PPG PRAJABATAN TEKNIK KIMIA UNILA

BAHAN AJAR
Mikrobiologi : Identifikasi mikroorganisme
(Metode Pewarnaan Negatif)

Ratna Manika

2017/2018
Sadarkah anda??
Dalam Laboratorium (biologi/mikrobiologi) seringkali kita jumpai preparat.
Preparat yang baik akan dapat teramati dengan baik saat divisualisasi oleh
mikroskop. Preparat merupakan sampel yang sudah dalam bentuk siap untuk
diamati. Dalam dunia kerja, sangat penting untuk mengondisikan preparat agar
hasil pengamatan yang dihasilkan memuaskan. Salah satu cara pengkondisiannya
yaitu dengan pewarnaan.

Indikator Pencapaian Kompetensi

1. Menjelaskan bentuk-bentuk bakteri
2. Menjelaskan pengertian pewarnaan bakteri
3. Menjelaskan tujuan pewarnaan
4. Menjelaskan macam-macam metode pewarnaan bakteri
5. Menjelaskan prinsip pewarnaan negatif
6. Menjelaskan prosedur persiapan olesan bakteri melalui diagram alir atau gambar
7. Menjelaskan prosedur pewarnaan negatif melalui diagram alir atau gambar
8. Mengidentifikasi faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan negatif

Petunjuk Penggunaan
Petunjuk penggunaan buku ajar ini adalah sebagai berikut :
1. Setiap siswa harus membaca buku ajar ini dengan seksama.
2. Gunakan bahan ajar ini untuk menggunakan atau mencari informasi singkat tentang materi dan
urutan materi
3. Bahan ajar ini perlu dilengkapi dengan media pembelajaran yang interaktif untuk menunjang
bahan ajar ini
4. Bahan ajar ini perlu dilengkapi dengan LKPD (Lembar Kegiatan Peserta Didik) dan panduan
praktikum
 Pendahuluan

M ikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur,

dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Mikroorganisme dapat
diamati dengan mikroskop biasa, tanpa diwarnai. Terdapat beberapa cara
Suntuk pengamatan tersebut, yaitu cara tetes tergantung, menggunakan
kondensor medan gelap, dan lainnya. Namun cara pengamatan tanpa
pewarnaan tersebut cukup sulit dipakai, dimana hasilnya akan kurang
maksimal, cara pengamatan tersebut juga tidak dapat dipakai untuk melihat
bagian-bagian sel dengan seksama. Hal ini karena umumnya sel
mikroorganisme seperti bakteri bersifat transparan atau semi transparan.

Bakteri yang hidup hamper tidak berwarna dan kontras dengan air. Bakteri yang tidak
diwarnai umumnya tampak transparan (tembus pandang) bila diamati dengan mikroskop
biasa. Hal ini dikarenakan sitoplasma sel mikroba memiliki indeks bias yang hampir sama
dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair dan mikroba tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Kontras antara sel dan latar belakangnya (medium) dapat diperjelas
dengan cara mewarnai dengan zat-zat warna tertentu.

Zat warna menyerap dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan
lingkungannya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat pewarna memungkinkan pengamatan
struktur dan/atau bentuk spora, flagella, dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan
granula fosfat. Selain itu dengan pewarnaan dapat menunjukkan distribusi dan susunan kimia
bagian-bagian sel, membedakan mikroba satu dengan yang lain, menentukan pH, dan
potensial oksidasi reduksi ekstraseluler.

A. Bakteri
Bakteri adalah mahluk hidup mikroskopis yang memiliki ukuran sangat kecil dan tak dapat
dilihat dengan mata secara langsung. Namun dengan memanfaatkan mikroskop kita bisa
melihat bentuk-bentuk bakteri. Ukuran bakteri umumnya dinyatakan dalam satuan mikron,
dimana 1 mikron sama dengan 0,001 mm. Satuan ini sengaja digunakan untuk memudahkan
pengucapan ukuran bakteri yang memang sangat kecil. Secara umum, bakteri memiliki
panjang antara 0,5 sampai 3 mikron dan lebar antar 0,1 sampai 0,2 mikron. Ukuran tersebut
sangat bervariasi sesuai bentuk nyatanya. Namun pada percobaan yang nanti akan dilakukan
hanya berfokus pada bentuk, bukan ukuran.

Adapun bakteri berdasarkan bentuknya dikelompokkan menjadi 3 macam, yaitu bakteri

bentuk bulat (kokus), bentuk batang atau silinder (basil), dan bentuk spiral (spirilium).
Visualisasi bentuk bakteri dapat dilihat pada gambar 1 berikut.
 Gambar 1. Bentuk-bentuk bakteri (mikroorganisme)

1. Bakteri bentuk bulat (kokus)

Bakteri yang berbentuk kokus dapat ditemukan dalam keadaan tunggal (kokus/
coccus) contohnya Monococcus gonorhoeae, berpasangan (diplokokus/ diplococcus)
contohnya Diplococcus Pneuminiae, koloni yang membentuk rantai (streptokokus/
streptococcus) contohnya Streptococcus salivarius, dan Streptococcus pneuminiae,
maupun membentuk gumpalan seerti buah anggur (staphylokokus/ staphylococcus)
contohnya Staphylococcus aureus.

2. Bakteri bentuk batang (basil)

Bakteri yang berbentuk basil juga dapat ditemukan dalam keadaan tunggal (basil/
bacillus) contohnya Salmonella typhi dan Escherichia coli, berpasangan (diplobasil/
diplobacillus) contohnya Renibacterium salmoninarum, maupun koloni yang
membentuk rantai (streptobasil/ streptobacillus) contohnya Azotobacter sp dan
Streptobacillus moniliformis.

3. Bakteri bentuk spiral (spirilium)

Bakteri yang berbentuk spiral dapat ditemukan dalam keadaan bentuknya melengkung
lebih dari sentengah lingkaran (spiral) contohnya Sprillium minor, dan bentuknya
spiral dengan tekstur halus dan lentur (spiroseta) contohnya Treponem pallidum.

B. Zat Warna
Pada umumnya zat warna yang digunakan adalah senyawa-senyawa garam yang salah satu
ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini dapat digunakan untuk membedakan mikroba karena reaksinya
dengan sel mikroba akan menghasilkan hasil yang berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan
sebagai dasar pewarnaan mikroba tersebut.
Sel-sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati
netral. Zat warna pada umumnya dapat dibagi menjadi dua golongan, yaitu :

1. Zat warna yang bersifat basa

Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromatofor
dan mempunyai muatan positif. Zat warna ini biasa digunakan untuk mewarnai mikroba,
hal ini dikarenakan muatan positif pada zat warna akan berikatan dengan muatan negatif
dalam sel sehingga mikroorganisme terlihat lebih jelas.
2. Zat warna yang bersifat asam
Pada zat warna asam, bagian yang berperan dalam memberikan warna mempunyai
muatan negatif. Zat warna ini biasa digunakan untuk mewarnai latar belakang preparat,
hal ini dikarenakan muatan negatif pada zat warna tidak dapat berikatan dengan muatan
negatif yang terdapat dalam struktur sel. Kadangkala zat warna jenis ini digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang bermuatan positif.

Berdasarkan sifat zat warna tersebut, prosedur pewarnaan secara sederhana dapat dibagi
menjadi dua, antara lain :

1. Pewarnaan positif, ialah pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroba.

2. Pewarnaan negatif, ialah pewarnaan latar belakang di sekeliling mikroba untuk
meningkatkan kontras dengan mikroba yang tidak berwarna.

C. Tujuan dari pewarnaan

Pewarnaan memiliki beberapa tujuan sebagai berikut:

a. Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop

b. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba
c. Melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri, seperti dinding sel dan vakuola
d. Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna

D. Metode Pewarnaan Mikroba

Metode pewarnaan mikroba terdiri atas tiga tahap. Tahap pertama yaitu persiapan olesan, lalu
tahap kedua yaitu pewarnaan mikroba, dan tahap ketiga yaitu identifikasi dengan mikroskop.
Pewarnaan mikroba terdiri atas beberapa cara, diantaranya yaitu pewarnaan sederhana
(pewarnaan negatif), pewarnaan diferensial (pewarnaan gram), dan pewarnaan khusus
(pewarnaan endospora, pewarnaan flagella, dll). Dalam bahan ajar ini hanya akan dibahas
cara pewarnaan negatif.

1. Persiapan Pewarnaan Mikroba : Persiapan Olesan

Sebelum melakukan pewarnaan pada sel mikroba maka dilakukan dahulu preparat oles
(preparat ulas). Preparat oles yang baik akan disiapkan sebagaimana mestinya agar preparat
dapat berhasil pada suatu teknik pewarnaan. Olesan yang dibuat harus tidak terlalu tebal atau
terlalu tipis nantinya.

Kaca objek yang dipakai tidak boleh tergores dan harus selalu bersih. Hal ini disebabkan
ukuran sel bakteri yang sangat kecil, jika terdapat goresan atau partikel debu pada kaca objek
dapat mengakibatkan dikelirukan sebagai mikroba. Disamping itu, olesan pada kaca objek
yang berlemak/berdebu akan cenderung mengumpul dan tidak dapat menyebar dengan baik.

Hal penting lainnya dalam membuat olesan adalah kemampuan menaruh jumlah mikro-
organisme yang tepat pada kaca objek, sehingga olesan yang dihasilkan tidak terlalu tebal dan
tidak terlalu tipis. Hal ini memerlukan keterampilan melalui pengalaman. Pada olesan yang
tebal, sel-sel bakteri akan menumpul sehingga sulit untuk menentukkan bentuk sel secara
individu. Jumlah cahaya yang akan melalui specimen pun menjadi berkurang sehingga
menyulitkan ketika dilakukan pengamatan. Hal ini cenderung muncul lebih mudah pada
olesan yang dibuat dari biakan yang berasal dari medium padat (agar miring atau cawan).
Olesan juga tidak bisa terlalu tipis, karena dapat menyulitkan pengamatan secara mikros-
kopis. Prosedur tentang cara penyiapan olesan dapat dilihat pada gambar 2 di bawah ini.

Gambar 1. penyiapan olesan bakteri

Olesan untuk pewarnaan negatif berbeda dengan teknik pewarnaan lain (pada umumnya
bakteri diletakkan di tengah kaca objek). Pada pewarnaan negatif, bakteri dioleskan pada
ujung kaca objek. Hal ini dimaksudkan agar penampan penglihatan atau pengamatan nantinya
lebih luas (hampir sepanjang kaca objek).

Kesalahan yang sering didapatkan dalam membuat preparat oles adalah terlalu banyak
mengambil biakan pada jarum inokulasi. Hal ini disebabkan ingin dapat melihat supaya yakin
benar ada biakan yang terbawa. Padahal pada saat kita ingin melihat adanya biakan atau tidak
, cukup dari biakan yang menempel pada jarum ose yang sesungguhnya jumlah sudah terlalu
banyak. Perlu diingat kembali, pada pewarnaan negatif, bakteri tidak perlu di fiksasi atau di
beri pemanasan.

2. Pewarnaan Negatif

Sebelumnya telah dibahas tentang pengertian dari pewarnaan negatif, yaitu pewarnaan latar
belakang di sekeliling mikroba untuk meningkatkan kontras dengan mikroba yang tidak
berwarna dengan menggunakan zat warna. Lebih lanjut, secara umum cara pewarnaan negatif
dilakukan dengan mencampur mikroba dalam setetes tinta bak/ titta cina/ tinta india
(negrosin) lalu menyebarkannya di atas kaca objek yang bersih seperti pada gambar 3. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-
bahan kimia yang dapat mengakibatkan penyusutan atau perubahan bentuk bakteri sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.

Gambar 2. Tahap pewarnaan negatif

Pewarnaan negatif menyebabkan mikroba kelihatan transparan (tembus pandang) dan tampak
jelas pisah di antara medan yang gelap karena pewarna yang diberikan tidak menembus sel
mikroba. Teknik pewarnaan ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukurn sel. Berbeda
dengan metode pewarnaan yang lain, pada pewarnaan negatif olesan tidak mengalami
pemanasan atau perlakuan lain dengan bahan kimia. Metode ini sering digunakan terhadap
terutama spirochaeta yang sukar diwarnai.

Berhasil atau tidaknya metode ini tergantung hal-hal di bawah ini:

a. Kaca objek harus betul-betul bersih

b. Jumlah zat warna yang digunakan menentukan keberhasilan pewarnaan
c. Campuran mikroorganisme harus digesekkan di atas kaca, bukan sekedar di dorong.

Ciri-ciri pewarnaan negatif adalah sebagai berikut:

a. Menggunakan zat warna yang bermuatan negatif

b. Zat warna tidak mewarnai permukaan sel yang bermuatan negatif
c. Pewarnaan negatif bukan pewarnaan mikroba, karena sel mikroba tetap tidak berwarna
setelah penambahan zat warna
d. Kesalahan yang sering dilakukan yakni preparat ulas terlalu tebal dan tipis. Bila preparat
terlalu tebal menyebabkan lingkungan sekitar bakteri gelap dan mikroba tidak dapat
dibedakan dengan lingkungan sekelilingnya. Tetapi bila preparat terlalu tipis
menyebabkan tidak terjadi kontras yang tajam antara mikroba dengan lingkungan
sekitarnya.

3. Identifikasi mikroba

Setelah melakukan pewarnaan, dilakukan identifikasi mikroba menggunakan mikroskop.

Identifikasi berhasil apabila bentuk mikroba tampak jelas pada mikroskop.

Latihan soal !

Seorang siswa ingin mengetahui bentuk suatu bakteri X tak berwarna. Di dalam laboratorium
hanya terdapat satu jenis pewarna. Bantulah siswa tersebut untuk dapat mengetahui bentuk
bakteri tersebut!
 DAFTAR PUSTAKA

Arrachman, Khairunnisa. 2016. Tugas I Mikrobiologi Pewarnaan. Semarang : Universitas

Muhammadiyah Semarang

Tim Mikrobiologi. 2017. Tuntunan Praktikum Analisis Mikrobiologi SMK-SMTI

Bandarlampung. Bandarlampung : SMK-SMTI

Tim Penyusun. 2008. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Purwokerto : Universitas

Jenderal Soedirman

Tim Penyusun. 2012. Modul Praktikum Mikrobiologi Laut. Diambil dari

www.google/teknikpewarnaanbakteri.com pada 3 Januari 2018

Tim Penyusun. 2014. Modul Mikrobiologi SMK-SMTI. Bandarlampung : PUSDIKLAT

KEMENPERIN