UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA

Calidad, Calidez y Pertinencia.

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.

NUMERO DE LA PRÁCTICA: IQ.4.02 – 05

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: : Preparación de medios de cultivo y análisis de una muestra
problema. .

1. DATOS INFORMATIVOS

INTEGRANES: Primer de Grupo de Ingenieria de Quimica.

CARRERA: Ingeniería Química

CICLO/NIVEL: Cuarto Semestre “A”
DOCENTE RESPONSABLE: Dra. Bioq. Farm. Diana Serafín Á, Mgs.
2. FUNDAMENTACION:

Agar Bilis Rojo Violeta

El Agar Bilis Rojo Violeta es usado para la enumeración de coliformes en productos alimenticios
y en lácteos, este producto está en conformidad con los requerimientos de la Asociación
Americana para la Salud Pública (APHA, American Public Health Association, por sus siglas en
inglés).

El grupo de bacterias coliformes incluye a los bacilos aeróbicos y a los anaeróbicos facultativos,
Gram negativos y bacilos no formadores de esporas. Los coliformes fermentan la lactosa y
forman ácido y gas a 35°C en 48 horas. Los miembros de las Enterobacteriaceae pertenecen la
mayoría a este grupo, pero otros organismos fermentadores de lactosa pueden también ser
incluidos.

Se utilizan procedimientos para la detección, enumeración y presunta identificación de coliformes

en el análisis de productos alimenticios y productos lácteos.

Un método para desarrollar la prueba para detectar presuntos coliformes utiliza el Agar Bilis Rojo
Violeta (VRBA, Violet Red Bile Agar, por sus siglas en inglés). Si aparecen colonias típicas de
coliformes, éstas se analizan más profundamente para confirmar su identificación como
coliformes. Las colonias de coliformes disminuyen el pH del medio, causando por consiguiente
que las colonias presenten una coloración roja (Tinte Rojo Neutro) y precipitan las sales biliares.

El Digerido Enzimático de Gelatina es una fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales

en el Agar Bilis Rojo Violeta. El Extracto de Levadura provee vitaminas del complejo B que
estimulan el crecimiento bacteriano. La Mezcla de Sales Biliares y Cristal Violeta inhiben la
mayoría de las bacterias Gram positivas. La Lactosa es una fuente de carbohidratos. El Rojo
Neutro es un indicador de pH. El Agar es el agente solidificante.

Salmonella Shigella Agar

En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los nutrientes para el

desarrollo microbiano.

Las sales biliares y el verde brillante inhiben el desarrollo de una amplia variedad de bacterias
Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo de una amplia variedad de
bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El tiosulfato de sodio permite la formación de
SH2 que evidencia por la formación de sulfuro de hierro.

El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante. Los pocos

microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidificar el medio haciendo
virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen

adecuadamente en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.

La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la
formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar
previamente la muestra en selenito caldo.

Manitol Salado Agar

En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína constituyen la

fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano.

El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta

concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo
fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante.

Se trata de un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a
la capacidad de fermentación del manitol por los microorganismos.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol,
producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo
al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el
manitol.

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas
rodeadas de una zona del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de
una zona del mismo color o púrpura. Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento
de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos farmacéuticos,
cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.

También puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio si no se dispone de TCBS

Mac Conkey Agar

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el
cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram
positiva. El agar es el agente solidificante.

Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje

del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las
seles biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

3. OBJETIVOS:

o Aprender analizar una muestra por medio de cultivos.

o Adquirir habilidades y destrezas en el desarrollo del análisis, para el mejor manejo
de materiales y equipos del laboratorio.

4. MATERIALES E INSUMOS:

MATERIALES EQUIPOS REACTIVOS Y MUESTRA

SUSTANCIAS

 Jugos de
los
 Agar S.S
 Matraz comedores
 Autoclave (Salmonela-
Erlenmeyer 250ml
Shiguella)

 Vaso de  Agar Mac

precipitación de  Incubadora Conkey
100 y 250 ml
 Agar Rojo
 Cajas Petri  Estufa Violeta y Bilis

 Cuenta  Agar Manitol

 Varillas de vidrio Salado
colonias
 Mecheros de
alcohol
 Lápiz graso

 Peras
 Tubos de ensayo
pequeños
 Gradillas
5. PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO AGAR BILIS ROJO VIOLETA

# ACTIVIDADES OBSERVACIONES

Suspenda 41,5 g del medio en un litro de agua purificada.

1

Caliente la solución agitando frecuentemente y permita la

2
ebullición durante dos minutos. NO AUTOCLAVAR.

Permita el enfriamiento del medio a 45–46°C y dispense 15–

3 20 mL en una placa de Petri de 100 mm que contiene el
inóculo.

Luego de la solidificación del medio inoculado, adicione de

4 manera uniforme una capa de cubrimiento de 4 mL del medio
de agar enfriado (45–46°C).

Procedimiento de la Siembra:

-Para propósitos generales: Estriar directamente la superficie del medio de cultivo.

-Para recuento bacteriano:

- En la superficie: sembrar hasta 0,1 ml de la muestra directa o de la dilución apropiada

y esparcirla en el medio de cultivo.

-En profundidad: inocular hasta 1 ml de la muestra directa o de la dilución. Verter un

volumen del medio de cultivo fundido y enfriado a 40-45 °C. Homogenizar mediante
movimientos de vaivén y rotación. Dejar solidificar.

Luego si se desea, agregar una sobrecapa de medio de cultivo para crear condiciones
anaeróbicas de manera que se evite el crecimiento de microorganismos Gram (-) no
fermentadores de azucares y el crecimiento en forma invasiva de Proteus spp.

-Incubación

En aerobiosis, a 35-37°C durante 18-24 horas. Las placas pueden ser re incubadas durante 24
horas adicionales.
 PROCEDIMIENTO SALMONELLA SHIGELLA AGAR

# ACTIVIDADES OBSERVACIONES

Disolver 63 g de medio en 1 litro de agua destilada.

1

Calentar agitando hasta ebullición para su disolución.

2

Mantener la ebullición durante 2 minutos. Autoclavar 116 ºC

3 durante 5 minutos.

El color final del medio es rojo-naranja.

4

-Procedimiento Siembra

Sembrar estriando directamente la superficie del medio de cultivo.

-Incubación

En aerobiosis a 35-37 ºC durante 18-24 horas.

PROCEDIMIENTO MANITOL SALADO AGAR

# ACTIVIDADES OBSERVACIONES

Suspender 111 g de medio deshidratado en un litro de agua

destilada.
1

Mezclar vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y

dejar hervir durante 1 minuto para disolver completamente
2 los ingredientes.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Dejar enfriar hasta

una temperatura entre 40-45ºC y verte en placas estériles.
3

Dejar solidificar a temperatura ambiente antes de su

4
utilización.
-Procedimiento Siembra

Sembrar en superficie un inoculo denso de la muestra por estría.

-Incubación

En aerobiosis, a 35-37ºC durante 18-24 horas. Si a las 24 horas las placas presentan resultado
negativo, inocubar 24 horas. La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la
incubación durante 3 días a 32ºC, aerobiosis.

PROCEDIMIENTO MAC CONKEY AGAR

# ACTIVIDADES OBSERVACIONES

Suspender 50 g del polvo en un litro de agua destilada.

1

Reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente y

dejar hervir durante 1-2 minutos para disolver Mezclar
2 completamente los ingredientes. vigorosamente.

Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave

a 121°C durante 15 min.
3

-Procedimiento Siembra

-En superficie: inocular directamente la muestra por estría.

-En profundidad: inocular una alícuota de la muestra directa o de su dilución. Verter un

volumen del medio de cultivo fundido y enfriado a 40-45°C. Homogenizar mediante movimientos
de vaivén y rotación. Dejar solidificar.

-Incubación.

En aerobiosis, a 35-37°C durante 18-48 horas.

 6. CUADRO DE RESULTADOS

AGAR BILIS ROJO VIOLETA

Muest Microorganismo Crecimiento Características de la colonia.
ra

1  Enterococcus faecalis  Escaso  Rosadas pequeñas puntiformes

 Salmonella typhimurium  Satisfactorio  Incoloras
 Proteus mirabilis  Satisfactorio  Incoloras
 Pseudomonas  Satisfactorio  Incoloras
aeruginosa
2  Escherichia coli  Satisfactorio  Rojas, de 1-2 mm de diametro,
con halo de precipitacion rojizo.

3  Enterococcus faecalis  Satisfactorio  Rosadas pequeñas puntiformes

4  Escherichia coli  Escaso  Rojas de 1-2 mm de diametro,

con halo de preciitacion rojizo.
 Salmonella typhimurium  Satisfactorio  Incoloras
 Proteus mirabilis  Satisfactorio  Incoloras
 Pseudomonas  Satisfactorio  Incoloras
aeruginosa
 SALMONELLA SHIGELLA AGAR

Muestra Microorganismo Crecimiento Color de la colonia

1  Salmonela enteritidis  Escaso  Incolora

 Salmonela Typhimurin  Escaso  Incolora

 Shigella flexneri  Escaso  Incolora

 Shigella sonnei  Escaso  Incolora

 Proteus mirabilis  Escaso  Incolora

 Enterococcus faecalis  Escaso  Incolora

 Escherichia coli  Satisfactorio  Rojo Rosada

2  Escherichia coli  Satisfactorio  Rojo Rosada

3 Negativo Negativo Negativo

4  Salmonela enteritidis  Satisfactorio  Incolora

 Salmonela Typhimurin  Satisfactorio  Incolora

 Shigella sonnei  Satisfactorio  Incolora

 Proteus mirabilis  Satisfactorio  Incolora

 Enterococcus faecalis  Satisfactorio  Incolora

MANITOL SALADO AGAR

Muestra Microorganismo Crecimiento Color de Colonias

1  Staphylococcus aureus  Satisfactorio  Amarillas

rodeadas de un

halo amarillo.

2  Staphylococcus aureus  Escaso  Amarillas

rodeadas de un

halo amarillo.

3  Staphylococcus aureus  Satisfactorio  Amarillas

rodeadas de un

halo amarillo.

4 Negativo Negativo Negativo

 MAC CONKEY AGAR

Muest Microorganismo Crecimiento Color de Colonias Precipitació

ra n Biliar

1  Salmonella  Escaso  Incoloro +

Typhimurium +

 Shigella flexneri  Escaso  Incoloro +

 Proteus mirabilis  Escaso  Incoloro +

 Escherichia coli  Satisfactorio  Rosado +

 Kleibsiella  Satisfactorio Rojiso

pneumoniae  Rosado

Rojiso

2  Salmonella  Escaso  Incoloro +

Typhimurium

 Shigella flexneri  Escaso  Incoloro +

 Proteus mirabilis  Escaso  Incoloro +

 Escherichia coli  Escaso  Incoloro +

 Kleibsiella  Escaso  Incoloro +

pneumoniae

3  Salmonella  Escaso  Incoloro +

Typhimurium

 Shigella flexneri  Escaso  Incoloro +

 Proteus mirabilis  Escaso  Incoloro +

4  Escherichia coli  Satisfactorio  Rosado +

Rojiso

 Kleibsiella  Satisfactorio  Rosado +

pneumoniae Rojiso
  Contador de Colonias

Muestra AGAR BILIS SALMONELLA MANITOL MAC CONKEY

ROJO VIOLETA SHIGELLA AGAR SALADO AGAR
AGAR
Ufc (unidades Ufc Ufc Ufc
formadoras de
colonias)

1 64 24 28 36
2 64 52 0 4
3 10 No No 12
4 16 12 8 8

 Resultados del microscopio

AGAR BILIS ROJO VIOLETA

Muest Microorganismo Crecimiento Características de la colonia.

ra

1  Enterococcus faecalis  Escaso  Rosadas pequeñas puntiformes

 Salmonella typhimurium  Satisfactorio  Incoloras
 Proteus mirabilis  Satisfactorio  Incoloras
 Pseudomonas  Satisfactorio  Incoloras
aeruginosa
 SALMONELLA SHIGELLA AGAR

Muestra Microorganismo Crecimiento Color de la colonia

1  Salmonela enteritidis  Escaso  Incolora

 Salmonela Typhimurin  Escaso  Incolora

 Shigella flexneri  Escaso  Incolora

 Shigella sonnei  Escaso  Incolora

 Proteus mirabilis  Escaso  Incolora

 Enterococcus faecalis  Escaso  Incolora

 Escherichia coli  Satisfactorio  Rojo Rosada

MANITOL SALADO AGAR

 Muestra Microorganismo Crecimiento Color de Colonias

1  Staphylococcus aureus  Satisfactorio  Amarillas

rodeadas de un

halo amarillo.

MAC CONKEY AGAR

Muest Microorganismo Crecimiento Color de Colonias Precipitació

ra n Biliar

1  Salmonella  Escaso  Incoloro +

Typhimurium

 Shigella flexneri  Escaso  Incoloro +

 Proteus mirabilis  Escaso  Incoloro +

 Escherichia coli  Satisfactorio  Rosado +

 Kleibsiella  Satisfactorio Rojiso

pneumoniae  Rosado +

Rojiso
7. Conclusiones:

Por medio de la siguiente practica podemos describir que un medio de cultivo es una técnica de
laboratorio que consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus,
microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera
hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan
desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden
encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de
cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad
y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento
de todo microorganismo contaminante.

Cabe mencionar que dichos resultados provienen de los jugos de los bares de nuestra institución
el cual nos dicta que no son proveniente de agua potable.

8. Recomendaciones:

 Usar vestimentaadecuada debido a que estos cultivos son irritantes para los ojos, piel y
el sistema respiratorio.
 Solamente para uso diagnostico in vitro.
 Desinfectar el lugar donde trabajaremos.
 Tener mucha precausion al momento de usar los equipos.

9. Bibliografía:

o Krikorian, A. D. (1991). Medios de cultivo: generalidades, composición y

preparación. Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT,
41-77.
o Neves, D. P. (2002). Parasitologia humana. In Parasitologia humana.
o Merck, E. (1985). Manual de medios de cultivo Merck (No. 01-A1 LU. AL-McAl. 2.).
Darmstad,, Germany: E. Merck.
o Harrigan, W. F., Mac Cance, M. E., Acha, I. G., & Villanueva, J. R. (1968). Métodos de
laboratorio en microbiología (No. 576 HARm). Madrid: Academia.
o Medina, R., Moreno, L. C., Velasco, M. C., & Gutiérrez, S. J. (2016). Estudio comparativo
de medios de cultivo para crecimiento y recuperación del Streptococcus mutans ATCC
25175 “in vitro”.
10. Anexos:

Ilustración 1 Medios de cultivo

Ilustración 2 Cajas Petri con las colonias

Ilustración 3 Contador de Colonias