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INDICE
I. OBJETIVOS: ................................................................................................................................ 3
1. GENERAL: 3

2. ESPECÍFICOS: 3

II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL: ............................................................................................. 4

CONSIDERACIONES 4

1. DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD 4

2
2. METODO DE INMOVILIZACION DE INULINASA EN ALGINATO DE SODIO: 5

3. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MÉTODO DEL DNS. 7

4. OBTENCIÓN DEL PREPARADO DE ENZIMÁTICO EN BRUTO DE INULINASA DE

LEVADURA.- 7

5. RANGO DE LINEALIDAD...................................................................................... 7
6. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE LA ENZIMA ........................................ 8
7. DISEÑAR Y MONTAR EL SISTEMA MINI-REACTOR CON INVERTASAINMOVILIZADA,
PARA DETERMINAR LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ENZIMA. 9

III. CRONOGRAMA ..................................................................................................................... 11

IV. ANEXO ................................................................................................................................... 12
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BIOCATALISIS ENZIMATICA
kluyveromyces marxiamus NRRL Y-7571

I. OBJETIVOS:
1. GENERAL:
3
“Diseñar y realizar experiencias de estudios cinéticos de la enzima inulinasa 2,2-
β-D-fructan fructanohidrolasa EC 3.2.1.7, de un concentrado enzimático,
proveniente de caldo crudo libre de células de kluyveromyces marxiamus NRRL
Y-7571 en sus formas solubles e inmovilizadas ’’.

2. ESPECÍFICOS:

 Obtención del concentración enzimático de un caldo de Kluyveromyces

marxianus por NRRL Y -7571.
 obtención de curvas de calibrado de proteínas y azucares reductores.
 Determinar el rango de linealidad y
 Determinar la actividad enzimática (actividades volumétrica y específica)
de la enzima en el caldo crudo.
 Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada.
 Diseñar y montar el sistema mini-reactor con Inulinasa inmovilizada.
Analizar su comportamiento
 Inmovilizar Inulinasa en geles.
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II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL:

CONSIDERACIONES

 Usar soluciones concentradas de sacarosa: 0.2 M – 0.6M

 Utilizar como soporte Alginato de Sodio al 1.5%-4.5% (p/v)
 Usar un sistema mini-reactor enzimático por lotes agitado.
 Definición de IU: una unidad internacional de Inulinasa es aquella cantidad de 4
enzima necesaria que hidroliza un micromol (1 µmol) de sacarosa por minuto, a
55°C y pH 5.0 (Tampón Acetato de Sodio 0.05 M).

1. DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD

Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre

un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a
la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos
orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil
de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de
absorbancia a 280 nm.

Reactivos
 Reactivo de azul brillante de coomassie G-250
 50 ml de etanol 95 %.
 Acido fosfórico al 85 %(w/v)
 Agua destilada

Materiales
 Tubos de ensayo
 Espectrofotómetro
 Matraces
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Procedimiento

DISOLVER <vasos precipitado>

< Disolver 0.1g de azul de
Coomassie G-250 en 50 ml de
etanol al 95%,

<Tubo de ensayo>
< añadir 100ml de acido ANADIR
fosforíco al 85% H2O (aforrar
hasta un1 Lt) > 5

< 100 µl de muestra diluida con AGREGAR

tampón buffer >

< 5 ml de reactivo de Bradford

a cada muestra mezclar > AÑADIR < dejar reaccionar por 5 min >

<Absorvancia a 595 nm con

LEER una blanco de agua destilada>

2. METODO DE INMOVILIZACION DE INULINASA EN ALGINATO DE SODIO:

La Enzima inmovilizada es una enzima que ha sido fijada en un material inerte,

insoluble, como el alginato de calcio (producido haciendo reaccionar una mezcla
entre una solución de alginato de sodio y la enzima con cloruro de calcio). Este
proceso puede incrementar la resistencia a cambios en las condiciones en las que
se encuentra el preparado, tales como pH y temperatura. A su vez permite que
las enzimas sean contenidas en un soporte durante la reacción, luego de la cual
son fácilmente separadas de los productos y pueden ser reutilizadas.

Reactivos
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 Alginato de sodio al 2%
 Inulinasa
 CaCl2 0.1 M
 CaCl2 0.05 M
 Agua destiladas

Materiales
 Vaso de precipitado 6
 pipetas
 Olla
 Hielo
 Jeringa
 Matraces
 mechero
 refrigerador
 Mini reactor

Procedimiento
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Disolucion de alginato PREPARAR

de sodio al 2%

CALENTAR <T= 80 c° x 15 min>

<t=45 c° >
ENFRIAR
5ml de muestra +1 ml
de inulinasa <cargado todo en un jeringa> 7
MEZCLAR

La mezcla dentro de 30 <con jeringa>

ml de sol agitada de
GOTEAR
CaCl2 0.1 M

Los beads esféricos en REPOSAR <2-3 horas >

enzima ,en
refrigeración

Con una solución de LAVAR

CaCl2 0.05 M

EMPACAR <minireactor>

3. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MÉTODO DEL DNS.

4. OBTENCIÓN DEL PREPARADO DE ENZIMÁTICO EN BRUTO DE INULINASA DE
LEVADURA.-

5. RANGO DE LINEALIDAD
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La experiencia se realizara a diferentes diluciones del extracto bruto enzimático

1:1,1:2,1:3,…., se graficará la concentración de Sustrato o Producto contra tiempo de
reacción (tiempo vs. Sustrato o Tiempo vs. Producto.) y se expresa correctamente los
valores de las actividades volumétricas (UI/mL.) y especifica (UI/mg.):

Se obtendría una gráfica parecida a la siguiente:

8
0.8
S

P
0.6

0.2

Figura 1: Rango de Linealidad de la Enzima en el Tiempo

6. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE LA ENZIMA

Es la cantidad de enzima que en una reacción enzimática cataliza la conversión

de 1 µmol de sustrato por minuto. Es una medida muy utilizada para expresar la
actividad de preparaciones enzimáticas. Las enzimas son de naturaleza proteica
y, aunque muchas contienen en su estructura otro tipo de molécula, su
funcionabilidad biológica radica siempre en su porción proteica. La capacidad
catalítica de la enzima reside en su sitio activo, que esta conformado por un
número de residuos aminoaciditos que se agrupan en la estructura
tridimensional para generar un nicho, donde el substrato es ligado y
químicamente transformado.

Utilizaremos el método del DNS para determinar la actividad enzimática.

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La conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa.

Se obtendría una gráfica parecida a la siguiente:

20
18
AZUCARES REDUCTORES (g/l)

16
14
9
12
10 E;1:01
8 E;1:02
6 E;1:04
4
2
0
0 5 10 15 20 25
tiempo (min)

Figura 2: Grafica de tiempo vs Azucares reductores

7. DISEÑAR Y MONTAR EL SISTEMA MINI-REACTOR CON INVERTASAINMOVILIZADA,

PARA DETERMINAR LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ENZIMA.
La forma usual de determinar los parámetros cinéticos es a través de mediciones
de velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de sacarosa en un
reactor por lote. La manera más adecuada de obtenerlos es por linealización de
la ecuación cinética. Para ello emplearemos el método de los inversos o
Lineweaver – Burke, para un modelo cinético simple.

E + S E S E + P

V ma x [ S ]
Vo = ( 4)
K m + [S ]
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 MÉTODOS DE LINEALIZACIÓN PARA DETERMINAR PARÁMETROS CINÉTICOS

Para determinar gráficamente los valores de KAP y VAP es más sencillo utilizar la
representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta.
Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de
Lineweave-Burk. De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede
calcular gráficamente, los valoresde KAP y VAP en un enzima para diversos
sustratos.
10
Cuadro 1: Método de Lineweaver – Burke

Método Eje Y Eje X Intercepto Intercepto Pendiente

Eje Y Eje X

Lineweaver – 1/v 1/s 1/VAP -1/KAP KAP/VAP

Burke

V max (A) 1 (B)

Vo
Vo

K AP
V max Pendiente
V AP
2 =
1
V max

Km [S] 1 1
Km [S]

Figura 3: Determinación de parámetros cinéticos mediante

 MÉTODO DE INVERSOS DE LINEWEAVER – BURKE

Para el caso de cinética simple emplearemos la siguiente ecuación de balance para un

Reactor Enzimático por Lote:
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S0/K

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ket/K

Figura 4: Comportamiento de un Reactor Enzimático por Lote

III. CRONOGRAMA

ACTIVIDADES FECHA

 Método de bradford 20/11/2014

 Curva de DNS

 Rango de linealidad y actividad de la enzima

 Determinación parámetro cinético de enzima soluble e 27/11/2014

imbobilizada

 Puesta en marcha y seguimiento de un minireactor con la 04/12/2014

enzima inmovilizada.

 Presentación del informe final 15/12/2014

 Sustencion de informe final 16/12/14

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IV. ANEXO

CUADRO 1 : EXPERIMENTAL PARA DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS

CINÉTICOS:

Nº Solución A Solución B Solución C Concentración de

muestra (ml) (ml) (ml) Sacarosa (g/l)

1 26 1 3
12
2 23 1 6

3 20 1 9

4 18 1 11

5 15 1 14

6 12 1 17

7 9 1 20

8 6 1 23

9 3 1 26

10 0 1 29

Sol. A: Buffer acetato 0.05M, pH 4.7

Sol. B: Preparado Enzimático, ExtractoCrudo

Sol. C: Solución Sustrato Sacarosa 0.2M

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CUADRO 02: Datos experimentales azucares DNS

DNS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
min

6
13
10

15