6. El crecimiento de los
microorganismos
Tab. 6.1 Ejemplo de una solución nu- Tab. 6.2 Solución madre de oligoele.
tritiva sintética sencilla. mentos.
Biotina 0,2mg
Ácido nicotínico 2,0 mg
Tiamina 1,0 mg
4-Aminobenzoato 1,0 mg
Pantotenato 0,5 mg
Piridoxamina 5,0 mg
Cianocobalamina 2,0 mg
Agua destilada 100 mi
Se añaden 2-3 mi de la solución vitamí-
nica a 1000 mi de la solución nutritiva.
hongos bacterias
1 1 1 1
3 4 5 9 10 11
acidófilos neutrófilos
lo 10 20 30 40 50 60 70 eo
~ 1 1 1 1 1 1 1 1
[ ps>erofilos
1 1
termóf1los
1
mesófilOs
1
a..ione11a Eschenchia co/i Baetl/us Thermococcus PyrodJCtium
~nx Alcal1genes stearothermoph1/us Thermctoga occultum
- - - -- - - - - - - - - - -
0 ,2
5
0.4 30 20 10 10 20
f--.....~.........___,_~ ........_,
Los intervalos corresponden a 1 mm
entrada
de aire
partículas sólidas (arcilla. celulosa. quitina) a una suspensión bacten ... na:
en este caso las bacterias crecen como un "crecimiento ma'>ivo" denso
alrededor de la superficie de las partículas y sufren igualmente una dd1-
ciencia de 0 2• Para la demostración de este efecto resultan idóneas las bac-
terias anaeróbicas facultativas. que en condiciones de deficiencia de oxí-
geno pasan a fermentar (Escherichia coli) o a respirar nitratos (Pseudo·
monas de11itrifica11s) .
Cultivo an aer óbico. Para el cultivo de bacterias anaeróbica., estricta' es
imprescindible la exclu.,ión del oxígeno del aire. La técnica anaeróbica
emplea medios de cultivo a los que se elimina el aire: hervidos. fra,cos
cerrados sin que queden burbujas, atmósfera11 sin oxígeno en desecado ·es
o frascos de Wrrr, sustancias para la absorción del oxígeno (pirogalol
alcalino, ditionito, cloruro de cobre 1), y 01ros medios auxiliares. La adi·
ción de sustancias reductoras (ácido ascórbico. tioglicolato, cisteína - si es
po'>1ble- o también sulfuro) a los caldos de cultivo pennite reducir o ch·
minar los efectos tóxicos del oxígeno del aire
Las bacterias extremamente sensibles al oxígeno pueden subculu\.af'ie
también en el aire cuando se procura, mediante una corriente continua de
nitrógeno libre de oxígeno en el frasco de cultivo, que el medio no en1n:
en contacto con el aire (técnica de H UNGATl.i). Alternativamente, puede
6.3 Tipos nutricionales 203
Rodospiriláceas
o H2 }
:e ácidos fotOM;m;ladoo }
e
Q)
orgán. ).>800 nm
N
dador de H Cromatiáceas
.2 "'
e: SH2
dador de H A>715nm Clorobiáceas
e:
Q) "' SH2
o Algas verdes
:e CINH. o KNQ3 como fuente N
e
Q) N2 como fuente N Cianobacterias
"'
Bacterias quimiolitotrofas (autótrofas) (principal fuente de C: C02)
Nitrosomonas
Nitrobacter
Bacterias del H2
Thiobacillus
Thiobacillus ferrooxidans
Thiobacillus denitrificans
Paracoccus denitrificans
Metanogénicas
Flg. 6.7 Banco de dilución de una bacteria purpúrea del azufre en agar blan.
do (0,8%) tras Incubar durante siete dlas con luz. la imagen demuestra el aisla-
miento de un cultivo puro de bacterias anaeróbicas por el método de d1luc16n El agar
se cubrió con una capa formada por parafina y paraf1nol a fin de evitar la entrada de
oxigeno atmosfénco (Fotografía de B. lEHMANN).
den obtenerse también por unión de culti vos puros. Las investigaciones de
cultivos mixtos definidos conducen al conocimiento de las relaciones
complejas que se dan entre lo., microorganismo s en el hábitat natural
En la economía doméstica y en la industria no .,e utilizan exclm,ivamente
cultivos puros, sino también cultivos mixtos, algunos de los cuales se
denominan también "cultivos puros naturales". Ejemplos de ellos son la
levadura, el kefir, el hongo de té, etc. También en la purificación de aguas
rc.,iduales tienen un papel importante los cultivo<; mixtos, especialmente
en la degradación de xenobiótico\ en las aguas residuales indu\triales.
··-=- t
n
1
u
t
!i
se representa e l número de células de una población en crecimiento
~nen~ial _en ordenad~s y el tiempo en absci'>as. ambas magnitudes en
ala antmet1ca, se obtiene una curva exponencial (Fig. 6.8). No obstan-
esta reprcscntaci?n ~trnéttca no resulta apropiada para expresar un
~e~o grande de dtv1stones celulares, porque según qué escala se esco-
un1camente serán reconocibles las primeras divisiones o las últimas.
212 6. El crecimiento de los microorganismos
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.... demualtlt
Tiempo
tan regulannente de una forma más o menos acusada: fase de latencia (o lag)
fase exponencial (logarítmica), fase estacionaria y fase de muerte. '
El crecimiento sobre medios de cultivo sólidos es semejante, aunque las
densidades celulares alcanzadas son muy superiores.
Fase de la tencia. La fase de latencia abarca el lapso de tiempo entre la
inoculación y el momento en que se alcanza la tasa de divisió? máxima.
La duración de la fase de latencia depende sobre todo del cultivo previo
de ta edad del inóculo, así como de lo apropiado que sea el medio de cut:
tivo. Si el inóculo procede de un cultivo previo viejo (fase estacionaria de
crecimiento) ta célula tiene que adaptarse primero a las nuevas condicio-
nes de crecímiento mediante la síntesis de RNA, ribosomas y enzimas. Si
las fuentes de energía y de carbono del nuevo caldo de cultivo ~e.diferen
cian de las del cultivo previo, la adaptación a las nuevas cond1c1ones va
ligada frecuentemente a una nueva síntesis de enzimas que no eran nece-
sarios en el cultivo previo y que no habrán sido sintetizados. La formación
de los nuevos enzimas está inducida por el nuevo sustrato.
70
60 b
a e
.~ 50 d
.g. 40
al
~ 30
.,,
e:
o 20
10
o 2 3 4 5 60 o o 2 3 4 Horas
miento. Sólo las células muy sensibles mueren rápidamente. Siempre que
pueda obtenerse energía necesaria por respiración de materiales de reser.
va o proteínas las bacterias permanecen largo tiempo vivas.
En muchos procesos microbianos de producción conducentes a la formación
de un metabolito secundario (p. ej. penicilina) la fase estacionaria es la ver.
<ladera fase de producción. Por ello. en biotecnología se diferencia una tro.
fofase (fase de nutrición o creeinúento) y una idiofase (fase de producción).
A pesar de que las células no creLcan durante la idiofase, si se añaden sus.
tratos, éstos aún son aprovechados y se incorporan precursores al producto.
La masa bacteriana alcanzada en la fase estacionaria se denomina rendi.
miento o producción. Depende del tipo y cantidad de los nutrientes aña.
didos y de las condiciones de cultivo.
Fase de muerte. La fase de muerte y las causas de la muerte de las célu.
las bacterianas en soluciones nutritivas normales se han estudiado aún
poco. Relativamente claras son las condiciones cuando se acumulan áci-
dos (Escherichia, Lac1obacill11s). El número de células viables puel:le des-
cender exponencialmente. En según qué circunstancias las células pueden
lisarse por acción de los propios enzimas (autolisis).
6
!:::.
~
i::¡ log X
,,,i1!
~
.3
~
~X.
j . . logx.-logXo
pendiente= log B • (1 • l.) = µ
1
"'
~
log Xo
.§' lo
~
~
~
~ Fig. 6.11 Parámetros del crecí·
~
..,,. = _ In x.- In Xo
4
JI
miento: rendimiento, ta sa de
crecimiento y período de laten·
.3 cia.
6.5 Fisiología del crecimiento 217
54
6.. Parámetros de la curva de crecimiento
Si se ~igue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multi-
plicación de la masa (masa seca) interesarán en primer lugar tres paráme-
iros que caracterizan al crecimiento: la producción, la tasa de crecimiento
y el período de latencia (Fig. 6. 11 ).
producción. La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial
y ta máxima: X = Xm... - Xu. Se da en gramos de masa seca. De especial
jJnportancia es la relación de la producción con respecto al consumo de sus-
trato (X/S). Si las dos magnitudes se expresan en unidades de peso, al co-
ciente se le denomina coeficiente de rendimiento o rendimiento del creci-
fJliento (growth yicld) Y. Frecuentemente se refiere la producción a la can-
tidad de sustrato y se calcula el coeficiente de rendimiento molar Y01 (g de
células/mol de sustrato). Este coeficiente de rendimiento molar permite rela-
cionar la producción con Ja cantidad de ATP que puede obtenerse a partir de
la fuente energética (sustrato). Se llega así al coeficiente de rendimiento
energético (g de células/mol ATP). Puede calcularse cuando se conoce Ja vía
de degradación de un sustrato y la ganancia energética que así se consigue.
Para cultivos anaeróbicos de Escherichia coli y K/ebsiella ¡meu111011iae con
tasas de crecimiento limitadas por la adición de glucosa. se midieron valo-
res de YATP de 12.4 y 14 g masa celular/mol equivalente de ATP. Para las
bacterias anaeróbicas que obtienen la energía por fermentación el Y,, 1p es
un valor bastante constante. Si para una nueva bacteria se obtiene un valor
significativamente superior. hay que considerar que existen "ingresos even-
tuales", esto es, la presencia de vías metabólicas energéticas accesorias. Los
valores de YuP se han calculado también para células en crecimiento aeró-
bico. Dependen de las condiciones de crecimiento y de las necesarias capa-
cidades de síntesis; así por ejemplo, de si a las células se les proporciona
como fuente de N iones amonio, iones nitrato o nitrógeno molecular.
Tasa de crecimiento exponencial. La tasa de crecimieto exponencial es
una medida de la velocidad del crecimiento celular en la fase exponencial
del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas x0 y x1 en
los tiempos to y t, según
== log x, - log Xo In x, - In x0
11
log e · (1- lo) (1 - lo)
In x.- In x.,
To=L-t=t,- - - - -
µ
D ·x=-~
di
La densidad bacteriana en el cultivo iría disminuyendo exponencialmente
según .x =x0 . e-Dt
El crecimiento de las bacterias en el recipiente de cultivo tiene lugar igual-
lllentc de forma exponencial. La tasa de incremento viene dada por la
cxpre<.ión µ.x = dxldt, y la densidad bacteriana aumenta exponencialmen-
te según .X= .Xo . el''.
la tasa de modificación de la densidad bactenana d.x/dt en el recipiente de
CUitivo viene dada por las dos velocidades citadas d.x/dt µ.x - D.x. =
Si la tasa de crecimiento µ y la tasa de dilución D son iguales, la pérdida
J>or lavado se iguala al crecimiento bacteriano, esto es, la modificación es
220 6. El crecimiento de los microorganismos
~~~~~~~~~~~~
~~
t --µ_:-------------------- ·----·-=--
-- -
g""
1
!
µ..
2
~
Fig. 6.13 Dependencia de
la tasa de crecimiento 11
con respecto a la concen-
tración de sustrato c..
A B C
1
5 ~nal
\
. r--·-·
7
10
4 6 8
3
~~ 5
6
\ 4
\
2
~- -
concenlrKión del 8U8lrato
o ~------..-=-.;;..--·---.&.,.-----l. o o
o 0.5 1,0 J. J
o
Flg. 6.14 Relaciones entre la densidad celular, la concentración del sustrato,
el tiempo de duplicaclón y el rendimiento en equilibrio dinámico para distintas
..... de dilución Den un qulmlostato. Estos valores han sido calculados para una
bacieria de parámetros µ ..... = 1 .O horas, Y =0,5 y K. =0,2 gil y una concentración
del sustrato en el medio de cultivo circulante de s, = 10 gil Ordenadas: A rendi-
miento Dx (g/Vhora), B tiempo de duplicación t.. (horas); e concentración del sustra-
to en el recipiente estudiado c. (gil). Abscisas: tasa de dilución D (horas); Dmtasa de
cltución para el rendimiento máximo; O, salida de las células (segun HERBERT, O , R.
Et.SWORTH, R. c. TELLING'. J. gen. M1crobiol. 14 [1956] 601 ) .
99
1 1
CH2 COOH CH2 fH2
1 1 1
CH2 CH2 CH2 CH2
1 1 1 1
COOH COOH NH2 NH2 H2N- CH - COOH H2N-CH-COOH
2,94 3,0
, .,, bar
bar at
o 0,()061
1.96 &. 2,0 20 0.0235
30 O,CM27
~
,.
40 0.0742
80 0,4796
0,98
~ 1•
110
1,9111
1,4419
~ 1,0
1.-a
130 2,7190
Temperatura
"9. 6.15 Presión de vapor del agua a saturación.
228 6. El crecimiento de los microorganismos
-
Tab. 6.6 Tiempo de esterlllzaclón con autoclave de los líquidos contenidos ell
distintos recipientes (121-123ºC).
:n¡entra.., que las e<,poras de la'> bacterias continúan '>iendo viable'>. El valor
bajo del pH debido a los ácidos de los frutos impide la germmación de
¡as c,por~., de la' bact~ria'>. Afortunadamente no existe n.inguna e'pora
aerrnorrc'>l '>te~te bac~en?na cap:v de desarrol_lar'>e a pH mferior a 4.5.
fru'º' poco ac1dos ijud1a'>, guisantes. zanahonas. setas. entre otro'>) pue-
den con.,crvar'>e también por ~a~teuri~~ción si se .añaden 1 o 2 c~charada-.
de vinagre para alcan1ar la ac1d1ficac1on necesana. Una e1Ccepc1ón: '>Obre
freSll' pa,teun1ada' aparece frecuentemente el "hongo de las fre'ª"..
IJYswchlamn 111rea. Sus ascósporas resisten bien los 86ºC; a e\ta tcmpe·
rallJra el f) o e' de 14 min.
(alor seco S1 se someten a calor seco las espora.-. de la'> bactenas 'ólo '>On
destruida'> a temperaturas más altas y con tiempos de acción má'> prolon-
gado' que '>I '>e las somete a calor húmedo. Por eso el material de vidrio,
loS polvo<. y aceites insensibles al calor son esterilizados manteniéndolos
dos hortl\ en un horno con calor seco a 160º C. En el caso de materiales de
alta capacidad calorífica o con propiedades de aislamiento térmico tiene
que considerarse el tiempo de calentamiento. No obstante, en todos los
casos se recomienda un control de temperatura (por medio de indicadores)
o un control de esterilidad. Si el material lo permite, actualmente se calien-
tan 30 minutos a l 80º C. La experiencia demuestra que así se eliminan
IOdas las esporas. La destrucción por el calor se debe a la coagulación de
las proteína'> celulares.
Jlltración . La'> soluciones con sustancias termolábiles (vitamina'>, algunm
1111inoácidos, a1úcares, otros sustratos) se esterili1an por filtración. debido
a la comodidad que pre'>enta este mecanismo. Ya en el laboratorio de PAS-
'IEUR se util11aban cilindros de porcelana no vidriados (filtros de C11AM-
IER1.A~D). En el laboratorio. ) para la esterilización del agua de bebida se
llili1an lihro' de tierra de diatomeas prensadas. No menos adecuado., '>On
los filtro'> de fibra de -.idrio o de membrana. Los filtros de membrana de
litrocelulo<,a (Sartorius o Millipore) se presentan con di~tt ntos diámetro.,
de poro. lo., filtro'> desechables pueden adaptarse a jeringuilla<, y se utilt-
lan actualmente de forma rutinaria para la esteriliLación de disoluciones
flllC no <,Oportan la esterilización por calor. Con ayuda de filtros de mem-
11rana pueden mcluso separarse organismos de distinta forma o tamaño.
(a., part1cula., \Íricas no son retenidas por los filtros. Debemos indicar
11rnbién. que al hervir o en el autoclave incluso azúcares como glucosa y
hcto\a pueden interconvertirse o desdoblarse. Cuando la glucosa es má'>
estable es a pi 1entre 3 y 5 al estar disuelta en agua y puede eMerililar'>e en
el autoclave. Pero '>i la glucosa se hierve a pH 8 durante 30 min, el 40"t
<Pc!>o/peso) se transforma en fructosa. Las sales metálicas (Fe, Mn, Mo.
fietc.) aceleran la transformación. Como la fructosa se tran~forma en ácido'>
1'6rnico., en estas condiciones, los caldos de cultivo esterili1ados de este
o adquieren frecuentemente una coloración parda o negra.
230 6. El crecimiento de los microorganismos
par.t esterilizar ext~rnamente las semillas que -.e han de utili?ar para
obtener plantas esténles resultan adecuados agentes microbicidas como el
jeiJo hromh~drico ~1 % ). e_I sublimado alcohólico (HgCb 1%), AgN0 1
(0.05'1-). el h1poclonto ~á.ic1co ( 1% Ch)_ y otro!., dejándolos actuar de 5 a
3o rninutos.
Anles de ut1lt1.ar estos medros ha de humedecerse completa-
inente la superficie de las semillas lo que se consigue por tratamiento con
J'bones y otros agentes emulsionantes.
p¡r.1 la limp1eLa y desinfección de r ecipientes de \idrio basta normal-
inente el lavado con agua caliente y detergentes. entre ellos el SOS (do<le-
cilsulfato sódico) o cualquier detergente casero.
Se uti liL.a una esterilización por liltra ción con filtros de capas y de celuloi.a de
poro fino para esteri li7ar los 7umos de frutas, el agua mineral y los productos tera.
péuticos. La fermentación del vino se interrumpe en el momento deseado por cc 11•
trifugación y filtración de modo que se conserve un "resto de dullor"'.
La carne y los pescados pueden conservarse por ahumado. Este proceso co1Nstc
en disminuir el contenido de agua y en in troducir en el producto ahu mado swaan·
cias de acción antimicrobiana: tc noles, cresolcs, aldehídos, ácido acético. ác ido fór-
mico. En la salazón se introducen los alimentos en soluciones de sal común: c'>te
tratamiento provoca una pérdida de agua e inhibe el crecimiento de los microorga-
nismos putrcfactore.-; sólo unas pocas bacterias halófilas llegan a multiplicarse.