanometer-driven mirrors, with acousto-optic translators have been used for this purpose.
III. Experimental setup
We built a system were a laser is point focused, and the object under test is translated past the laser focus. The motorized xy
stage can be positioned with accuracy of 6 μm. The width of the laser spot is 200 μm, for that reason more than the minimum
movement overlaps previously measured. Due to maps that are shown in this study is 5 by 5 mm, with a spatial resolution of
500 microns per step. Control system of xy stage was designed in LabVIEW® and the focus system was built, using a
PIC16F877A microcontroller. The excitation wavelength used for this work is 785 nm, a spectrometer with 6 cm-1 of
resolution and the spectral region used ranges from 0 to 2000 cm-1 .The arrangement used is shown in Fig. 1.
Figure 1 Experimental setup
IV. Results
We use 5 seconds of integrations time per each grid that was sampled. Complete maps take 500 s to obtain the complete skin
morphology. We use 40 mW of power to make each map, and we take all our samples at 7.5 mm that is the focal distance of
Raman probe. We show 20 to 50 areas in the maps that are presented just to show the behavior of all data that were collected.
Figure 2 shows the mesh used to make maps of the skin, its dimensions are 5 mm x 5 mm, and the distance between points is
500 microns. This type of mapping allows us to see the changes from skin lesions, moles, acne and scars in any part of the
area to be sampled.
Figure 2 Mesh 5 x5 mm that is use for make maps of skin
Figure 3 shows the variations in different areas of the mesh when constructing the map. With this method of drawing the grid
on the sample, performed by the control system of the x-y stage, we can distinguish the change on the sampled area. This
allows differentiating healthy tissue and tissue with a mole or scarring. The differences obtained may be due to collagen, in
the case of the scars and slight variations when the skin under study has moles on the area of interest; as well, these
differences depend on the size and color of the mole.
Figure 3 Raman spectra of different areas of mesh
Figure 4 left, shows the spectrum taken from the palm, the area that was sampled was on the edge of the right hand, figure 4
right, present the effect of three-dimensional data. Raman spectra noticed significant differences at 548, 741, 1057, 1119,
1464 cm-1 this is because the palm skin does not have a uniform surface for that reason we have variations in spectral lines.
Figure 4 Raman spectra map of palm of hand. Left show 20 areas of Raman map and right show 3 dimensional behavior
our data.
Figure 5-left, shows Raman spectra taken from the back of the hand; this was taken from a volunteer at the right hand. The
behavior of these four spectra is similar to each other, showing only little variation. Figure 5-right, shows three dimensional
Raman spectra. In this graph we can see that the Raman bands are the same size and no significant variation is presented. We
found differences at 460, 564, 885, 1089, 1173 and 1782 cm-1, these are related with collagen 1 and amide II.
Figure 5 Raman spectra map of dorsum hand. Left show 20 areas of Raman spectra collected and right show 3 dimensional behaviors of
our Raman spectra.
Figure 6 left, shows a map in an area of skin with similar spectral lines characteristics, the area sampled was in the middle of
the middle finger. Figure 6 right, displays the behavior of all the Raman spectra contained in the map. This map provides
information about few variations of collagen in an area with similar characteristics.
Figure 6 Raman spectra map of skin with similar characteristics. Left show 20 areas of our Raman spectra map and right show 3D
behaviors of our Raman spectra map.
Figure 7 left, shows the Raman spectrum of a localized area in the little finger, in which the area sampled is located 2 moles,
which have different colors, changes in the intensity of Raman spectra is greater when in the area of moles. The differences
are clearly seen in Figure 7 right, is a three dimensional representation of the Raman spectra obtained in the map.
Figure 7 Raman spectra map of changes by moles. Left show 50 areas of Raman spectra map and right show 3D behavior of Raman
spectra.
Figure 8 left, shows the Raman spectrum obtained by making a map in an area close to the scars, the spectra of the areas 20-
40, show similar characteristics, after the zone 40 have scarred skin. Figure 8 right, displays the three-dimensional map in
which you can tell the difference mentioned. Spectral lines differences are related with collagen I.
Figure 8 Raman spectra map of changes by scars. Left show 50 areas of our Raman spectra map and right 3D behaviors of our Raman
spectra.
Differences in collagen are due to changes in the surface of the skin contain higher concentration of collagen that are related
with scars and moles.
V. Conclusions
The maps shown in this paper presents changes in collagen, and amide II found in nearby areas due to variations on surface
of skin. The greatest differences were found in the spectral lines are at 548, 741, 1057, 1119, 1464, 460, 564, 885, 1089,
1173, 1782 cm-1. This type of mapping is economical, because you do not need a microscope to make the sweep.
VI. ACKNOWLEDGEMENTS
The authors gratefully acknowledge funding from CONACYT project #40086-F and Daniel Sanchez Lucero for his help in
the XY stage.
VII. References
[1] Matousek,P. and Morris, M. D.,[Emerging Raman Applications and Techniques in Biomedical and Pharmaceutical
Fields], Springer-Verlag Berlin Heidelberg , 97-110 (2010).
[2] Swain, R. J., and Stevens, M.M., “Raman microspectroscopy for non-invasive biochemical analysis of single cells”,
Biochemical society Transactions, Vol. 35 part 3 (2007).
[3] Schulz H., Baranska M., Baranski R., “Potential of NIR-FT-Raman Spectroscopy in Natural Carotenoid Analysis”,
Biopolymers, Vol. 77, 212–221 (2005).
[4] Baranska,M., Schulz, H., Rosch,P., Strehle, M. A., and Popp, J.,” Identification of secondary metabolites in medicinal
and spice plants by NIR-FT-Raman microspectroscopic mapping”, Analyst, 129 , 926 – 930 (2004).
[5] Krafft, C., Kirsch, M., Beleites, C., Schackert, G. and Salzer, R., “Methodology for fiber-optic Raman mapping and FTIR
imaging of metastases in mouse brains,” Anal Bioanal Chem 389(4), 1133-1142 (2007).
[6] Krafft,C., SobottkaS. B., Schackert G and Salzer R “Raman and infrared spectroscopic mapping of human primary
intracranial tumors: a comparative study” J. Raman Spectrosc.; 37: 367–375 (2006).
[7] Kirk Veirs, D., Ager 111, J. W., Loucks,E. T. and Rosenblatt, G.M, “Mapping materials properties with Raman
spectroscopy utilizing a 2-D detector” Appl. Opt. 29, 4969-4980 (1990).
[8] Wood, D., Cooper, G., Gardiner, D. J, Bowden, M., “Raman spectroscopy as a mapping tool for localized strain in
microengineered structures” Journal of materials science letters 16 1222–1223 (1997).
[9]Schlücker, S., Schaeberle, M. D.,. Huffman, S. W., and. Levin I. W.,” Raman Microspectroscopy: A Comparison of Point,
Line, and Wide-Field Imaging Methodologies”, Anal. Chem., 75 (16), pp 4312–4318(2003).
[10] Hutchings, J.; Kendall, C.; Shepherd, N.; Barr, H.; Day, J.; Stone, N., “Ultra-low spatial resolution Raman mapping
using a novel fibre optic probe”, In Biomedical Vibrational Spectroscopy IV: Advances in Research and Industry;
Mahadevan-Jansen, A.; Petrich, W., Eds.; SPIE: San Francisco, California, USA; pp. 75600N-9 (2010).
[11] Kenneth A. Christensen and Michael D. Morris, "Hyperspectral Raman Microscopic Imaging Using Powell Lens Line
Illumination," Appl. Spectrosc. 52, 1145-1147 (1998)
[12] Batchelder, D. N., Cheng, C. and David Pitt, G. Molecular imaging by Raman microscopy. Advanced Materials, 3: 566–
568 (1991).
[13] Lewis, E.N., Treado, P.J. and Levin, I.W, "A Miniaturized, No-Moving-Parts Raman Spectrometer," Appl. Spectrosc.
47, 539-543 (1993).
[14] Morris, H.R., Hoyt, C.C., and Treado, P.J., "Imaging Spectrometers for Fluorescence and Raman Microscopy: Acousto-
Optic and Liquid Crystal Tunable Filters," Appl. Spectrosc. 48, 857-866 (1994).
Fabrication and characterization of phantoms made of
polydimethylsiloxane (PDMS)
A.E. Villanueva-Luna1*, A. Santiago-Alvarado2, J. Castro-Ramos1, B. Licona-Moran2, S.
Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil3, J.A Delgado-Atencio1.
1
2
Oaxaca. México.
3
ABSTRACT
The transparent elastomer Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 is increasingly used in optical applications, as in
the manufacture of microlens, waveguides (optical fibers) and elaborated phantoms (simulator of biological tissue); The
wide range of applications is due to its excellent physic-chemical properties, its low cost, easy operation and null
toxicity. This paper describes the manufacturing process and physic-chemical characterization of Phantoms prepared
with PDMS as grid and doped with some elements present as Gliceryl, ink, glucose 10% and melanin provided by sigma
aldrich. We made phantoms with different concentrations and elements; we measured their profiles, and thicknesses.
Finally, we obtained their Raman Spectra. We present the experimental results obtained of the physic-chemical
parameters of the phantoms and the conclusions.
Keywords: PDMS, phantoms, Raman spectroscopy.

.
1. INTRODUCTION
The development of synthetic tissue (phantoms) to simulate the optical properties of biological tissues has become very
common in the literature due to these tissues can be used to experiment and calibrate the instruments used to assess tissue
in vivo or to simulate the optical behavior of certain tissues such as human skin [1], pancreas [2], breast structure etc. [3];
to do these, it has been developed various types of phantoms, such as liquids, rigid and soft phantoms, which are
prepared to simulate biological tissues that are object of study . Main contribution of phantoms is to reduce exposure to
radiation in living tissue and to allow the calibration of measurement instruments.
Fabrication of phantoms of polymeric material is relatively new; they offer the possibility of being manufactured and
endured in a short period of time. Their design is not complex and the production cost is low. In addition, their high
transparency, efficiency, and null toxicity [4], make them ideal in biomedical optics applications [5].
Recently one of the most active polymeric elastic materials of great interest due to market expectations and applications
reported in the literature is that called as polydimethylsiloxane PDMS Sylgar 184 [6, 7]. In the area of biomedical optics
it has been reported phantoms made with PDMS, ink and titanium oxide (TiO2) [5].
The optical properties exhibited by phantoms depend on their physical-chemical and manufacturing method employed. It
is important to understand these processes to produce synthetic phantoms with optical properties similar to human skin.
The manufacturing process of phantoms can be varied; some of them involve Sol-Gel method, other use hydrolysis and
polycondensation [8]. The concentration of components can be changed to obtain a mixture of them; using different
curing times and temperatures [9] so at specific combination of these parameters in the manufacturing process, it can be
produced phantoms with specific properties.
This paper proposes an alternative method, simple and no expensive to produce Phantoms PDMS-based, with elements
diffusers and absorbers (using ink, melanin, cholesterol, Gliceryl, glucose) and the physics-chemical characterization that
exhibit relevance for their use, which will determine whether these are viable phantoms optical comparison of properties
on human skin. Finally, it is summarized the parameters measured in phantoms made with different concentrations and
Proc. of SPIE Vol. 7906, 79060I · © 2011 SPIE · CCC code: 1605-7422/11/$18 · doi: 10.1117/12.874285
items under the process described. In the following sections it is presented the manufacturing process, physics-chemical
characterization and conclusions.
2. Fabrication Method of PDMS phantoms
The fabrication process of PDMS-based Phantoms under the proposed methodology is directly due to the easy cure and
material handling. The phantoms developed have a thickness between 0.1 to 2mm, and 2 to 5cm of diameter. The
material used is PDMS Sylgard 184 is provided by Dawn Corning [6].
The methodology developed for the manufacturing consists of 4 steps: Step 1. To measure components in proportion
10:1 (base: curing agent) for the PDMS and an amount 10% for extras such as ink components, glucose, Gliceryl and
melanin. We used an analytical balance Ohaus Voyager model [10]. Step 2. To blend the components by manual stirring
until we obtained a well mixture of them (for which we used a beaker). Step 3. To remove air bubbles in the mixture
using a sonic bath during 5 minutes. Step 4. To pour the mixture into a flat glass surface previously cleaned with
isopropyl alcohol. Phantoms were cured inside of a laminar flow hood in a horizontal position for seven days at room
temperature (25 ° C). The laminar flow hood (Labconco 36212-04) prevents contamination by solid particles (laminar
flow hood is of type 2).
(a) (b)
(c) (d)
Figure 1 Methodology of fabrication of PDMS phantoms (a) measurement of components, (b) mixing components, (c)
extraction of bubbles with sonic ink and (d) pour of mixed in a container for generation of PDMS phantom.
The characterization of the fabricated phantoms allowed us to know as many optical and chemical properties to predict
their behavior, especially those which are related to its optical performance. In the following sub-sections we present the
concentration of the elements contained in each of the phantoms, the parameters of shape, and optical properties.
2.1. Phantoms Chemicals concentration
Six PDMS phantoms were fabricated by adding different components present in human skin such as, melanin,
cholesterol, Gliceryl, glucose. Ink was used as an absorber element. Table 1 shows the distribution and concentration of
each of the components used to make the 6 PDMS phantoms. The six samples were manufactured and cured under the
same circumstances, that mean, cured at room temperature (25 ° C) during a period of seven days and using a laminar
flow hood.
Table 1 percentage of concentration and components of PDMS Phantoms.
Component PDMS Ink Melanin Glucose Gliceryl

# of Phantom
1 98% ----- 1% 1%
2 98% ----- 1% 1%
3 97% 1% 1% 1%
4 97% 1% 1% 1%
5 94% 5% 1%
6 94% 5% 1%
2.2. Shape parameter and dimensions of phantoms
Once PDMS phantoms have been cured, the measurement of some parameters such as shape and thickness dimension
and profile and roughness were made based on the fact that optical parameters depend on them [11]. These data are
shown in Table 2. The parameters were measured using an optical profilometer (Wyko Model NT profilers series of
Veeco). Figure 2 shows the profiles in the Y axis of three phantoms, which indicate the importance of roughness on
them.
Table 2 Parameters of shape of PDMS phantoms
Parameter Rugosity Thickness Size

# of Phantom (mm) (mm) (mm)
1 0.05 0.11 1.79×1.85
2 0.07 0.14 1.74×1.85
3 0.15 0.29 1.32×1.85
4 0.13 0.28 1.07×1.85
5 0.14 0.28 1.34×1.85
6 0.13 0.27 1.30×1.85
Figure 2 Figure 2 Y profiles of 3 phantoms. (a) phantom 2, (b) Phantom 4 y (c) Phantom 6.
3. Characterization of PDMS Phantoms
This section describes the results obtained by characterizing the phantoms made of PDMS and mixed with different
chemicals derived from cholesterol, glucose, triglycerides, and synthetic melanin.
Figure 3 shows the phantoms 1 and 2, which are composed of 1% melanin and 1% Gliceryl. Raman spectrum indicates
that the characteristic bands of PDMS, which are located at 479, 608, 700, 780, 1400 cm-1 are present in Raman
spectrum.
1.0
1
2
0.8
Relative Intensity (A.U)
0.6
0.4
0.2
0.0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Raman shift (cm-1)
Figure 3 Raman spectra of phantom 1 and 2
Figure 4 shows the phantom number 3 which is composed of cholesteryl, Gliceryl and ink. Figure 4a shows the spectrum
accompanied by fluorescence; the Raman shift range is set from 0 to 2000 cm-1. Figure 4b shows the spectrum processed
without fluorescence. In both graphics, labels are shown from 1 to 9, they indicate that the spectrum were performed in
different areas, following the experimental setup reported in [12]; spectrums show the mapping technique of the sample.
The spectral range for this figure is from 300 to 1800 cm-1. This spectrum indicates that the overlap on the characteristic
peaks of PDMS, glucose, Gliceryl, and cholesteryl is due to low concentration of these elements and the concentration of
ink, which makes the samples less transparent. Figure 4b shows that area 2 and 3 is where there is greater concentration
of the compounds that were combined.
15000 10
4b
14000 4a 9
8
13000
8 7
12000 1 6
2 5
11000
3 4
Offset Y values
10000 4 6 3
5 2
9000
6 1
8000 7 4
8
7000
9
6000 10
2
5000
4000
3000 0
0 500 1000 1500 2000 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman Shift (cm-1) Raman shift (cm-1)
Figure 4 a) Raw Raman spectra and b) Raman spectra after processing of phantom number 3
In figure 5 a) displays the raw Raman spectra. Figure 5 b) shows the spectrum processed in a spectral range from 300 to
1800 cm-1; these spectra were obtained from the phantom number 4 which is made of ink, cholesteryl and glyceryl. This
describes that spectra have a uniform composite throughout the phantom, different regions show small variations that can
be considered equal and also it is the average of all areas to which it referred.
10
5b
3900 5a 2
3
9
8
3800
4 8 7
5 6
3700 6 5
7 4
Offset Y values
6 3
3600 8
9 2
1
3500
4
3400
3300 2
3200
3100 0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
3000 Raman shift (cm-1)
0 500 1000 1500 2000
Raman shift (cm-1)
Figure 5 a) raw Raman spectra and b) Raman spectra after processing data of phantom number 4
Figure 6 a) covers up the spectra taken from the phantom number 5, which is composed of cholesteryl, glyceryl, ink and
glucose. The differences can be noted that fluorescence has to change zone by zone on the phantom. These variations are
due that the ink is not uniform throughout the phantom that is being characterized. Figure 6 b) shows the processed
Raman spectrum and offset in Y axis, these shifts allows better visualization of the data and, allow a visual inspection of
the variations produced in the spectra. This leads us to conclude that this phantom is only variation in fluorescence and
spectral lines are almost equal.
10
4800 6b
4600 6a 9
8
1
2 8 7
4400 6
3
5
4200 4
4
5
Offset Y values
6 3
4000 6 2
7 1
3800 8
4
9
3600
3400 2
3200
0
3000 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
0 500 1000 1500 2000
Raman shift (cm-1)
Raman Shift (cm-1)
Figure 6 a) raw Raman spectra and b) Raman spectra after processing of phantom number 5
Figure 7 a) presents the Raman spectrum of the phantom number 6 which is composed by cholesteryl, glyceryl and ink.
This graph shows 11 different phantom positions of which only the zone number 4 is beyond the behavior of the others.
This is caused due to, in that area, the phantom has a lower concentration of ink, for this reason there is less absorption
and the spectrum exhibit high fluorescence. Figure 7 b) shows the Raman spectrum processing of phantom number 6.
This graph only shows 9 different areas, this is because it has 3 overlapping spectra and there is no difference on them,
for that reason we took only 1 area; this causes it to have only 9 areas in the graph. The processed spectra are included in
this graph, which does not show change in the spectral lines of the phantom. We can say that it only has variations in the
spectrum when taking into account the background fluorescence.
5000
7a
10 7b
4800 1 9
2 8
4600 3 7
8
4 6
Relative Intensity (A.U) 4400 5 5
6 4
4200
7
Offset Y values
6 3
8
4000
9
2
10 1
3800
11 4
3600
3400
2
3200
0 500 1000 1500 2000

Raman Shift (cm-1) 0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Raman shift (cm-1)
Figure 7 a) Raw Raman spectra of 11 different zones and b) Raman spectra after processing of phantom
number 6
4. Conclusions
We present an easy way to make phamtoms with PDMS which could be used to make comparisons in the concentration
of cholesterol, glucose and triglycerides that well known are present in the blood. The Raman spectra show low
variations with low concentrations of chemical substances of glyceril and cholesteryl, and also show how the PDMS
bands can be suppressed to produce only spectral lines of interest.
5. ACKNOWLEDGEMENTS
The authors gratefully acknowledge to Dr. Francisco Renero for provided profiler Wyko Model NT profilers series of
Veeco, The authors gratefully acknowledge funding from CONACYT project #40086-F.
6. References
[1] Durduran, T., Holboke, M., Culver, J: P., Zubkov, L., Choe, R., Pattanayak, D.N., Chance, B. and. Yodh, A. G
"Tissue bulk optical properties of breasts and phantoms obtained with clinical optical imager," in Biomedical Optical
Spectroscopy and Diagnostics, T. Li, ed., Vol. 38 of OSA Trends in Optics and Photonics (2000).
[2] Mourant, J. R., Johnson,T. M, and Freyer, J. P., "Characterizing Mammalian Cells and Cell Phantoms by Polarized
Backscattering Fiber-Optic Measurements," Appl. Opt. 40, 5114-5123 (2001)
[3] Ayers, F., Grant, A., Kuo, D., Cuccia, D. J., and Durkin, A. J., "Fabrication and characterization of silicone-based
tissue phantoms with tunable optical properties in the visible and near infrared domain," Proc. of SPIE Vol. 6870,
687007, (2008).
[4] Pogue, B.W. and M.S. Patterson, “Review of tissue simulating phantoms for optical spectroscopy, imaging and
dosimetry”, J Biomed Opt,. 11 (4): p. 041102 (2006).
[5] Bays, R., Wagnières, G., Robert, D., Theumann, J.-F., Vitkin, A., Savary, J.-F., Monnier, P. and van den Bergh, H.
“Three-dimensional optical phantom and its application in photodynamic therapy. Lasers in Surgery and Medicine”,
21:227–234 (1997).
[6].http://pibeta.web.psi.ch/handbook/suppliers/sylgard.pdf.
[7] Santiago–Alvarado, A y Vázquez–Montiel, S. “Propiedades Físico-Químicas de Membranas PDMS Empleadas en
Lentes Líquidas”, Superficies y Vacio 22(3) 69-75 ISSN: 1665-3521, IPN. (2009).
[8] Cooper, R. J, Eames, R,, Brunker, J., Enfield, L. C., Gibson, A. P., and Hebden, J. C., "A tissue equivalent phantom
for simultaneous near-infrared optical tomography and EEG," Biomed. Opt. Express 1, 425-430 (2010)
[9] Santiago-Alvarado, A., Vázquez-Montiel, S., González-García,J., Licona-Moran, B. I. G., Rayas-Álvarez, J. A. , y
Castro-González, G. ,“Fabricación y caracterización de membranas elásticas de PDMS para lentes líquidas con longitud
focal variable (LLLFV)”, Opt. Pura Apl. 41 (4) 381-388, (2008).
[10] http://www.ohaus.com.mx/voyager_pro_a.htm
[11] Mourant, J. R., Freyer, J. P., Hielscher, A. H., Eick, A.A., Shen, D., and Johnson, T. M., "Mechanisms of Light
Scattering from Biological Cells Relevant to Noninvasive Optical-Tissue Diagnostics," Appl. Opt. 37, 3586-3593
(1998).
[12] Villanueva-Luna, A.E., Castro-Ramos, J., Vazquez-Montiel, S.; Flores Gil, A., and Delgado-Atencio, J.A.,
“Mapping skin using Raman spectroscopy” Optical Diagnostics and Sensing XI: Toward Point-of-Care Diagnostics.
Edited by Coté, Gerard L. Proceedings in press (2011).
Raman spectra and optical coherent tomography images of skin
Atencio1, A.Vazquez-Villa1.
1
Coordinación de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida
Concordia Cd. del Carmen, Campeche, México.
ABSTRACT
The optical coherence tomography images are useful to see the internal profile and the structure of material samples. In
this work, OCT images were recorded in 10 volunteers with different skin tone which were related to Raman spectra.
The areas where we obtained OCT images and Raman spectra were a) index finger nail, b) between index finger and
middle finger, c) middle finger tip, d) half of middle finger, e) the thumb finger tip and f) between index finger and
thumb, areas measured were for the purpose of finding extracellular fluids with contain triglycerides, cholesterol and
glucose that are reported in the literature. The excitation wavelength used for this work was 785 nm, a spectrometer of
6 cm-1 resolution. The spectral region used ranges from 300 to 1800 cm-1. We use an OCT with 930 nm of Central
Wavelength, 1.6 mm of Image Depth, 6 mm of image width and 6.2 µm of axial resolution.
Key words: Skin, Raman spectroscopy, OCT, Wavelets.
1. Introduction
Optical imaging and spectroscopy have both been used to detect disease based on the analysis of tissue microstructure
and biochemical composition, no one method has demonstrated the spatial sensitivity and rapid data acquisition needed
for screening in combination with the high specificity required for reliable multiclass discrimination. Spectroscopy
excels at detecting molecular markers of disease with high specificity, while imaging excels in detecting tissue
microstructure with high sensitivity. In particular, near-infrared (NIR) Raman spectroscopy (RS) has been used for in
vivo detection of cancers in various organs [1]. RS is sensitive to vibrational modes in tissue and produces fingerprint
spectra characteristic of specific molecules and their environments, thus realizing unparalleled molecular specificity. A
recent comparison of Raman, fluorescence, and diffuse reflectance spectroscopy for breast cancer detection
demonstrated the superior specificity of RS in classifying disease [2]. The weak nature of RS requires integration times
of 3–30 s, limiting the technique to point measurements and motivating the need for image guidance to improve
sampling accuracy. A combined confocal microscopy–confocal RS device was developed to guide RS acquisition with
images of tissue microstructure [3], but confocal imaging depth in epithelial tissues is limited to ≈250 µm and the
transverse field-of-view (FOV) is limited to ≈500 µm. Combining the molecular specificity of RS with an imaging
method that has increased depth and larger FOV will yield a valuable tool for the early detection of disease. Optical
coherence tomography (OCT) can image over larger transverse areas of tissue (>5 mm) with micrometer scale
resolution, real-time speed, and sensitivity to microstructural features of disease [4].
Raman spectra of whole blood, serum, and Hb with the visible and NIR excitation have been reported also a
comparison of Raman spectra of whole blood and Hb with visible excitation, excitation in the 700–860 nm region, and
1064 nm excitation were made [5]. Using three set of experiments varying blood glucose concentration. In the first set,
large variations of blood glucose concentration (≈400mg/dl) and used 2100 OCT A scans for signal averaging. In the
second set, variations of blood glucose concentration by approximately 200mg/dl and used 8400 A scans for signal
averaging. In the third set improving OCT blood glucose monitoring by increasing and controlling skin temperature
under the OCT probe, results obtained suggest that the accuracy of OCT-based glucose monitoring is approaching that
of standard invasive and minimally invasive techniques [6]. There are a few articles which reviews many of the recent
advances in optical glucose sensing including optical absorption spectroscopy, polarimetry, Raman spectroscopy, and
fluorescent glucose sensing. Also a review of calibration and data processing methods useful for optical techniques are
Photonic Therapeutics and Diagnostics VII, edited by N. Kollias, et al., Proc. of SPIE Vol. 7883,
788310 · © 2011 SPIE · CCC code: 1605-7422/11/$18 · doi: 10.1117/12.874280
presented, in same way discuss about the calibration of optical glucose measurements and the advanced mathematical
techniques which have been employed in attacking this hurdle has been done [7]. A study of the use of Raman
spectroscopy for quantitative, noninvasive (‘‘transcutaneous’’) measurement of blood analytes, using glucose was
made by Enejder et al [8]. 17 healthy human subjects were analyzed whose blood glucose levels were elevated over a
period of 2–3 h using a standard glucose tolerance test protocol. A partial least squares calibration was created from the
data from each subject and validated using leave-one-out cross validation. The identification of traces of body fluids
discovered at a crime scene is a major part of forensic investigation today Virkler & Lednev [9]. Used Near-infrared
(NIR) Raman spectroscopy to measure spectra of dried human blood samples from multiple donors. Two aspects were
analyzed, the influence of sample heterogeneity and potential Raman spectral variations that could arise between
different donors of blood. Also two Raman spectroscopic components, the hemoglobin and fibrin components which
vary with the donor were studied in detail. There are in the literature some papers in order to detect minute amounts of
glucose in diluted urine, in which the Raman spectroscopy method was applied, normal urine ten-fold with water and
added glucose up to 8 mg dl−1 were diluted. Dates collected were processed with neural network algorithm to classify
abnormal and normal urine samples according to their glucose concentrations [10]. The potential applications of
Raman spectroscopy may herald a new future in the management of various malignant, premalignant, and other benign
conditions such as urology.Applications of Raman spectroscopy, for example in the bladder, renal, prostate, and other
urological disorders were gathered from [11]. Urea concentration in urine is sufficiently high that normal Raman
spectroscopy may be used for its analysis. Premasiri et al examined the use of Raman spectroscopy to analyze
components in human urine, targeted urine components include urea, uric acid, and creatinine [12]. Hawi et al [13]
studied Raman microspectroscopy as a promising technique for the in situ characterization of intracellular cholesterol
crystals. Treatment of cultured bovine coronary artery endothelial cells with 22-hydroxycholestero1 (220HC)
stimulated the production of intracellular crystals, a phenomenon that did not occur in the absence of viable cells.
These crystals were identified as a combination of the 220HC starting material and cholesterol. The combination of
Raman spectroscopy and Coronary intravascular ultrasound (IVUS) applied in vitro provides detailed information
about the amount and location of calcific deposits and lipid pools in atherosclerotic plaques as was shown by Romer
[14]. The arteries were opened longitudinally, and Raman spectra were collected from locations at 0.5-mm intervals
across the arterial luminal circumference. The spectra were used to calculate the chemical composition of the arterial
wall at the examined locations.
In this work OCT images were recorded in 10 volunteers with different skin tone which were related to Raman spectra.
The areas where we obtained OCT images and Raman spectra were index finger nail, the space between index finger
and middle finger, middle finger tip, half of middle finger, the thumb finger tip and the space between index finger and
thumb finger measured were for the purpose of finding the extracellular fluids which contain triglycerides, cholesterol
and glucose that are reported in the literature.
2. Theory of OCT and Raman spectroscopy
Optical Coherence Tomography (OCT) is an interferometric, noninvasive tomographic imaging technique that is
ideal for turbid imaging applications. Fourier Domain optical coherence tomography (FD-OCT) offers significant
advantages to existing time-domain optical coherence tomography (TDOCT) imaging techniques due to its increased
sensitivity (approximately 20dB). This results in a significant increase in imaging speed without compromising the
image quality. The resultant speed enhancement allows for cross-sectional imaging of 500 A-scans at 10 frames per
second, compared to early clinical TD-OCT systems at 1 frame per second, this increase in speed makes FD-OCT ideal
for real time clinical applications such as in vivo surgical monitoring. FD-OCT is used to obtain subsurface cross-
sectional images of a sample with micron-level resolution by mixing light collected from a sample with reference light
within an interferometer. This technique uses a typical Michelson interferometer illuminated with broadband (i.e. a low
temporal-coherence) light source. A 3dB coupler separates the light into the reference and the sample arm. Interference
fringes form when the optical path length difference between the reference and sample beams are less than the source
coherence length. The short coherence light provides a modulated signal at a specific depth that improves detection
capability. This technique provides precise axial positioning of an object in the direction of light propagation achieving
precision on the order of microns. Typical scan depths for highly scattering biological samples range from 1mm to
several mm’s depending on the scattering properties of the sample. FD-OCT provides a direct measure of the scattering
amplitude along a vertical axis within a bulk sample. Light reflected from different sample depths will produce
interference patterns with different frequency components. A Fourier transform is used to resolve the different depth
reflections, generating the depth profile of the sample. One exposure provides the complete measurement of the
scattering amplitude from the surface into the bulk of the sample (this measurement is commonly referred to as an “A-
scan”). Adjacent cross-sectional images can then be synthesized into 3D models [15].
Raman spectroscopy is based in the Raman effect what is conceptually simple: a photon can interact with a molecule
in a material and can be scattered. This scattered photon almost always has the same energy/wavelength that it had
before interacting with the molecule. This is referred to as Rayleigh (elastic) scattering. Very rarely a photon will either
lose energy by exciting a vibration of the molecule or gain energy by causing return to the ground state of a vibration
that has been thermally excited. These effects are Stokes or anti-Stokes scattering, respectively. The energy lost or
gained is the vibrational energy of the vibrational mode. The Raman spectrum is produced by measuring the light
shifted to lower frequencies (longer wavelengths) and to higher frequencies (shorter wavelengths) corresponding to
each of the vibrational modes of the molecule. Because at thermal equilibrium there are always more molecules in the
ground vibrational state than in an excited vibrational state the intensity of Stokes photons, those shifted to the red with
respect to the exciting photon is much greater than the intensity of anti-Stokes photons. The Stokes spectrum is almost
always the one used in a typical Raman measurement. The absolute wavelength of the observed Raman spectrum is
always relative to the exciting photon. Since lasers are the only practical light source for Raman excitation, the
selection of the laser wavelength sets the wavelength region at which the Raman spectrum will be observed. The x-axis
of the Raman spectrum is typically expressed as frequency in reciprocal centimeters (cm−1), which can be referred to
as relative wave numbers or Raman shift [16].
3. Experimental Setup
The excitation wavelength used for this work is 785 nm, a spectrometer of 6 cm-1 resolution. The spectral region used
ranges from 300 to 1800 cm-1. We use an OCT with 930 nm of Central Wavelength, 1.6 mm of Image Depth, 6 mm of
image width and 6.2 um of axial resolution.
3.1. OCT system
A schematic of a standard 930nm Thorlabs SR-OCT system is shown in Figure 1 below. A super luminescent diode
(SLD) light source is guided into a handheld Michelson interferometer probe, which splits the light into two separate
optical paths. The reference arm path is terminated with a mirror, while the other path contains an imaging lens that
focuses the light onto the sample. This same imaging lens is also used to collect light that is backscattered or reflected
from the sample. The light returning from the end of both paths is recombined and directed into a spectrometer, which
spatially separates the light to form the interference pattern that is then analyzed to yield the spectral OCT image. If the
length of the sample arm were fixed, the interference pattern would be a simple sinusoidally-varying function of
wavelength, for which the Fourier transform is a single peak. However, due to the fact that the backscattered and
reflected light originates from various depths within the sample, a modulation in the amplitude of the sinusoidally
varying interference pattern arises. Since the amplitude modulation is depth dependent, the Fourier transform yields the
intensity of the backscattered or reflected light as a function of depth (i.e. an A-scan)[15].
3.2. Processing method to remove fluorescence and noise in Raman spectra
The data were processed numerically by using the software package ‘wavelet toolbox’, part of the MATLAB 2006a®
program (by The MathWorks Inc.). The decomposition of the signal was performed up to the level n = 8 using
biorthogonal wavelets Bior 6.8, with 6th and 8th order filter algorithms involving 17 and 11 data points,
respectively[17]. Starting from the decomposed parts, the signal can be reconstructed by inverted discrete wavelet
transform (IDWT). If the last approximation component is not included in the IDWT process, then the smoother part of
the signal is removed. In the case of a Raman spectrum, this background signal component is mainly caused by light
diffusion and fluorescence processes [18]. Figure 1 right show experimental setup of Raman spectroscopy that we use.
Figure 1 left show OCT diagram and Right Raman spectroscopy experimental setup
4. Results
In this section we show OCT images and Raman spectra of all volunteers that we had for this work. OCT images were
used to see skin morphology of areas that were sampled.
Figure 2 shows the different colors of skin of volunteers for this work, these images were taken with the camera you
have used OCT device. Volunteers V3, V6 and V9 are women and the rest are volunteers are men.
Figure 2 Different color of skin from volunteers (V).
Figure 3 shows the areas proposed in this work in OCT images and Raman spectra of each volunteer. Area a)
corresponds to the index finger nail, b) corresponds to between index finger and middle finger, c) corresponds to
middle finger tip, d) is half of middle finger, e) is the thumb finger tip and finally f) corresponds to between index
finger and thumb finger. The areas shown in this figure are volunteers V10, V4 are men and V6, V7 are women.
Figure 3 special areas that are proposed in this work.
Figure 4 shows the 6 areas that are proposed using optical coherence tomography, these images are volunteers V9 and
V4. This figure shows the topographical differences between volunteers you have, just agreeing on how the c) and f).
Other areas do not have similar behavior because samples were taken under different conditions.
Figure 4 OCT images of 6 areas proposed from volunteer V9 and V4
Figures 5 presented show the Raman spectra of the different areas sampled in this study. The spectra show changes in
different spectral lines which consist of the Raman spectrum obtained.
150 100
100

50
50
0
a) 0 d)
-50
-100 -50
-150
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
-100
Raman shift (cm ) 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift (cm )
100 100

50 50
0 0 e)
b)
-50 -50
-100 -100
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
1 -1
Raman shift (cm )
100 150
100

50
50
0
c) 0
f)
-50 -50
-100
-100
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 -150
-1
Raman shift (cm ) 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift (cm )
Figure 5 Raman spectra of 6 areas proposed in this work.
Figures 6 shows topographic OCT image, the spectrum in units of depth of the image spectrum in OCT and finally
shows the Raman spectrum obtained from the area, this area is the middle finger of the volunteer V3. The OCT image
shown is 2 mm length, the spot of the excitation laser Raman spectrometer has a diameter of 200 microns, for that
reason the image was divided into 10 sections which have a size of 200 microns. The area of the arrow is where the
measured spectrum shown in the bottom was obtained.
Figure 6 top topographical OCT image, middle Spectrum of depth of OCT image, bottom Raman spectrum of middle of the finger
of volunteer 3
Figures 7 shows the Raman spectrum of 4 different volunteers, V3, V6, V7 and V10, the spectra were processed, it that
mean having subtracted fluorescence and shot noise in this spectrum highlight spectral lines related to cholesterol,
which are at 429, 538, 957, 1670 and 1694 cm-1 which as reported in the literature is cholesterol, cholesterol ester,
cholesterol, cholesterol & its esters.
V3
V6
V7
*
50
**
V10
0
**
-50
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift (cm )
Figure 7 Raman spectrum of V3, V6, V7 and V10, * highlight cholesterol spectral lines that are at 429, 538, 957, 1670 and 1694 cm-
1
.
Figures 8 shows the Raman spectrum obtained in the volunteers, the crosses represent the places where are located the
spectral lines related to glucose, these regions are 898.1071, 1343 and 1370 cm-1. The literature related to β-glucose,
glucose, glucose δ(CH) and the most pronounced saccharide band.
V3
V6
50 V7
+ V10
+ +
0
+
-50
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift (cm )
Figure 8 Raman spectra of V3, V6, V7 and V10, shows with a mark + highlight glucose spectral lines that are at 898, 1071, 1343
and 1370 cm-1.
Figures 9 are shown in * are spectral lines of cholesterol, with a + glucose and with l related to triglycerides, which are
in the 1264 and 1744 cm-1. This graph shows changes in the different lines are highlighted, and can potentially make a
quantification of the amount of concentration obtained spectral lines.
V3
Relative intensity (A.U) V6
50 V7
* * * + l V10
+ + ** l
0
+
-50
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift (cm )
Figure 9 Raman spectra of V3, V6, V7 and V10, shows with a mark * highlight cholesterol spectral lines, + highlight glucose
spectral lines and l highlight triglycerides spectral lines.
Figures 10 shows the Raman spectrum obtained on the nail of volunteer 1, this spectrum has a large concentration of
keratin, because that is the largest component that takes into nails, 1273 and 1447 cm-1, that are related with amide III
and CH2 bending mode of proteins & lipids CH2 deformation (protein vibration)[19]
400
200
* *
0
-200
-400
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift (cm )
Figure 10 Raman spectrum of index nail
5. Conclusions
In this paper we showed some spectral lines of the Raman spectrum which can be identified as cholesterol, glucose,
triglycerides and keratin. These spectral lines are located at 429, 538, 957, 1670 and 1694 cm-1 for cholesterol at 898,
1071, 1343 and 1370 cm-1 for glucose at 1264 and 1744 cm-1 for triglycerides at 1273 and 1447 cm-1 for keratin. OCT
Images are of great importance to see the surface of the area where the Raman spectrum was taken. Areas proposed in
this paper helps us to get a better signal and behavior of laser spot in the sample that present that extracellular fluids are
contain in areas that are discussed in this work.
6. References
[1] Mahadevan-Jansen, A, in Biomedical Photonics Handbook, T. Vo Dinh, ed. (CRC Press, 2003), p. 30.
[2] Majumder, S. K., Keller, M. D., Kelley, M. C., Boulos, F. I, and Mahadevan-Jansen, A., “Comparison of
autofluorescence, diffuse reflectance, and Raman spectroscopy for breast tissue discrimination,” Journal of Biomedical
Optics 135, 054009 (2008)
[3] Caspers, P. J., Lucassen, G. W., and Puppels, G. J.,”Combined in vivo confocal Raman spectroscopy and confocal
microscopy of human skin” Biophys. J. 85, 572 (2003).
[4] Fujimoto J. G., Brezinski, M. E., Tearney, G. J., Boppart, S. A., Bouma, B., Hee, M. R.,. Southern, J. F, and
Swanson, E. A., “In vivo cellular optical coherence tomography imaging”,Nat. Med. 1, 970 (1995).
[5] Hidetoshi S, Hironori C, Hideo To, Yukihiro O, “Excitation wavelength-dependent changes in Raman spectra of
whole blood and hemoglobin: comparison of the spectra with 514.5, 720, and 1064 nm excitation”, Journal of
Biomedical Optics 6(3), 366–370 (2001).
[6] Kuranov, R. V., Sapozhnikova, V. V., Prough, D. S., Cicenaite, I., and Esenaliev, R. O., “Prediction Capability of
Optical Coherence Tomography for Blood Glucose Concentration Monitoring ”, Journal of Diabetes Science and
Technology , 1, 4, (2007).
[7] McNichols, R. J., Cote, G. L., “Optical glucose sensing in biological fluids: an overview” Journal of Biomedical
Optics 5(1), 5–16 (2000).
[8] Enejder, A. M. K., Scecina, T. G., Oh, J., Hunter, M., Shih, W., Sasic, S., Horowitz, G. L., Feld, M. S., “Raman
spectroscopy for noninvasive glucose measurements”, Journal of Biomedical Optics 10(3), 031114 (2005).
[9] Virkler, K., & Lednev,I. K., “Raman spectroscopic signature of blood and its potential application to forensic body
fluid identification” Anal Bioanal Chem 396:525–534, (2010).
[10] Park, C., Kim,K., Choi J., and Park,K, “Classification of glucose concentration in diluted urine using the low-
resolution Raman spectroscopy and kernel optimization methods” Physiol. Meas. 28 583–593 (2007).
[11] Hanchanale,V.S., Rao, A. R., and Das,S., “Raman spectroscopy and its urological applications”, Indian J Urol.;
24(4): 444–450, (2008).
[12] Premasiri, W.R, Clarke, R. H., and Womble, M. E, “Urine Analysis by Laser Raman Spectroscopy” Lasers in
Surgery and Medicine 28:330-334 (2001).
[13] Hawi, S. R, Nithipatikom, K., WohlfeilJ Fran Ad R., and Campbell, W. B., “Raman microspectroscopy of
intracellular cholesterol crystals in cultured bovine coronary artery endothelial cells”, Journal of Lipid Research
Volume 38, (1997).
[14] Romer, T. J., Brennan III, J. F., Puppels, G. J., Zwinderman, A. H., van Duinen, S. G., van der Laarse, A., van der
Steen, A. F.W., Bom, N. A., Bruschke, A. V.G., “Intravascular Ultrasound Combined With Raman Spectroscopy to
Localize and Quantify Cholesterol and Calcium Salts in Atherosclerotic Coronary Arteries”, Arterioscler Thromb Vasc
Biol. ;20;478-483, (2000).
[15] “spectral radar OCT, operating manual” Thorlabs.
[16] Matousek,P. and Morris, M. D.,[Emerging Raman Applications and Techniques in Biomedical and
Pharmaceutical Fields], Springer-Verlag Berlin Heidelberg , 97-110 (2010).
[17] Camerlingo,C., Zenone, F., Gaeta, G.M. , Riccio, R.,Lepore, M., "Wavelet data processing of micro-Raman
spectra of biological samples", Meas. Sci. Technol. 17, 298-303 (2006).
[18] Villanueva-Luna, A.E., Castro-Ramos, J., Vazquez-Montiel, S., Flores-Gil, A., Delgado-Atencio, J.A, Orozco-
Guillen, E.E, “Fluorescence and Noise Subtraction from Raman Spectra by Using Wavelets”, Optical Memory and
Neural Networks (Information Optics), Volume 19 Number 4, (2010).
[19] Gniadecka,M, Faurskov Nielsen O,, Christensen, D.H, and Wulf, H.C, ‘‘Structure of water, proteins and lipids in
intact human skin, hair and nail,’’ J. Invest. Dermatol. 110, 393–398 (1998).
2
De-Noising Audio Signals

Using MATLAB Wavelets Toolbox
Adrian E. Villanueva- Luna1, Alberto Jaramillo-Nuñez1,
Daniel Sanchez-Lucero1, Carlos M. Ortiz-Lima1,
J. Gabriel Aguilar-Soto1, Aaron Flores-Gil2 and Manuel May-Alarcon2
1Instituto Nacional de Astrofisica, Optica y Electronica (INAOE)
2Universidad Autonoma del Carmen (UNACAR)
Mexico
1. Introduction
Based on the fact that noise and distortion are the main factors that limit the capacity of data
transmission in telecommunications and that they also affect the accuracy of the results in
the signal measurement systems, whereas, modeling and removing noise and distortions are
at the core of theoretical and practical considerations in communications and signal
processing. Another important issue here is that, noise reduction and distortion removal are
major problems in applications such as; cellular mobile communication, speech recognition,
image processing, medical signal processing, radar, sonar, and any other application where
the desired signals cannot be isolated from noise and distortion.
The use of wavelets in the field of de-noising audio signals is relatively new, the use of this
technique has been increasing over the past 20 years. One way to think about wavelets
matches the way how our eyes perceive the world when they are faced to different
distances. In the real world, a forest can be seen from many different perspectives; they are,
in fact, different scales of resolution. From the window of an airplane, for instance, the forest
cover appears as a solid green roof. From the window of a car, the green roof gets
transformed into individual trees, and if we leave the car and approach to the forest, we can
gradually see details such as the trees branches and leaves. If we had a magnifying glass, we
could see a dew drop on the tip of a leaf. As we get closer to even smaller scales, we can
discover details that we had not seen before. On the other hand, if we tried to do the same
thing with a photograph, we would be completely frustrated. If we enlarged the picture
"closer" to a tree, we would only be able to see a blurred tree image; we would not be able to
spot neither the branch, nor the leaf, and it would be impossible to spot the dew drop.
Although our eyes can see on many scales of resolution, the camera can only display one at
a time.
In this chapter, we introduce the reader to a way to reduce noise in an audio signal by using
wavelet transforms. We developed this technique by using the wavelet tool in MATLAB. A
Simulink is used to acquire an audio signal and we use it to convert the signal to a digital
format so it can be processed. Finally, a Graphical User Interface Development Environment
(GUIDE) is used to create a graphical user interface. The reader can go through this chapter
systematically, from the theory to the implementation of the noise reduction technique.
26 Engineering Education and Research Using MATLAB
We will introduce in the first place the basic theory of an audio signal, the noise treatment
fundamentals and principles of the wavelets theory. Then, we will present the development
of noise reduction when using wavelet functions in MATLAB. In the foreground, we will
demonstrate the usefulness of wavelets to reduce noise in a model system where Gaussian
noise is inserted to an audio signal. In the following sections, we will present a practical
example of noise reduction in a sinusoidal signal that has been generated in the MATLAB,
which it is followed by an example with a real audio signal captured via Simulink. Finally,
the graphic noise reduction model using GUIDE will be shown.
2. Basic audio theory

Sound is the vibration of an elastic medium, whether gaseous, liquid or solid. These
vibrations are a type of mechanical wave that has the capability to stimulate human ear and
to create a sound sensation in the brain. In air, sound is transmitted due to pressure
variations at a rate of change that is called frequency. The difference between the extreme
values of pressure represents its amplitude. Pressure variations in the range of 20 Hz to 20
kHz produce the sound which is audible to the human ear and this is more receptive when
it is between 1 kHz to 4 kHz. In physical terms, the sound is a longitudinal wave that travels
through the air due to vibration of the molecules. Similar to light, sound waves can be
reflected, absorbed, diffracted, or refracted.
Audio signals, which represent longitudinal variations of pressure in a medium, are
converted into electrical signals by piezoelectric transducers. Transducers convert the
energy of a mechanical displacement into an electrical signal, either voltage or current. The
main advantage of converting an audio signal into an electrical signal is that the signal can
now be processed. An example is an analog signal obtained from the transducer that can be
converted into an encoded digital data stream by using an analog-digital converter (ADC)
and constitutes digital processing of analog signals. Alternatively, if a digital-analog
converter (DAC) is applied to a digital data stream, the audio signal transmits through an
amplifier and a speaker. The process is show schematically in Figure 1, which identifies the
important steps in digital audio processing.
Fig. 1. Shows the process of digital processing of three types of audio signal. Part (a)
represents a complete digital audio processing comprising (from left to right) a microphone,
amplifier, ADC, digital processing material, DAC, amplifying section and speaker; an audio
recognition system in (b), and a set of audio synthesis (c)
2.1 Recording audio signals in Simulink/MATLAB

Once in the digital domain, these signals can be processed, transmitted or stored. We found
that the Audio Device block in Simulink enables experimentation and processing of digital
signals. The From Audio Device block reads audio data from an audio device in real time.
De-Noising Audio Signals Using MATLAB Wavelets Toolbox 27
Fig. 2. Shows the process identifies the main steps in a digital audio processing system
based in Simulink software
The From Audio Device block buffers the data from the audio device by means of using the
process illustrated by Figure 2. We selected the block MATLAB Simulink audio and
multimedia file block in order to save the audio acquired by a given time. Figure 3 shows
the From Audio Device GUI, where we selected a 5 second queue period. At the start of the
simulation, the audio device writes input data to a buffer. When the buffer is full, the From
Audio Device block writes the contents of the buffer to the queue. The size of this queue can
be specified in the queue duration (seconds) parameter. As the audio device appends audio
data to the bottom of the queue, the From Audio Device block pulls data from the top of the
queue to fill the Simulink frame. We used this file to make our de-noise method using
wavelets.
Fig. 3. Shows block diagram of audio acquire

We used the wavread function. It loads a: WAVE file specified by the string filename,
returning the sampled data in y. If the filename does not include an extension, wavread
appends a .wav extension. Example code is: [x,Fs,nbits]= wavread(‘filename’) where the function
returns the filename with the number of bits per sample (nbits).
[x,Fs,nbits]= wavread ('voice');
y = awgn(x,10,'measured');
For example, wavwrite(y,Fs,’filename’) writes the data stored in the variable y to a WAVE file
called ‘filename’. The data have a sample rate, Fs, in Hz and is assumed 16-bit.
wavwrite(y,Fs,'noisyvoice')
wavwrite(xd,Fs,'voice5')
3. Basic noise theory

Noise is defined as an unwanted signal that interferes with the communication or
measurement of another signal. A noise itself is an information-bearing signal that conveys
information regarding the sources of the noise and the environment in which it propagates.
There are many types and sources of noise or distortions and they include:
1. Electronic noise such as thermal noise and shot noise,
2. Acoustic noise emanating from moving, vibrating or colliding sources such as revolving
machines, moving vehicles, keyboard clicks, wind and rain,
3. Electromagnetic noise that can interfere with the transmission and reception of voice,
image and data over the radio-frequency spectrum,
4. Electrostatic noise generated by the presence of a voltage,
5. Communication channel distortion and fading and
6. Quantization noise and lost data packets due to network congestion.
Signal distortion is the term often used to describe a systematic undesirable change in a
signal and refers to changes in a signal from the non-ideal characteristics of the
communication channel, signal fading reverberations, echo, and multipath reflections and
missing samples. Depending on its frequency, spectrum or time characteristics, a noise
process is further classified into several categories:
1. White noise: purely random noise has an impulse autocorrelation function and a flat
power spectrum. White noise theoretically contains all frequencies in equal power.
2. Band-limited white noise: Similar to white noise, this is a noise with a flat power spectrum
and a limited bandwidth that usually covers the limited spectrum of the device or the
signal of interest. The autocorrelation of this noise is sinc-shaped.
3. Narrowband noise: It is a noise process with a narrow bandwidth such as 50/60 Hz from
the electricity supply.
4. Coloured noise: It is non-white noise or any wideband noise whose spectrum has a non-
flat shape. Examples are pink noise, brown noise and autoregressive noise.
5. Impulsive noise: Consists of short-duration pulses of random amplitude, time of
occurrence and duration.
6. Transient noise pulses: Consist of relatively long duration noise pulses such as clicks,
burst noise etc.
3.1 Signal to noise ratio

The signal-to-noise ratio (SNR) is commonly used to assess the effect of noise on a signal.
This measurement is based on an additive noise model, where the quantized signal xq[n] is
a superposition of the unquantized, undistorted signal x[n] and the additive quantization
error e[n]. The ratio between the signal powers of x[n] and e[n] defines the SNR. To capture
the wide range of potential SNR values and to consider the logarithmic perception of
loudness in humans, SNR generally given in a logarithmic scale, in decibels (dB)
σ x2 (1)
SNRdB = 10 * log 10 ,
σ e2
Where, σ2x and σ2e are the powers of x[n], and e[n], respectively. Specifically for the
assessment of quantization noise, SNR is often labeled as the signal to quantization-noise
ratio (SQNR).
3.2 White noise

Shown in Figure 4, white noise is defined as an uncorrelated random noise process with
equal power at all frequencies. Random noise has the same power at all frequencies in the
range of ∞ it would necessarily need to have infinite power, and it is therefore an only a
theoretical concept. However, a band-limited noise process with a flat spectrum covering
the frequency range of a band-limited communication system is practically considered a
white noise process.
2 rnn (k) PNN (k)

1
0
-1
-2
0 50 100 150 200 250 300 k f
m
(a) (b) (c)
Fig. 4. Shows an illustration of (a) white noise time-domain signal, (b) its autocorrelation
function is a delta function, and (c) its power spectrum is a constant function of frequency
3.3 Additive White Gaussian Noise Model (AWGN)

In classical communication theory, it assumed that the noise is a stationary additive white
Gaussian (AWGN) process. Although for some problems this is a valid assumption and
leads to mathematically convenient and useful solutions, in practice, the noise is often time-
varying, correlated and non-Gaussian. This is particularly true for impulsive-type noise and
for acoustic noise, which is non-stationary and non-Gaussian and hence cannot be modeled
using the AWGN assumption.
3.4 Adding noise using MATLAB

How to do it with MATLAB: In the Communication Toolbox in MATLAB is possible to find
the function awgn. This function means adding Gaussian white noise to signal.
Syntax
y = awgn(x,snr)
y = awgn(x,snr,'measured')
y = awgn(x,snr) adds white Gaussian noise to the vector signal x. The scalar SNR specifies the
signal-to-noise ratio per sample, in dB. If x is complex, awgn adds complex noise. This
syntax assumes that the power of x is 0 dBW.
y = awgn(x,snr,'measured') is the same as y = awgn(x,snr), except that awgn measures the
power of x before adding noise.
Figure 5 shows one example of how to add white noise to the sinusoidal signal using the
communication toolbox of MATLAB. We generate the interval of the signal (k), considering
some frequency (w), then we generate a sinusoidal function with these parameters,
considering this function with the x vector. Now we generate a Gaussian white noise and
add to the sinusoidal function and plot.
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h); % Create sinus signal.
y = awgn(x,10,'measured'); % Add white Gaussian noise.
figure(1)
plot(k,y)
3
2
Amplitude
1
0
-1
-2
-3
100 200 300 400 500

Time (s)
Fig. 5. Shows adding Gaussian white noise to sine signal
4. Wavelets theory
Wavelets are used in a variety of fields including physics, medicine, biology and statistics.
Among the applications in the field of physics, there is the removal of noise from signals
containing information. There are different ways to reduce noise in audio. (Johnson et al.,
2007) demonstrated the application of the Bionic Wavelet Transform (BWT), an adaptive
wavelet transform derived from a non-linear auditory model of the cochlea, to enhance
speech signal. (Bahoura & Rouat, 2006) proposed a new speech enhancement method based
on time and scale adaptation of wavelet thresholds. (Ching-Ta & Hsiao-Chuan Wang, 2003
& 2007) proposed a method based on critical-band decomposition, which converts a noisy
signal into wavelet coefficients (WCs), and enhanced the WCs by subtracting a threshold
from noisy WCs in each subband. Additionally, they proposed a gain factor in each wavelet
subband subject to a perceptual constraint. (Visser et al., 2003) has presented a new speech
enhancement scheme by spatial integration and temporal signal processing methods for
robust speech recognition in noisy environments. It further de-noised by exploiting
differences in temporal speech and noise statistics in a wavelet filter bank. (Képesia &
Weruaga, 2006) proposed new method for time–frequency analysis of speech signals. The
analysis basis of the proposed Short-Time Fan-Chirp Transform (FChT) defined univocally
by the analysis window length and by the frequency variation rate, that parameter predicted
from the last computed spectral segments. (Li et al., 2008) proposed an audio de-noising
algorithm based on adaptive wavelet soft-threshold, based on the gain factor of linear filter
system in the wavelet domain and the wavelet coefficients teager energy operator in order
to progress the effect of the content-based songs retrieval system. (Dong et al., 2008) has
proposed a speech de-noising algorithm for white noise environment based on perceptual
weighting filter, which united the spectrum subtraction and adopted auditory perception
properties in the traditional Wiener filter. (Shankar & Duraiswamy, 2010) proposed an
audio de-noising technique based on biorthogonal wavelet transformation.
Wavelets are characterized by scale and position, and are useful in analyzing variations in
signals and images in terms of scale and position. Because of the fact that the wavelet size
can vary, it has advantage over the classical signal processing transformations to
simultaneously process time and frequency data. The general relationship between wavelet
scales and frequency is to roughly match the scale. At low scale, compressed wavelets are
used. They correspond to fast-changing details, that is, to a high frequency. At high scale,
the wavelets are stretched. They correspond to slow changing features, that is, to a low
frequency.
The wavelet only has a time domain representation as the wavelet function ψ (t). The
mother wavelet is scaled (or dilated) by a factor of a and translated (or shifted) by a factor of
b to give
1 ⎛t−b⎞
ψ a , b (t ) = ψ⎜ ⎟. (2)
a ⎝ a ⎠
Wavelets are defined by the wavelet function ψ (t) (i.e. the mother wavelet) and scaling
function φ (t) (also called father wavelet) in the time domain. The wavelet function is in
effect a band-pass filter and scaling it for each level halves its bandwidth. This creates the
problem that in order to cover the entire spectrum, an infinite number of levels would be
required. The scaling function filters the lowest level of the transform and ensures that the
entire spectrum is covered. For a wavelet with compact support, φ (t) can be considered
finite in length and is equivalent to the scaling filter g.
Wavelets can be scaled and copied (known as "daughter wavelets") of a finite-length or fast-
decaying oscillating waveform (known as the "mother wavelet"). Wavelet transforms have
advantages over traditional Fourier transforms for representing functions that have
discontinuities and sharp peaks, and for accurately deconstructing and reconstructing finite,
non-periodic and/or non-stationary signals.
Wavelet transforms are classified into two broad groups: discrete wavelet transforms
(DWTs) and continuous wavelet transforms (CWTs). Note that both DWT and CWT are
continuous-time (analog) transforms and can represent continuous-time (analog) signals.
CWTs operate over every possible scale and translation whereas DWTs use a specific subset
of scale and translation values or representation grid. When wavelet-functions coefficients
are expressed as z-transform, then the number of zeros at π corresponds to the number of
vanishing moments. S, o p zeros in π means p vanishing moments.
Having p vanishing moments means that wavelet-coefficients for p-th order polynomial will
be zero. That is, any polynomial signal up to order p-1 can be represented completely in
scaling space. In theory, more vanishing moments meaning that scaling function can
represent more signals that are complex accurately, p which it is also called as the accuracy
of the wavelet.
Daubechies wavelets are a family of orthogonal wavelets defining a discrete wavelet
transform and they are characterized by a maximal number of vanishing moments for some
given support. With each wavelet type of this class, a scaling function (also called father
wavelet) generates an orthogonal multi-resolution analysis.
In general the Daubechies wavelets are chosen to have the highest number A of vanishing
moments, (this does not imply the best smoothness) for given support width N=2A, and
between the 2A−1 possible solutions the number one is chosen whose scaling filter has
extreme phase. The wavelet transform is also easy to put into practice by using the fast
wavelet transform. Daubechies wavelets are widely used in solving a broad range of
problems, e.g. self-similarity properties of a signal or fractal problems, signal discontinuities,
etc.
Coiflets are discrete wavelets designed by Ingrid Daubechies, at the request of Ronald
Coifman, to have scaling functions with vanishing moments. The wavelet is near symmetric
their wavelet functions have N/3 vanishing moments and scaling functions N/3−1, they are
used in many applications using Calderón-Zygmund Operators.
Db 10 and Db 9 are asymmetric, orthogonal and biorthogonal, Coif 5 is near symmetric,
orthogonal and biorthogonal. Figure 6 shows the scale and wavelet function of Coiflet 5,
Daubechies 9 and 10.
(a) (b) (c)

Fig. 6. Shows the scale function (left) and wavelet function (right) of (a) Coiflet 5,
(b) Daubechies 9 and (c) Daubechies 10
4.1 One stage filtering: Approximations and details

For many signals, the low-frequency content is the most important part because it gives to
the signal its identity. The high-frequency content, on the other hand, imparts nuance.
Consider the human voice. If high-frequency components are removed, the voice sounds
different, but the words are still audible and clearly recognized. However, if enough low-
frequency components are removed, the resulting audio signal is not clear. In wavelet
analysis, approximations are the high-scale, low-frequency components and the details are
the low-scale, high-frequency components of the signal. Figure 7 shows the steps for signal
decomposition.
cD high frequency
S
S 500 DWT coefficients
filters
low pass high pass cA low frequency

1000 data
points
A D
500 DWT coefficients
Fig. 7. Show the way to decompose a signal

4.2 Multiple-level decomposition

The decomposition process can be iterated, with successive approximations being
decomposed in turn, so that one signal is broken down into many lower resolution
components. This is called the wavelet decomposition tree that is shown on figure 8.
Fig. 8. Shows the process of performing, the multiple decomposition, which it is called
wavelet decomposition tree
4.3 Number of levels

Since the analysis process is iterative, in theory it can be continued indefinitely. Realistically,
the decomposition can proceed only until the individual details consist of a single sample or
pixel. Moreover, the processes include selecting a suitable number of levels based on the
nature of the signal, or on a suitable criterion such as entropy.
4.4 Wavelet reconstruction

Discrete wavelet transform can be used to analyze, or decompose, signals and images in a
process called decomposition or analysis. Conversely, reconstruction or synthesis is the
process of assembling hose components back into the original signal without loss of
information. While being this transformation, it is desirable to establish its investment, i.e. to
return to the original signal from the output tree. This methodology follows reasoning in the
opposite direction, i.e. from the coefficients while depending on the number of levels and
considering the high frequency (H’) and low (L’) bands that must be obtained from the
reconstructed signal S, shown in figure 9. The mathematical manipulation that affects
synthesis is called: the inverse discrete wavelet transforms (IDWT). In order to synthesize a
signal by using Wavelet Toolbox software, we reconstruct it from the wavelet coefficients.
Fig. 9. Show how to reconstruct a signal using wavelets
4.5 Wavelet using MATLAB

We will describe a simple method for wavelet transform of a given signal. You must choose
a wavelet function, which is the mother wavelet, as well as determining the value of the
signal wavelet scale, using the command wname. In this example we use a wavelet coif5
level 10.
wname = 'coif5'; lev = 10;
In most of the signals of low frequency components that give the signal most of its
information, while the high frequency components are responsible for incorporating
particular features, that is why we subdivide the components of a signal into two categories:
approaches (low frequencies) and details (high frequencies). To perform this decomposition
the wpdec command is used which is responsible for creating a tree that consists of a vector
in this case it is the signal to break down "y" the level to be decomposed lev = 10 and the
type of wavelet used, which in this case is coiflet 5 and it is stored as a tree in the tree
variable:
tree = wpdec(y,lev,wname);
We generate the coefficients of the decomposition of the signal using the wpcoef command
where needed as the variable information and the number of tree node that has a better
performance in the tree that was generated, which in this case is two.
We determine noise threshold by using wpbmpen command that returns a global threshold
THR for de-noising. THR obtained by a wavelet packet coefficients selection rule by means
of using a penalization method provided by Birge-Massart. T (in our case tree) is a wavelet
packet tree corresponding to the wavelet packet decomposition of the signal or image to be
de-noised. SIGMA is the standard deviation of the zero mean Gaussian white noise in the
de-noising model. alpha is a tuning parameter for the penalty term, which must be a real
number greater than 1. The sparsity of the wavelet packet representation of the de-noised
signal or image grows with alpha. Typically alpha = 2.
alpha = 2;
We use command wpdencmp that performs a de-noising or compression process of a signal,
when using wavelet packet. The ideas and the procedures for de-noising and compression
by using wavelet packet decomposition are the same as those used in the wavelets
framework. Wpdencmp (TREE,SORH,CRIT,PAR,KEEPAPP) has the same output arguments,
using the same options as above, but which were obtained directly from the input wavelet
packet tree decomposition TREE of the signal to be de-noised or compressed. SORH ('s' or
'h') stands for soft or hard thresholding. Best decomposition performed using entropy
criterion defined by string CRIT and parameter PAR. Threshold parameter is also PAR. In
addition, if CRIT = 'nobest' no optimization is done, and the current decomposition is
thresholded. If KEEPAPP= 1, approximation coefficients cannot be thresholded; otherwise,
they can be:
keepapp = 1;
All those parameters help us to de-noise our signals by using wavelets.
5. Sine signal example

With MATLAB, it is possible to process noisy signals containing certain information, such as
an audio one, in order to reduce the quantity of noise contained in it. Non-periodicity
characterizes an audio signal, which is composed by a large number of different frequencies

signals. This feature allows the use of conventional methods such as digital filters to
eliminate noise mixed into the signal.
In this section, we will introduce the treatment of noise in audio signals by using wavelet
transforms, which are included as a tool in MATLAB. To do this we will start by using a sine
wave signal, which is periodic and presents a well-known behavior.
First, it is necessary to define the time interval k, and to define the angular frequency w.
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
The variable h represents the argument of the sine function x in the next two instructions
h=w.*k;
x = sin(h);
Once we have defined the signal to be treated x, it is necessary to generate the noise source
in order to be mixed with the original signal. One of the most common sources of noise is
Gaussian white noise, which contains all frequencies. Thus to generate white Gaussian noise
we use the awgn instruction described in section 3.4.
y = awgn(x,0,'measured');
alpha = 2;
keepapp = 1;
Correlation between both signals, original and filtered one, is the parameter to compare
them. We used the command crosscorr, which computes and plots the sample cross-
correlation function XCF between two univariate, stochastic time series. To plot the XCF
sequence without the confidence bounds, set nSTDs = 0.
D=crosscorr(x,xd);
Finally, we plot three figures.
figure(1)
plot(k,xd)
hold on
plot(k,y,'k')
hold on
plot(k,x,'g')
legend('Denoise signal','Signal with AWGN','Original signal');
figure(2)
plot(z,D)
legend('Correlation @ 0');
The sinusoidal waveform x represents the signal to which is added white Gaussian noise;
this will subsequently be reduced to recover the sine wave.
We evaluate three wavelets families, Symlets 2 to 8, Daubechies 2 to 10 and Coiflet 1 to 5 by
using the program presented above. Our results show that Coiflet 5 and Daubechies 9 and
10 are the best options for better de-noised in our signals. We choose cross correlation to
evaluate the best performance; the cross correlation number that we select is the maximum
at zero. Figure 10 shows the original signal sinus waveform. Part (b) is an extension of two
periods of part (a). We choose a frequency of 250 Hz due to voice is in that range.
1 1
Amplitude
Amplitude
0 0
-1 -1
0.9 0.92 0.94 0.96 0.98 1 0.9 0.902 0.904 0.906 0.908
Time (s) Time (s)
Fig. 10. Shows original sinus waveform. The right one shows a zoom view of left figure
We add white Gaussian noise to sine waveform represented in Figure 11 and the resulting
graph is the plot shown in Figure 11. We set SNR to AWGN=10
1 1
Amplitude
Amplitude
0 0
-1 -1
0.9 0.92 0.94 0.96 0.98 1 0.9 0.902 0.904 0.906 0.908
Time (s) Time (s)
Fig. 11. Shows sine waveform with AWGN=10.

After running the program, we find the cross correlation D between original signal and
signal de-noise. Figure 12 presents the result
Fig. 12. Shows cross correlation of original signal and signal de-noise
Figure 13 shows the plot of a signal after its processing method using Coiflet 5.
1 1
Amplitude
Amplitude
0 0
-1 -1
0.9 0.92 0.94 0.96 0.98 1 0.9 0.902 0.904 0.906 0.908
Time (s) Time (s)
Fig. 13. Shows signal after processing method of de-noise using Coiflet 5
Evaluation of the resultant waveform xd presented in Figure 14 is compared with the
original sine function x form Figure 11 gives numbers higher than 99% as presented in
Figure 13. These results support the reliability of the proposed method for de-noising.
6. Audio signal example

As it has been described in section 2.1, to obtain an audio signal, we select the audio block
and we connect it to the multimedia file block. This information is saved in a user-specified
file with extension .wav and then we use the program to extract this information and
process it with wavelets coif5, db9 and db10. Figure 14 shows the original audio signal, audio
signal with noise and the recovered signal using the wavelet coif5. Figure 15 shows the best
correlation using the above wavelets.
Original Signal
1
Amplitude
-1
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Time (s)
Signal With Noise

2
Amplitude
-2
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Time (s)
2 Signal Denoise
Amplitude
-2
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
Time (s)
Fig. 14. Shows original audio signal, audio signal with noise and the recovered signal
To make the signal processing we use the next code:
clc,close all,clear all
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
h=w.*k;
y = awgn(x,10,'measured'); % Add white Gaussian noise.
Fig. 15. Shows cross-correlation for determine the best result after noise reduction
alpha = 1.8;
thr = wpbmpen(tree,sigma,alpha)
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,y);
z=-20:1:20;
figure(1)
subplot(311)
plot(k,x)
xlabel('time')
ylabel('Amplitude')
title('original signal');
subplot(312)
plot(k,y,'k')
xlabel('time')
ylabel('Amplitude')
title('signal with noise');
subplot(313)
plot(k,xd,'g')
xlabel('time')
ylabel('Amplitude')
title('signal denoise');
figure(2)
plot(z,D)
title('coif5')
legend('Correlation @ 0');
wavwrite(xd,Fs,'voice5')
In signal processing, analogue-to-digital converters also suffer linearity errors, they add
noise, distortion, and introduces quantization error due to the precision of their voltage
sampling process. The result of all this is a computerized sequence of samples that may not
be as closely related to the real-world sound as you might expect. Do not be surprised when
high-precision analysis or measurements are unrepeatable due to noise, or if delicate
changes made to a sampled audio signal are undetectable to the naked ear upon replay.
7. Graphical Interface using GUIDE

For better understanding of the content of this chapter, we have developed a graphical
interface, only in the case of a sine wave. We used GUIDE of MATLAB to build this
interface, you need pop-up menu, slider, edit text, four push button and four graphics
(axes), after all that is placed in your figure you need to program each item. Figure 16 shows
how all of this should be seen.
Fig. 16. Shows graphical interface using GUIDE

First you need to configure axes, you do this by double clicking on the graphic, this will
show you an inspector on figure 17, you need to change nextplot from replace to replacechildren
that means to remove all child objects when HandleVisibility property is set to an on function
and then to reset figure NextPlot property to an add function. To set axes limits you need to
change Xlimit from 0.20 to 0.24, and in our case, Ylimit from -1 to 1.
Fig. 17. Shows configurations of axes using inspector

In our case, a slider is coupled to an edit text component so that: The edit text displays the
current value of the slider. The user can enter a value into the edit text box and cause the
slider to update to that value. Both components update the appropriate model parameters
when activated by the user. Our slider is called AWGN (average white generator noise) and
it is from 0 to 10 SNR.
function complete_OpeningFcn(hObject, eventdata, handles, varargin)
% Choose default command line output for example5
handles.output = hObject;
clc
% initalize error count and use edit1 object's userdata to store it.
data.number_errors = 0;
set(handles.edit1,'UserData',data)
% Update handles structure
guidata(hObject, handles);
% --- Executes on slider movement.
function slider1_Callback(hObject, eventdata, handles)
set(handles.edit1,'String',...
num2str(get(hObject,'Value')));
% --- Executes during object creation, after setting all properties.
function slider1_CreateFcn(hObject, eventdata, handles)
function edit1_Callback(hObject, eventdata, handles)
val = str2double(get(hObject,'String'));
% Determine whether val is a number between 0 and 10.
if isnumeric(val) && length(val)==10 && ...
val >= get(handles.slider1,'min') && ...
val <= get(handles.slider1,'max')
set(handles.slider1,'Value',val);
else
% Retrieve and increment the error count.
% Error count is in the edit text UserData,
% so we already have its handle.
data = get(hObject,'UserData');
data.number_errors = data.number_errors+1;
% Save the changes.
set(hObject,'UserData',data);
% Display new total.
set(hObject,'String',...
['You have entered an invalid entry ',...
num2str(data.number_errors),' times.']);
% Restore focus to the edit text box after error
uicontrol(hObject)
end
function edit1_CreateFcn(hObject, eventdata, handles)
if ispc && isequal(get(hObject,'BackgroundColor'),
get(0,'defaultUicontrolBackgroundColor'))
set(hObject,'BackgroundColor','white');
end
In the case of the pushbutton 1 that is called sine, and if it only shows sine signal and signal
with noise, it needs to be programmed as follow
% --- Executes on button press in pushbutton1.
function pushbutton1_Callback(hObject, eventdata, handles)
k =(0:9.0703e-005:5);
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h);
f=get(handles.slider1,'Value');
y = awgn(x,f,'measured');
D=crosscorr(x,y);
z=-20:1:20;
plot(handles.axes1,k,x)
plot(handles.axes2,k,y)
plot(handles.axes3,z,D)
For programming, push button 2, called de-noise sine, this button performs all the
processing method, which was described previously. It is necessary to write all this code
menu= get(handles.popupmenu1,'Value');
switch menu
case 1 %case 1: coiflet 5
·% example3 code
k =(0:9.0703e-005:5);
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h);
wname = 'coif5'; lev = 10; % wavelet that need to change!
alpha = 2;
thr =wpbmpen(tree,sigma,alpha);
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
plot(handles.axes3,k,xd)
set(gca,'XLim',[ 0.2, 0.24], ...
'YLim',[-1 1]);
case 2 %case2 Daubechies 10
·% example3 code
case 3 %Case 3: Daubechies 9
·% example3 code
End
For programing push button 3, called de-noise audio, this button performs all processing
method, which was described previously. It is necessary to write all this code
switch menu
case 1 %case 1: Coiflet 5
·% example4 code
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
h=w.*k;
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
case 2 %case2 Daubechies 10
·% example4 code
·% example4 code
end
For programing push button 4 called exit
close all
Figure 18 (left) shows AWGN 1, and it plots original signal, in this case sine, and signal with
noise, cross correlation between them. Figure 18 (right) shows sine after de-noise and cross
correlation between the original signal and the de-noised.
Fig. 18. (up) AWGN at 1 SNR with a correlation of 0.7497 and (down) sine after de-noise
with SNR of 10 and correlation of 0.997
Fig. 19. (up). AWGN at 10 SNR with a correlation of 0.9966 after de-noise using Daubechies 9
and (down) AWGN at 10 SNR with a correlation of 0.9967 after de-noise using Daubechies 10
Fig. 20. (up). AWGN at 10 SNR with a correlation of 0.9609 after de-noise using Coiflet 5 and
(down) AWGN at 10 SNR with a correlation of 0.9606 after de-noise using Daubechies 9
Figure 19 shows de-noise of sine with noise using AWGN of 10, using Daubechies 9 and 10,
this wavelets show a better performance that any others. Figure 20 shows behavior of Coiflet
5 and Daubechies 9 using AWGN of 10 adding to audio signal.
In this section, it was described how to build a graphical interface using MATLAB code that
was developed to de-noised sine and audio signals. This interface helps to be able to visualize
the results obtained throughout this chapter, in addition to make it accessible to the user.
8. Conclusions
We provide a practical approach in how to put into practice wavelets in noisy audio data to
improve clarity and signal retrieval. Since there are no books that show the code for a
graphical interface with audio processing using wavelets, this chapter presents MATLAB
code to reduce the Gaussian white noise in periodic signals (sine function) and in audio
signals (composed of several frequencies) using wavelet analysis. We compared different
wavelet families: Symlets, Daubechies and Coiflets, and we used cross-correlation to
determine the best fit between an original signal and the processed one. By using Coiflet 5,
Daubechies 9 and 10 we obtained the best result because they have a higher correlation at
zero. Our signal processing technique recovers signal with a correlation higher than 99%. In
analysis for audio signal with added Gaussian white noise, while using the technique we
obtained a recovered signal with a correlation of 95%. This analysis is very useful to help the
reader understand the know how in removing noise from a signal by using wavelets.
Therefore, when a signal shows a periodic signal extraction from noise, it will be
satisfactory. The graphical interface presented in the last section was performed while using
GUIDE this one gives the readers a guideline to develop their own projects in MATLAB.
9. Acknowledges
The authors would like to thank Dr. Karen Esmonde-White for her helpful review and
comments of this chapter. AEVL would like to thanks to Fundacion Pablo Garcia for help
and support.
Apendix A: Five steps to a continuous Wavelet Transform

Here are the five steps of an easy recipe for creating a Continuous Wavelet Transform
(CWT), see Figure A:
1. Take a wavelet and compare it to a section at the start of the original signal.
2. Calculate a number C, that represents how closely correlated the wavelet is with this
section of the signal. The larger the number C is in absolute value, the more the
similarity appears. If the signal energy and the wavelet energy are equal to one, C may
be interpreted as a correlation coefficient. Note that, in general, the signal energy does
not equal one and the CWT coefficients are not directly interpretable as correlation
coefficients. Therefore, the CWT coefficients are different when you compute the CWT
for the same signal by using different wavelets.
3. Shift the wavelet to the right and repeat steps 1 and 2 until you have covered the whole
signal.
4. Scale (stretch) the wavelet and repeat steps 1 through 3.
5. Repeat steps 1 through 4 for all scales.
signal signal
wavelet wavelet
C=0.0102
signal signal
wavelet wavelet
C=0.2247
Fig. A. Shows recipe for creating a CWT
Appendix B: User Interface MATLAB code

In this appendix, it shows the complete code to develop the GUI using the GUIDE of
MATLAB, and develops it as an example using a sine wave signal, which is added a certain
level of noise and signal is shown graphically also recovered as the ratio correlation between
the original signal and recovered signal.
function varargout = complete(varargin)
% Begin initialization code - DO NOT EDIT
gui_Singleton = 1;
gui_State = struct('gui_Name', mfilename, ...
'gui_Singleton', gui_Singleton, ...
'gui_OpeningFcn', @complete_OpeningFcn, ...
'gui_OutputFcn', @complete_OutputFcn, ...
'gui_LayoutFcn', [] , ...
'gui_Callback', []);
if nargin && ischar(varargin{1})
gui_State.gui_Callback = str2func(varargin{1});
end
if nargout
[varargout{1:nargout}] = gui_mainfcn(gui_State, varargin{:});
else
gui_mainfcn(gui_State, varargin{:});
end
% End initialization code - DO NOT EDIT
% --- Executes just before complete is made visible.
function complete_OpeningFcn(hObject, eventdata, handles, varargin)
handles.output = hObject;
clc
% Initalize error count and use edittext1 object's userdata to store it.
data.number_errors = 0;
set(handles.edit1,'UserData',data)
% Update handles structure
guidata(hObject, handles);
% --- Outputs from this function are returned to the command line.
function varargout = complete_OutputFcn(hObject, eventdata, handles)
% Get default command line output from handles structure
varargout{1} = handles.output;
k =(0:9.0703e-005:5);
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h);
D=crosscorr(x,y);
z=-20:1:20;
switch menu
case 1 %case 1: Coiflet 5
k =(0:9.0703e-005:5);
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h);
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
set(gca,'XLim',[ 0.2, 0.24], ...
'YLim',[-1 1]);
case 2 %Case2 Daubechies 10
k =(0:9.0703e-005:5);
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h);
wname = 'db10'; lev = 10;
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
set(gca,'XLim',[ 0.2, 0.24], ...
'YLim',[-1.1 1.1]);
k =(0:9.0703e-005:5);
w=500*pi;
h=w.*k;
x = sin(h);
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
end

switch menu
case 1 %case 1: coiflet 5
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
h=w.*k;
f=gethandles.slider1,'Value');
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
case 2 %case 2 Daubechies 10
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
h=w.*k;
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
k = 0:9.0703e-005:5;
w=500*pi;
h=w.*k;
alpha = 2;
keepapp = 1;
D=crosscorr(x,xd);
z=-20:1:20;
end
% --- Executes on slider movement.
function slider1_Callback(hObject, eventdata, handles)
set(handles.edit1,'String',...
num2str(get(hObject,'Value')));
function slider1_CreateFcn(hObject, eventdata, handles)
if isequal(get(hObject,'BackgroundColor'), get(0,'defaultUicontrolBackgroundColor'))
set(hObject,'BackgroundColor',[.9 .9 .9]);
end
function edit1_Callback(hObject, eventdata, handles)
val = str2double(get(hObject,'String'));
% Determine whether val is a number between 0 and 1.
if isnumeric(val) && length(val)==10 && ...
val >= get(handles.slider1,'min') && ...
val <= get(handles.slider1,'max')
set(handles.slider1,'Value',val);
else
% Retrieve and increment the error count.
% Error count is in the edit text UserData,
% so we already have its handle.
data = get(hObject,'UserData');
data.number_errors = data.number_errors+10;
% Save the changes.

set(hObject,'UserData',data);
% Display new total.
set(hObject,'String',...
['You have entered an invalid entry ',...
num2str(data.number_errors),' times.']);
% Restore focus to the edit text box after error
uicontrol(hObject)
end
function edit1_CreateFcn(hObject, eventdata, handles)
end
% --- Executes on selection change in popupmenu1.
function popupmenu1_Callback(hObject, eventdata, handles)
function popupmenu1_CreateFcn(hObject, eventdata, handles)
end
close all
10. References
Abbate A, Decusatis C. M, Das P. K. (2002). Wavelets and subbands: fundamentals and
applications, ISBN 0-8176-4136-X, Birkhauser, Boston, USA.
Bahoura M & Rouat J, (2006). Wavelet speech enhancement based on time–scale adaptation,
Speech Communication, Vol. 48, No. 12, pp: 1620-1637. ISSN: 0167-6393.
Davis, G, M, (2002). ‘Noise Reduction in Speech Applications, CRC Press LLC, ISBN 0-8493-
0949-2, USA.
Dong E & Pu X. (2008). Speech denoising based on perceptual weighting filter, Proceedings
of 9th IEE International Conference on Signal Processing, pp: 705-708, October 26-
29, Beijing. Print ISBN: 978-1-4244-2178-7.
Gold, B. & Morgan, N. (1999) Speech and audio signal processing: processing and
perception of apeech, and music, John Wiley & Sons, INC., ISBN: 0-471-35154-7,
New York, USA.
Johnson M. T, Yuan X and Ren Y, (2007). Speech Signal Enhancement through Adaptive
Wavelet Thresholding, Speech Communications, Vol. 49, No. 2, pp: 123-133, ISSN:
0167-6393.
Képesia M & Weruaga L. (2006). Adaptive chirp-based time–frequency analysis of speech
signals, Speech Communication, Vol. 48, No. 5, pp: 474-492. ISSN: 0167-6393.
Li N & Zhou M. (2008). Audio Denoising Algorithm Based on Adaptive Wavelet Soft-
Threshold of Gain Factor and Teager Energy Operator, Proceedings of IEEE
International Conference on Computer Science and Software Engineering, Vol. 1,
pp: 787-790. Print ISBN: 978-0-7695-3336-0.
Mcloughlin I (2009). Applied Speech and Audio Processing With MATLAB Examples,
Cambridge University Press, ISBN-13 978-0-521-51954-0, UK.
Minkoff, J. (2002). Signal Processing Fundamentals and Applications for Communications
and Sensing Systems, ARTECH HOUSE, INC., ISBN 1-58053-360-4, USA.
Shankar B. J & Duraiswamy K. (2010). Wavelet-Based Block Matching Process: An Efficient
Audio Denoising Technique,European Journal of Scientific Research, Vol.48 No.1,
pp.16-28. ISSN 1450-216X.
Tuzlukov, V. P. (2002). Signal processing noise, CRC Press LLC, ISBN 0-8493-1025-3,USA.
Vaseghi, S. V. (2008), Advanced Digital Signal Processing and Noise Reduction, fourth
edition, John Wiley & Sons Ltd., ISBN 978-0-470-75406-1 (H/B), United Kingdom.
Visser E, Otsuka M & Lee T W. (2003). A spatio-temporal speech enhancement scheme for
robust speech recognition in noisy environments, Speech Communication, Vol. 41,
No. 2-3, pp: 393-407. ISSN: 0167-6393.
Wang C T& Wang H. G, (2003). Enhancement of single channel speech based on masking
property and wavelet transform, Speech Communication, Vol. 41, No 2-3, pp: 409-
427. ISSN: 0167-6393.
Wang C T& Wang H. G (2007). Speech enhancement using hybrid gain factor in critical-
band-wavelet-packet transform, Digital Signal Processing, Vol. 17, No. 1, pp: 172-
188. ISSN: 1051-2004.
Raman spectroscopy of blood in-vitro
A.E. Villanueva-Luna1*, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A. Flores-Gil2, C.M. Ortiz-
Lima1, J.A Delgado-Atencio1.
1
Departamento de Óptica, Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica, Luis
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Autónoma del Carmen. C. 56 #4 por Avenida Concordia
Abstract
We present Raman spectra from a sample of 8 volunteers that have different type of blood. The experimental data were
carried out using a 785 nm excitation laser and an ocean optics spectrometer of 6 cm -1 resolution, with a used spectral
region from 1000 to 1800 cm-1. We find Raman features at 1000 and 1542 cm-1 regarded with hemoglobin and its
derivatives. Also we find Raman features at 1248 and 1342 cm-1 that are now regarded with pure fibrin. In this work, we
use Principal Component analysis (PCA) to determine all variations of our samples, which allows us to define a
classification of the influence of the blood type. Finally, we found vibrational lines of cholesterol, glucose and
triglycerides that are reported in literature.
Keywords: Blood, Raman spectroscopy, sensors, PCA.
1. Introduction
There is considerable interest in advancing the science and technology of spectroscopic analysis of human tissue, either
qualitative and quantitative or in vitro and in vivo.
Raman spectroscopy has been used to analyze the structures of heme and hemoglobin in blood [1], to compare the
wavelength effects on whole blood and oxy-hemoglobin [2], to analyze oxygenated and deoxygenated erythrocytes [3],
and to analyze colored dyes as part of a stain on fibers and other surfaces [4].
Blood is a specialized bodily fluid in animals that delivers necessary substances such as nutrients and oxygen to the cells
and transports metabolic waste products away from those same cells.
A blood type (also called a blood group) is a classification of blood based on the presence or absence of inherited
antigenic substances on the surface of red blood cells (RBCs). These antigens may be proteins, carbohydrates,
glycoproteins or glycolipids, depending on the blood group system. Some of these antigens are also present on the
surface of other types of cells of various tissues. Several of these red blood cell surface antigens can stem from one allele
(or very closely linked genes) and collectively form a blood group system [5].
Hispanics are the most likely group to have O blood type. It is reported that 71% of blood donors in Mexico are type O;
54% of blood donors in Venezuela, and 62% in Guatemala are type O blood donors [6]. We show in the table 1 the
Hispanic blood type distribution. It shows that most of the Hispanic people are O+.
*
Correspondence to eug69869@yahoo.com
Proc. of SPIE Vol. 8229, 82291D · © 2012 SPIE · CCC code: 1605-7422/12/$18 · doi: 10.1117/12.908689
Table 1 Hispanic blood type distribution (Estimated aggregate) [6].
Blood Type Population

O+ 53%
O- 4%
A+ 29%
A- 2%
B+ 9%
B- 1%
AB + 2%
AB - 0.2%
In this paper, we ask for volunteers with different blood type, with the goal of finding the variation of cholesterol,
glucose and triglycerides depending on blood type.The spectral region used ranges from 1000 to 1800 cm-1.
We look for vibrational lines at 1000, and 1542 cm-1 that are related with hemoglobin and its derivatives. Moreover,
Vibrational lines at 1248 and 1342 cm-1 are correlated to pure fibrin. We use principal component analysis to classify the
influence of blood type and finally we Gaussian fit vibrational lines of cholesterol, glucose and triglycerides that are
reported in literature.
2. Method of analysis
In this experiment, we worked with 15 volunteers. The main complication was that blood type in the geographic region
in we find most people have type O +. We only found 3 different blood type in all the volunteers, O+, O- and B- with
this small population we cannot make a statistical conclusion about the variation of glucose, cholesterol and triglycerides
depending of blood type. For this reason, we took into account only 8 samples and measured the variation between the
same blood samples type and sample S6 type B-.
In this work, we use Principal Component analysis (PCA) to determine all variations of our samples. PCA is probably
the most widespread multivariate statistical technique used in chemometrics because of the importance of multivariate
measurements in chemistry.
PCA provides a direct mapping of high-dimensional data into a lower-dimensional space containing most of the
information in the original data. The coordinates of the samples in the new space are called scores. The new dimensions
are linear combinations of the original variables, and are called loadings. PCA has many advantages: it is simple, has a
unique analytical solution that optimizes a clear and unambiguous criterion, and often leads to an easier interpretation of
data representation. The price we have to pay is that we do not have a small set of wavelengths carrying the information
but a small set of principal components, in which all wavelengths are represented.
One of the simplest plots is that of the scores of one principal component (PC) against the other. Below we will look
only at the first two PCs, for simplicity. It is not, however, only the scores those are of interest but sometimes the
loadings. Exactly the same principles apply in that the value of the loadings at one PC can be plotted against that at the
other PC.
3. Experimental setup
The Raman spectrometer employed for this work was the QE65000 of Oceans Optics, it has a resolution of 0.14-7.7 nm
FWHM (~ 6cm-1), and enables integration time from 8 ms to 15 min. We used the spectral range that varies from 1000 to
1800 cm-1.
The arrangement covers an experimental laser as excitation source of 785 nm. We used the inphotonics Raman probe
RIP-RPB with two fibers, one of them works as a collector and the other one is used to carries the excitation source. The
core diameters are 200 μm and 90 μm respectively. This Raman probe has a focal length of 7.5 mm. Figure 1 shows the
experimental setup that we employed.
785nm laser
QEÔS000 spectrometer
Figure 1 experimental setup that was used to measure all the samples
4. Results
The protocol we used for this study was the following. We asked volunteers to attend with empty stomach early to avoid
influence of foods with high sucrose content. Taking each sample with lancets used in commercial glucometers. We
extracted a drop of blood, which was placed on a 150 micron thick cover slip. One of the considerations made for this
work is to have a thick enough drop of blood to avoid the influence of the glass due to penetration depth of the excitation
source. This consideration due to fluorescence caused by the glass masks all the spectral lines we need in range from
1000 to 1800 cm-1.
Figure 2 shows a visual comparison of the 8 samples. It highlights two spectral bands of hemoglobin and two lines
related to pure fibrin. These bands are highlighted as being of great importance in the Raman spectra of blood previously
reported in the literature [14].
S8
S7
S6
S5
S4
S3
S2
S1
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

-1
Raman shift(cm )
Figure 2 Raman spectra of samples. In this figure, gray areas represent the hemoglobin lines, yellow lines are related to pure fibrin.
To show all the variations of Raman spectra of the 8 different samples, we normalized all the spectra at 1002 cm-1.
Figure 3 shows 8 samples in a range between 1000 and 1800 cm-1.
Figure 4 displays the distribution and variance of the samples using the first and second principal component.
We use biplot to help visualization of both, the principal component coefficients for each variable and the principal
component scores for each observation in a single plot. Biplot also allows visualizing the magnitude and sign of each
variable's contribution to the first two or three principal components, and how each observation is represented in terms of
those components.
To show variations and trends in the Raman spectra of the 8 volunteers, we made principal components analysis.
Figure 5 shows each of the eight variables, represented in this plot by a vector. The direction and length of the vector
indicates how each variable contributes to the second and third principal components in the plot.
In the table 2 we show the spectral lines location and the assignment that are reported in the literature.
Table 2 Raman assignments of dried blood [7-19].
Assignment Spectral lines(cm-1)

Hemoglobin 1000, 1542
Pure Fibrin 1248, 1342
Glucose 1065, 1126, 1365, 1456
Triglycerides 1081, 1256, 1437
Cholesterol 1433, 1658, 1738
4
S1
S2
3.5
S3
S4
3 S5
S6
2.5 S7
S8
2
1.5
0.5
0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
-1
Raman shift (cm )
-1 -1
Figure 3 Raman spectra from 1000 to 1800 cm normalized at 1002 cm
0.6
S2
0.5 S3
0.4
S1
2nd Principal Component
0.3
0.2
0.1
0
S4
-0.1
S6
-0.2
-0.3 S7 S8 S5
-0.4
0.24 0.26 0.28 0.3 0.32 0.34 0.36 0.38 0.4 0.42
1st Principal Component
Figure 4 In this figure is shown PC distribution of the samples using first and second principal component.
Figure 6 shows the spectrum of 8 samples and displays the spectral bands of cholesterol, glucose and triglycerides and
we made a Gaussian fit of it that are reported in the literature.
S2
0.6
0.4
S6
0.2 S5
Component 3
S8
0
-0.2 S1
S7
-0.4 S4 S3
-0.6
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6

Component 2
Figure 5 It is show in a biplot second and third principal component and scores. Each vector shows contribution of variables in the
second and third principal component.
4
S1
S2
3.5
S3
S4
3
S5
S6
2.5 S7
S8
2 GLU
CHO
1.5 TRI
0.5
0
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Raman shift (cm-1 )
Figure 6 Raman spectra of all the samples, and Gaussian fit of some spectral lines of glucose, cholesterol and triglycerides from 1000
to 1800 cm-1.
5. Conclusions
In this paper, we show the spectral bands of glucose, cholesterol and triglycerides. We could not show the effect caused
by blood type because in the geographic region in which we are located is quite difficult to get donors with different type
than O +. The results we present after performing PCA hints that there are variations between the donor B- sample and
the other 7 samples O +.
6. Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge to thanks to all volunteers that help in this project. AEVL would like to thanks to
Fundacion Pablo Garcia for help and support.
7. References
[1] Anthea M, Hopkins J, McLaughlin C W, Johnson S, Warner M Q, LaHart D, Jill Wright D. [Human Biology and
Health] Englewood Cliffs, New Jersey, USA: Prentice Hall. ISBN 0-13-981176-1 (1993).
[2] Wood BR, Caspers P, Puppels GJ, Pandiancherri S, McNaughton D ,”Resonance Raman spectroscopy of red blood
cells using near-infrared laser excitation”, Anal Bioanal Chem 387:1691–1703(2007)
[3] White PC, Rodger C, Rutherford V, Finnon Y, Smith WE, Fitzgerald M, “Surface enhanced resonance Raman
scattering (SERRS) spectroscopy. A powerful technique for the forensic analysis of colourants?” Proc SPIE 3576:77–86
(1999).
[4] Khalil O. S. “Spectroscopic and Clinical Aspects of Noninvasive Glucose Measurements”, Clinical Chemistry, 45,
165-177 (1999).
[5] Chaiken J. Ellis K., Eslick P., Piacente L., and Voss E., “Noninvasive in vivo tissue and pulse modulated Raman
spectroscopy of human capillary blood and plasma,” Proc. SPIE 6093, 609305 (2006).
[6] www.hispanicblood.com
[7] Grasselli J, [Chemical applications of Raman spectroscopy] Wiley, New York (1981).
[8] Ozaki Y, Mizuno A, Sato H, Kawauchi K, Muraishi S, “Biomedical application of near-infrared Fourier transform
Raman spectroscopy. Part I: The 1064-nm excited Raman spectra of blood and met hemoglobin” Appl Spectrosc
46:533–536 (1992).
[9] Venkatesh B, Ramasamy S, Mylrajan M, Asokan R, Manoharan PT, Rifkind JM, “Fourier transform Raman
approach to structural correlation in hemoglobin derivatives”, Spectrochim Acta Part A Mol Biomol Spectrosc
55A:1691–1697 (1999).
[10] Aubrey KL, Thomas GJ Jr, “Raman spectroscopy of filamentous bacteriophage Ff (fd, M13, f1) incorporating
specifically-deuterated alanine and tryptophan side chains. Assignments and structural interpretation”, Biophys J
60:1337–1349 (1991).
[11] Johnson CR, Ludwig M, Asher SA, “Ultraviolet resonance Raman characterization of photochemical transients of
phenol, tyrosine, and tryptophan”, J Am Chem Soc 108:905–912 (1986).
[12] Hu X, Spiro TG “Tyrosine and tryptophan structure markers in hemoglobin ultraviolet resonance Raman spectra:
mode assignments via subunit-specific isotope labeling of recombinant protein”, Biochemistry 36:15701–15712 (1997).
[13] Spiro T. G. and Strekas T. C., „„Resonance Raman spectra of hemoglobin and cytochrome c: inverse polarization
and vibronic scattering,‟‟ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2622–2626 (1972).
[14] Sato, H.; Chiba, H.; Tashiro, H.; Ozaki, Y.,”Excitation wavelength-dependent changes in Raman spectra of whole
blood and hemoglobin: comparison of the spectra with 514.5-, 720-, and 1064- nm excitation”, J. Biomed. Opt., 6, 366-
370 (2001).
[15] Asher, S.A.; Vickery, L.E.; Schuster, T.M.; Sauer, K, “Resonance Raman spectra of methemoglobin derivatives.
Selective enhancement of axial ligand vibrations and lack of an effect of inositol hexaphosphate” , Biochemistry, 16,
5849-5856 (1977).
[16] Kitamura A, Nomura F, Karatsu T, “Method for measuring glucose concentration in blood using infrared
spectroscopy and instrument employing it”, Patent No. WO 2006/011487 A1 41 (2006).
[17] Low-Ying S, Shaw RA, Leroux M, Mantsch HH, “Quantitation of glucose and urea in whole blood by mid-infrared
spectroscopy of dry films”, Vib Spec 28:111–116 (2002).
[18] Liu Q, Xu K, Jiang C “Near-infrared spectroscopy in noninvasive measurement of human blood glucose”, Jiguang
Shengwu Xuebao 13:129–135(2004).
[19] Ding D, Zhang HY, Wang LQ, Zhou WD, Wang XM, Shen XG,” Measurement and analysis of the glucose
concentration of the whole blood using near-infrared spectroscopy”, Jiguang Yu Hongwai 33:328–330 (2003).
Low abundances of synthetics lipids in phantoms
A.E. Villanueva-Luna1*, A. Santiago-Alvarado2, J. Castro-Ramos1, S. Vazquez-Montiel1, A.
Flores-Gil3, J. Aguilar Soto1, J.A Delgado-Atencio1.
1
2
Oaxaca. México.
3
Abstract
Phantoms simulate optical characteristics of tissues. Phantoms use to mimic light distributions in living tissue. Several
Phantoms compositions made of silicone, polyester, polyurethane, and epoxy resin have been described in the literature.
These kinds of phantoms have the problem of long time preservation. In this work, we describe the fabrication and
characterization of phantoms with low concentrations of synthetic lipid using Raman spectroscopy. We fabricate four
phantoms made of Polydimethylsiloxane (PDMS). These phantoms have synthetic lipid content of cholesterol and
triglycerides.
The size of our phantoms is 1 x 1 cm and 5 mm of thickness.We used the point-to-point mapping technique. Finally, we
compared advantages and performance of made PDMS and gelatin phantoms.
Keywords: PDMS, Raman spectroscopy, Mapping, cholesterol, triglycerides.
1. Introduction
There are many varieties of phantoms such as those made of gelatin, polyurethane, silicon, PDMS, etc. These varieties
try to minimize animal usage. A polydimethylsiloxane (PDMS)-based liver phantom was developed to mimic the optical
properties of porcine liver [1]. PDMS tissue phantoms to simulate melanomas of different thicknesses [2]. PPTR, OCT
and US measurements to recorded from PDMS tissue phantoms and results to compare in terms of axial imaging range,
axial resolution and imaging time [3]. PDMS is popular in the fabrication of microfluidic devices, phantom’s PDMS are
expected to provide powerful tools not only to better understand the biophysical behavior of blood flow in microvessels,
but also for disease diagnosis. PDMS polymers have many useful properties, including good optical transparency and
biocompatibility, easily reversible sealing to glass, elasticity, replication of fine and complex geometries, permeability to
gases, thermal stability, and low cost [4-7]. Because of these properties, this material was suitable for studying several
phenomena. PDMS phantoms are suitable for optical fluorescence imaging systems based on quantum dot
nanofluorophores in aqueous solution, and illustrate examples of phantom designs and measurements [8].
In this work, we present the fabrication and characterization of phantoms with low concentrations of synthetic lipid using
Raman spectroscopy. We fabricate four phantoms made of Polydimethylsiloxane (PDMS), as well as we fabricate the
same amount of phantoms with gelatin, these phantoms have synthetic lipid content of cholesterol and triglycerides. Our
phantoms size is 1 cm x 1 cm and 5 mm of thickness, and they were mapped using the point-to-point mapping technique.
Finally, we compared advantages and performance of phantoms made of PDMS and gelatin.
Proc. of SPIE Vol. 8229, 82290S · © 2012 SPIE · CCC code: 1605-7422/12/$18 · doi: 10.1117/12.908386
2. Materials and method of fabrication
The fabrication process of PDMS-based Phantoms under the proposed methodology is directly due to the easy cure and
material handling. The phantoms developed have a thickness from 2 to 5 cm. The material used is PDMS Sylgard 184,
Glyceryl tripalmitate also known as Glycerol tripalmitate and Tripalmiti (C 51H98O6) and Cholesteryl palmitate also
known as 5-Cholestene 3-palmitate (C43H76O2).
The methodology developed for the manufacturing consists of 4 steps:
Step 1. To measure components in proportion 10:1 (base: curing agent) for the PDMS and an amount 10% for extras
such as Glyceryl and cholesteryl we used an analytical balance with an error of 0.1 mg. We used an analytical balance
Ohaus Voyager model [9]
Step 2. To blend the components by manual stirring until we obtained a well mixture of them.
Step 3. To remove air bubbles in the mixture using a sonic bath during 5 minutes.
Step 4. To pour the mixture into a flat glass surface previously cleaned with isopropyl alcohol. Phantoms were cured
inside of a laminar flow hood in a horizontal position for seven days at room temperature (25 ° C) to prevent
contamination by solid particles [10].
The concentration of each phantom is listed in the table 1. Figure 1 show PDMS-based Phantoms and how they were cast
it.
Table 1 concentration of each phantoms proposed in this work.
Number of phantom glyceryl cholesteryl

1 6.3 mg 5mg
2 3.2 mg 13.6 mg
3 10.8 mg 10 mg
4 8.8 mg 25.1 mg
5 0 0
6 0 0
Figure 1 it is shown PDMS phantoms and it container.
3. Experimental setup
The Raman spectrometer employed for this work was the QE65000 of Oceans Optics, it has a resolution of 0.14-7.7 nm
FWHM (~ 6cm-1), and enables integration time from 8 ms to 15 min. We used the spectral range that varies from 300 to
1800 cm-1.
The initial setup employed an experimental laser as excitation source of 785 nm. We used the inphotonics Raman probe
RIP-RPB with two fibers, one of them works as a collector and the other one is used to carries the excitation source. The
core diameters are 200 μm and 90 μm respectively. This Raman probe has a focal length of 7.5 mm. Figure 2 shows the
experimental setup that we employed.
785nm laser
a-
QEÔS000 spectrometer
Wpc
Figure 2 experimental setup that was used to measure all the samples.
4. Results
In this paper, we use the mapping technique called point to point. In a previous paper, we reported the system used [11].
The method of selection of the different areas that we wanted to measure was based on the best performance of our
phantom. Figure 3 shows a diagram of the measurement areas.
10 9 8 7 6
1 2 3 4 5
Figure 3 Diagram of measure of PDMS phantoms.
Figure 4 shows the spectra of PDMS, glyceryl and cholesteryl used in this work. As you can see, the most intense
spectral lines of PDMS are in the region from 400 to 800 cm-1. The spectral lines of the other two compounds used in
this work are found in the region from 1200 to 1450 cm-1.
PDMS
Cholesteryl
Glycerol
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Raman shift(cm-1)
Figure 4 Raman spectra of components that were used in this work.
Figure 5 shows the means of mapping the phantoms in the regions above measures. The spectrum called mix refers to the
sum of the spectra in Figure 4. The spectra shown in the figure have been normalized for better comparison. In the other
hand, figure 6 shows the variations in the spectral lines in 1237, 1324 and 1380 cm-1, these changes in the intensity we
supposed to be related to the concentration of cholesteryl and glycerol in our phantoms.
Mix
6
5
4
3
2
1
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

-1
Raman shift(cm )
Figure 5 Raman spectra of all phantoms and the mix of component that were used to this work.
2400
1
2100 2
3
4
1800
1500
Relative Intensity(A.U)
1200
900
600
300
0
1200 1250 1300 1350 1400 1450
Raman shift(cm-1)
Figure 6 phantoms spectra from 1 to 4 that show a variation of concentration.
5. Conclusions
In this paper, we showed the characterization of phantoms made with PDMS, which are flexible, long lifetime and
require no special care to retain their optical properties. In comparison to those made with gelatin, which are simple to
make but require extra care and refrigeration to prolong its lifetime. The results shown in this work provide an
opportunity to explore the changes in cholesterol and triglycerides to be a standard more reliable.
6. Acknowledgments
AEVL would like to thanks to Fundación Pablo Garcia for help and support.
7. References
[1] Long R, King T, Akl T, Ericson M N, Wilson M, Coté G. L, and McShane M. J, "Optofluidic phantom mimicking
optical properties of porcine livers", Biomed. Opt. Express 2, 1877-1892 (2011).
[2] Wang, T., Mallidi, S., Qiu, J., Ma, L. L., Paranjape, A. S., Sun, J., Kuranov, R. V., Johnston, K. P. and Milner, T. E.,
“Comparison of pulsed photothermal radiometry, optical coherence tomography and ultrasound for melanoma thickness
measurement in PDMS tissue phantoms”, Journal of Biophotonics, 4: 335–344. doi: 10.1002/jbio.201000078 (2011).
[3] Lima R, Wada S, Tanaka S, Takeda M, Ishikawa T, Tsubota K, Imai Y, Yamaguchi T, “In vitro blood flow in a
rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro- PIV system”, Biomed.
Microdevices 10, 153–167 (2008).
[4] Duffy C., McDonald J., Schueller O., Whitesides G., “Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in
Poly(dimethylsiloxane)”, Anal. Chem. 70, 4974–4984 (1998).
[5] Chang W, Akin D, Sedlak M, Ladisch M, Bashir R, “Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) and silicon hybrid biochip for
bacterial culture”, Biomedical Microdevices 5(4), 281–290 (2003).
[6] Mata A, Fleischman A, Roy S, ” Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical
micro/nanosystems.” Biomedical Microdevices 7(4), 281– 293 (2005).
[7] Kaji H, Kawashima T, Nishizawa M,” Patterning Cellular Motility Using an Electrochemical Technique and a
Geometrically Confined Environment” Langmuir 22, 10784–10787 (2006).
[8] Klemer D. P, Medina N, and Klemer D. R, "Fabrication of Polydimethylsiloxane Phantoms for Optical Imaging
Based on Quantum Dot Nanofluorophores", Biomedical Optics, Technical Digest (Optical Society of America), (2006).
[9] http://www.ohaus.com.mx/voyager_pro_a.htm
[10] Villanueva-Luna A. E, Santiago-Alvarado A, Castro-Ramos J, Licona-Moran B, Vazquez-Montiel S, Flores-Gil A
and Delgado-Atencio J. A, "Fabrication and characterization of phantoms made of polydimethylsiloxane (PDMS)", Proc.
SPIE 7906, 79060I (2011).
[11] Villanueva-Luna A.E, Castro-Ramos J, Vazquez-Montiel S, Flores-Gil A, Delgado-Atencio J.A, Ortiz Lima C.M,
“Mapping skin using Raman spectroscopy”, , Optical Diagnostics and Sensing XI: Toward Point-of-Care Diagnostics;
and Design and Performance Validation of Phantoms Used in Conjunction with Optical Measurement of Tissue III.
Edited by Nordstrom, Robert J.; Coté, Gerard L. Proceedings of the SPIE, Volume 7906, pp. 790610-790610-7 (2011).

VillanuevaLuAE PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

VillanuevaLuAE PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Espectroscopia Raman en fluidos

Tesis sometida como requisito parcial para

A mi madre Rosa del Carmen Luna Vela y a mi padre

4.1. Tomografía óptica coherente........................................................................................... 29

6.6. Simulaciones con tejido sintético .................................................................................... 70

La capacidad del médico para diagnosticar la enfermedad se ve reforzada por la disponibilidad

Novedosas aplicaciones biomédicas de la espectroscopia óptica, tales como la de fluorescencia

Las aplicaciones diagnósticas de la espectroscopia Raman actualmente bajo investigación son

Otra de las alternativas en la literatura es la medición de glucosa in vivo usando espectroscopia

1.1 Objetivos y Metas de la tesis

o Evaluar el efecto en el espectro Raman de la coloración de la piel.

1.2 Estructura de la tesis

y en la segunda sección se describe el método para sustraer fluorescencia denominado MimMax.

Las tres capas principales desde la superficie son:

2.2. Estructura general histológica

La piel está compuesta de:

 Corpúsculos de Krause: que proporcionan la sensación de frío.

 Corpúsculos de Paccini: que dan la sensación de presión.

Existen dos tipos de piel:

Mientras que en corrientes médicas, como la histoanatomía y dermatología se estudia en 3

Figura 1 Capas de la piel[31].

La epidermis es la capa externa de la piel. El espesor de la epidermis varía en diferentes tipos de

a 1.5 mm. La epidermis se compone en su mayoría por queratinocitos, que se encuentran

 Estrato germinativo se compone de una capa de células cilíndricas bajas u ovales, su

La dermis también varía en espesor dependiendo de la localización de la piel. Se trata de 0.3 mm

en la cual se tienen la peculiaridad de la abundancia de las fibras de colágeno y elásticas que se

En la dermis se hallan los siguientes componentes [32]:

2.2.3 Tejido subcutáneo

Los componentes propios que integran al tejido subcutáneo son:

Los lípidos son un conjunto de moléculas orgánicas, la mayoría biomoléculas, compuestas

2.4. El fluido intersticial

Formación de fluido de tejido

La eliminación del fluido tisular

A veces, la eliminación de líquido de los tejidos no funciona correctamente, y hay una

El fluido intersticial consiste en un disolvente de agua que contiene aminoácidos, azúcares,

La glucosa, es un monosacárido el cual es el carbohidrato central en la fisiología humana. El

Figura 2 Iso-forma D y L de la glucosa.

Las concentraciones de glucosa en el organismo humano

 El nivel de glucosa en sangre normal en humanos es de aproximadamente 4 mM (

Figura 3 Estructura Molecular del colesterol.

Dentro de la membrana celular, el colesterol también funciona en el transporte intracelular, la

Un triglicérido (TG, triacilgliceroles, TAG, o triacilglicérido) es un éster derivado de glicerol y

La American Heart Association ha establecido directrices para los niveles de triglicéridos:

 Rango normal, de bajo riesgo <150 mg/dL (<1.70 mM)

Figura 4 Estructura molecular de los triglicéridos.

Capitulo 3. Espectroscopia Raman

La espectroscopia Raman es ampliamente utilizada en estudios biológicos. Esta técnica posee

3.2. Descripción del efecto Raman

Figura 5 Se ilustra el experimento realizado por C.V Raman.

Figura 6 Diagrama de Jablonski

De la figura 6 pueden distinguirse los siguientes casos [44]:

Las variaciones de frecuencia observadas en el fenómeno de esparcimiento Raman, son

 si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón esparcido a la misma

Cada material tendrá un conjunto de valores υr característicos de su estructura poliatómica y de

Es importante resaltar que el desplazamiento de las longitudes de onda Raman respecto a la

donde ΔR es el desplazamiento Raman en cm-1, λ0 es la longitud de onda de excitación en nm, y

3.3. Ruidos en espectroscopia Raman

El "ruido" es la información indeseada debido a la electrónica del instrumento, la respuesta sin

Uno de los problemas inherentes a la adquisición de cualquier señal es el ruido presente en la

3.3.1 Ruido de disparo (Shot noise)

Ruido de disparo es una fuente de ruido inevitable en la medición de espectros Raman. Es un

El ruido de disparo en los dispositivos electrónicos consiste en fluctuaciones aleatorias de la

3.3.1. Ruido generado por la muestra