Hidrólisis de almidón: análisis enzimático de diastasa

Hydrolysis of starch: diastase enzyme assay

Casallas V.L,Gonzalez M.L Rodriguez S., Suta C.A.
Corporación Tecnológica de Bogotá, Tecnología en Química Industrial
Bogotá D.C, Colombia
05/10/2015
lcasallas12@ctb.edu.co mgonzalez71@ctb.edu.co srodriguez90@ctb.edu.co csuta05@ctb.edu.co

RESUMEN Michaelis Menden and Lineweaver -

En esta práctica se realiza la hidrólisis
del almidón en donde se hace el análisis
cinético de diastasa 1% en solución de
NaCl 0.1%, en varios tubos de ensayo
se prepararon diferentes soluciones
(Tabla 1), luego se le adiciono 1 ml de
tartrato de cobre y 1ml de
Arsenomolibdato, después se centrifugó
por 3 minutos a 2000 revoluciones por
min; se midió la absorbancia en un
espectrofotómetro genesys a una
longitud de onda de 620 nm, para así
determinar la velocidad inicial y la
concentración del sustrato para luego
realizar la gráfica de Michaelis Menden
y Lineweaver - Burk.
Palabras claves: Hidrólisis, sustrato,
velocidad, enzima, almidón, diastasa,
concentración
ABSTRACT
In practice starch hydrolysis is
performed where the kinetic analysis of
diastase 1% is NaCl 0.1% solution in
several test tubes different solutions
(Table 1) were prepared, then was
added 1 ml of tartrate copper and 1mL
Arsenomolybdate, then centrifuged for 3
minutes at 2000 revolutions per min; the
absorbance was measured in a
spectrophotometer at genesys a
wavelength of 620 nm, to determine the
initial velocity and substrate
concentration than in graphing of
Burk.
Keywords: hydrolysis, substrate, speed,
enzyme, starch, diastase, concentration
INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos o polisacáridos son
compuestos que tienen importantes
funciones estructurales y de energía de
los seres vivos. (Biblioteca Nacional de
medicina de los EE.UU., 1997). El
almidón es el carbohidrato de reserva
más abundante en los tejidos vegetales.
Se encuentra en grandes cantidades en
tubérculos y semillas de cereales y
leguminosas. El almidón puede ser
hidrolizado por acción de amilasas o
ácidos orgánicos. Este polisacárido
contiene alrededor del 20% de una
fracción insoluble en agua llamada
amilosa y un 80% de una fracción
soluble denominada amilopectina.
Ambas fracciones están constituidas por
unidades de α-D-glucosa. (Calvo, 2008)
Las enzimas son generalmente,
moléculas proteicas que tienen la
capacidad de catalizar reacciones
químicas. Debido a la naturaleza
proteica, son inestables y pueden ser
desnaturalizadas por cambios en el
medio. (Gonzalez, 1997)
La diastasa es una enzima de origen
vegetal que se encuentra en
determinadas semillas germinadas y
otras plantas. Su función es la de
catalizar la hidrólisis, primero del
almidón en dextrina e inmediatamente
después, en azúcar o glucosa. La alfa-
amilasa degrada el almidón en una
mezcla de disacáridos: maltosa,
maltotriosa trisacárido (la cual contiene
dos α (1-4)-residuos de glucosa) y
oligosacáridos conocidos como
dextrinas, que contienen la α (1-6)-
ramas de glucosa. (Cervera, 1994)
Figura 1. Reacción de almidón para producir glucosa.
Tomada de (Cervera, 1994)

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES

2 Balón aforado 10 mL 10 Tubo de ensayo grande

1 churrusco 1 Pipeteador

2 Celdas de vidrio redondas 9 Tubo para centrifuga

1 Pinzas para tubo de ensayo 1 Trípode

1 Pipeta graduada de 10 mL 2 Vaso precipitado de 100 mL

1 Malla de cerámica 1 Gradilla para tubo de ensayo grande

3 Pipeta graduada de 5 mL 3 Vaso precipitado de 50 mL

1 Microespátula 1 Frasco lavador

1 Vaso precipitado 500 mL 1 Vidrio de reloj

1 Balón aforado de 20 mL

MÉTODOS

1. Michaelis y Menten propusieron un combina reversiblemente con su

modelo simple para explicar la mayoría sustrato(ES) que subsecuentemente se
de las reacciones catalizadas por rompe para formar el producto, hecho
enzimas. En este modelo la enzima se que genera la enzima (Contretas, 2003),

Figura 2. Comportamiento grafico de Michaelos y Menten.
Tomada de (Contretas, 2003)
● Representación de los dobles inversos o
de Lineweaver- Burk: Es la
representación gráfica de la ecuación de
Michaelis y Menten inversa; siendo la
más utilizada pero no es la más
recomendable el resultado de esta es;
pendiente= Km/ Vmax, corte en el eje x=
-1/Km y corte en el eje y= 1/Vmax
(Contretas, 2003)
Figura 3. Grafica de Lineweaver- Burk. Tomada de
(Contretas, 2003)
2. Método De Somogyi- Nelson Los
azucares con grupo aldehído o cetona libre
son capaces de reducir los iones Cu+ que al
reaccionar con el ácido arseno-molibdico del
Reactivo Nelson producen compuestos
coloreados. (Biológia, 2010)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE
RESULTADOS
Las diastasas son enzimas aportadas por las
abejas con el objeto de hidrolizar azucares
complejos en simples, las enzimas actúan sobre
la velocidad de reacción pero no sobre el
equilibrio de reacción por eso su actividad se
pierde con el almacenamiento prolongado y son
inactivadas por altas temperaturas. (Cervera,
1994). Durante el desarrollo experimental se
desnaturalizo la enzima a la hora del
calentamiento.
La concentración del sustrato (almidón)
determina la actividad enzimática medida con la
velocidad de la catálisis enzimática. La
velocidad de las reacciones enzimáticas es
afectada por una serie de factores tales como el
pH, temperatura, concentración de enzima,
concentración de sustrato y presencia de
molécula afectadoras (activadores o inhibidores
de enzima) (Olavide, 2015)
Grafica #1. Representación de Michaelis- Menten. Concentración
de almidón/ tiempo vs Concentración de almidón. (Experimental).
Datos Tabla #1 (Anexos)
De acuerdo con la gráfica No 1. Aplicando la
constante Michaelis- Menten, se determina que
no cumple con lo establecido por Michaelis
debido a que da una línea recta y no una curva
hipérbola como está establecido, esto puede ser
causado por la concentración de sustrato
 utilizada que actuó como factor afectante de la
diastasa. Sin embargo la ecuación de Michaelis
puede reformularse de modo que al graficar se
obtenga una línea recta. En el diagrama de
Lineweaver Burk en el punto de intersección con
las rectas con cada eje define el valor como se
muestra en la grafica N° 2. Lo gráficos de este
tipo permiten visualizar los datos
proporcionados en el desarrollo experimental.
Determinando así los valores obtenidos y
reportados en ta tabla N° 4. Determinando que
la velocidad máxima alcanzada es en el que la
Grafica #2. Representación de los dobles inversos o de
enzima realiza su proceso de catálisis en linenweaver- Burk. Datos tabla # 3 (Anexos)
reacción antes de que se saturar.

Km experimental 4,6361
Vmax 2,1927
½ Vmax 1,09585

Tabla #4. Datos experimentales. Constante de MIchaelis-

Menten, VMax y ½ Vmax.

La constante de Michaelis- Menten es

característica de una enzima y particular para un
substrato. Esta refleja la afinidad de la enzima por
el substrato, Km es numéricamente igual a la
concentración del substrato. Este parámetro Km no
varia con la concentración de enzima. Durante el
desarrollo experimental se observa que la Km es
mayor a la concentración del sustrato refleja una
baja afinidad de la enzima por su sustrato porque a
una concentración mas elevada la enzima
desarrolla la mitad de la velocidad máxima. Sin
embargo se determinó que en la Constante de
Michaelis cuando hay pequeñas variaciones en
la concentración del sustrato pueden suponer
grandes cambios en la velocidad de toda una
ruta metabólica además para que haya una
eficiencia buena de la enzima debe encontrarse
a una temperatura de 60°C. Con base en esto,
diferentes perfiles de sacarificación generan
composiciones distintas, sin embargo la diastasa
determina el aumento de los grupos reductores,
ya que es la acción colectiva de las amilasas.
(Garabay, 1993)
Grafica #3. Absorbancia real/ tiempo vs Absorbancia real.
Datos tabla #2 (Anexos)
El método Somogyi- Nelson es muy utilizado para
determinar concentraciones de azucares
reductores en muy bajas proporciones, se
demostró que se cometieron errores
experimentales los cuales llevaron a ser erróneos
los datos proporcionados por la absorbancia de la
muestra. Debido a que la reacción con el reactivo
de Smogy- Nelson (Está compuesto por Molibdato
de Amonio, Arsénico disódico 7 H2O, äcido
Sulfúrico y agua destilada. Los iones cuprosos,
formados por la acción reductora de los glúcidos, al
reaccionar con el reactivo Arsenomolibdico), da un
color azul en la muestra control, lo que indica la
reducción o en su defecto color rojo para la
oxidación, (Montero, 2015) pero en las demás
muestras no se presentó esta coloración.
COMPARACIÓN DE Km y Vmax
 Km= 12,36
 Vmax= 1,3042
 ½ Vmax= 0,6521
Al comparar estos resultados teniendo en cuenta
que se los dos procesos se realizaron a una
concentración del 1%, los resultados no
concuerdan lo cual puede ser causado por errores
experimentales. De igual modo este resultado
demuestra la baja afinidad que tiene la enzima con
el sustrato.
 Km= 2,42
 Vmax= , 2,17
 ½ Vmax= 1,08
En comparación con los resultados que se
obtuvieron anteriormente, teniendo en cuenta que
este ensayo se realizó a una concentración del 2%,
estos concuerdan con que la enzima y el sustrato
tienen una afinidad alta y en este experimento el
porcentaje de error es menor.
CONCLUSIONES
 Las condiciones de operación de las
enzimas en los procesos están limitadas
por las propiedades específicas de cada
una de ellas, como también por las
propiedades físicas y químicas des sustrato
sobre el cual va a actuar.
 La concentración del sustrato es un factor
importante ya que de este depende la
saturación de la enzima.

BIBLIOGRAFÍA
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(1997). Medline Plus . Obtenido de
https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanis
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Obtenido de
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Contretas, E. V. (01 de Octubre de 2003).
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Obtenido de
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método fotométrico.
Olavide, U. P. (2015). Cinetica enzimatica . Sevilla .
 ANEXOS

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6
Almidon (mL) - 1,5 - 0,25 0,5 0,75 1 2,5 1,5
Agua (mL) 0,5 0,25 0,25 2,0* 1,75* 1,5* 1,25* 2,0* 0,75*
Enzima (mL) - - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,25
Tiempo (min) - - - 10:00 9:45 9:40 9:35 9:25 9:20
Concentración de Sustrato 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentración de sustrato/ tiempo 0,01 0,02 0,032 0,043 0,054 0,065
Tabla #1:Disoluciones con diferentes volúmenes
*Esta agua se agregó para aforar cada tubo a 2,5 mL menos el tubo 5, este se llevó a 5 mL como era
originalmente.

ABS ABS REAL ABS REAL/t ABS REAL

Absoluta
BB 0
BS 0,003
BA 0,022
1 1,245 -1,22 -0,122 1,22
2 0,016 0,009 0,000952381 0,009
3 0,032 -0,007 -0,000744681 0,007
4 0,009 0,016 0,00171123 0,016
5 0,01 0,015 0,001621622 0,015
6 0,031 -0,006 -0,000652174 0,006
Tabla # 2: Absorbancia de las disoluciones

1/ [ ] 10 5 3,3333333 2,5 2 1,66666667

1/ V 100 47,25 31,3333333 23,375 18,5 15,33333333
Tabla # 3: Datos experimentales. Método de linealización Lineweaver- Burk