Anda di halaman 1dari 4

Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai
dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri
tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat.
Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis.
Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika
positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut,
dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabber, dan
Fluorochrom.

Ada beberapa metode pewarnaan Bakteri Tahan Asam, antara lain :


a. Metode Ziehl Neelsen
b. Metode Kinyoun – Gabbet

A. Pewarnaan Ziehl Neelsen


Pewarnaan Ziehl Neelsen, termasuk pewarnaan tahan asam. Biasanya dipakai untuk mewarnai golongan
Mycobacterium (M. tuberculosis dan M. leprae) dan Actinomyces.
Bakteri genus Mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipid
(lemak) sehingga bersifat permeable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadap
pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa
tuberculosis.
Pewarnaan ini merupakan prosedur untuk membedakan bakteri menjadi 2 kelompok tahan asam dan tidak tahan
asam.
Bila zat warna yang telah terpenetrasi tidak dapat dilarutkan dengan alkohol asam, maka bakteri tersebut disebut
tahan asam sedangkan sebaliknya disebut tidak tahan asam.
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3
%, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan
ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu
pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan
pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu
asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir
untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri
yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna.
Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay,
1994)

Cara Pewarnaan ZN:


1. Sediaan dituangi Carbol Fuchsin sampai penuh
2. Panaskan selama 3-5 menit, jangan sampai mendidih
3. Biarkan dingin selama 5 menit, cuci dengan air
4. Dekolorisasi dengan alkohol asam 10-30 detik, cuci dengan air
5. Tuangi dengan methylen blue selama 20-30 detik, cuci dengan air
B. Pewarnaan Kinyoun & Gabbet
Pewarnaan Kinyoun & Gabbet berbeda dari Ziehl-Neelsen yaitu bahwa tidak diperlukan pemanasan terhadap
warna primer (Larutan Kinyoun). Digunakan reagen fuksin-karbol yang lebih pekat sehingga zat warna dapat
menembus mikroba sehingga tidak diperlukan pemanasan.
1) Larutan Kinyoun (fuchsin basis 4g, fenol 8ml, alkohol 95% 20ml, H2O destilata (100ml) dituang pada
permukaan sediaan
2) Didiamkan selama 3 menit, kemudian kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir
perlahan.
3) Selanjutnya larutan Gabbet (methylene blue 1g, H2SO4 96% 20ml, alkohol absolut 30ml, H2O destilata
50ml) dituang pada permukaan sediaan,
4) Didiamkan 1 menit kemudian kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan,
kemudian sediaan dikeringkan di udara
5) Setelah kering, sediaan dibaca dibawah mikroskop cahaya.

PEWARNAAN KHUSUS

A. Pewarnaan Flagel
Flagella merupakan alat gerak bakteri. Flagella mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun
fagella adalah sub unit protein yang di sebut fagellin yang mempunyai berat molekul rendah. Berdasarkan
jumlah dan letak fagella nya bakteri di bedakan menjadi monotorik, lapotrik, amftrik, peritrik, dan atrik.
Flagella merupakan salah satu organel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Untuk
dapat melihat fagella harus dengan pewarnaan khusus dan di lihat dengan menggunakanmikroskop. salah
satu cara pewarnaan fagella adalah pewarnaan Graydan dan Leiyson. keberadaan fagella pada bakteri juga
dapat di ketahuidengan melihat efek atau akibat dari adanya fagella tersebut. Pada pewarnaan fagella ada
beberapa bakteri yang mampu bergerak dengan menggunakan bulu cambuk/fagella. Flagella terdiri
dariprotein dengan diameter 12-13/ nanometer. Pada pembuatan preparat tidak di perbolehkan
menggunakan ose dan tidak boleh di keringkan pada suhu yang tinggi karena dapatmerusak morfologi dan
fagella 0fagella dapat rontok. Flagella memungkinkan bakteri untuk bergerak ke kondisi lingkungan
yangmengunungkan dan menghidari lingkungan yang merugikan bagi kehidupannya.
Prinsip pewarnaan fagella adalah membuat organel tersebut dapat di lihat dengan cara melapisinya dengan
larutan mordant dalam jumlah yang cukup ada dua metode pada pewarnaan fagella yaitu metode Gray dan
dan metode Leiyson. Metode gray di gunakan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik dan mengena
walaupun dalam metode ini tidak di lakukan pencelupan khusus.
B. Pewarnaan Kapsula
Kapsula merupakan lapisan polimer yang terletak di luar dinding sel. Jika lapisan polimer ini terletak berlekatan
dengan dinding sel maka lapisan ini disebut kapsula. Tetapi jika polimer atau polisakarida ini tidak berlekatan
dengan dinding sel maka lapisan ini disebut lendir (Darkuni: 2001). Baik kapsula maupun lendir terdiri dari
polisakarida dan polipeptin (komplek polisakarida dengan protein). Kapsula bukan organ yang penting untuk
kehidupan sel bakteri. Hal ini terbukti bahwa sel bakteri yang tidak dapat membentuk kapsula mampu tumbuh
dengan normal dalam medium. Kapsula berfungsi dalam penyesuaian diri dengan lingkungannya. Misalnya
berperan dalam mencegah terhadap kekeringan, mencegah atau menghambat terjadinya pencantelan bakteriofag,
bersifat antifagosit sehingga kapsul memberikan sifat virulen bagi bakteri. Kapsula juga berfungsi untuk alat
mencantelkan diri pada permukaan seperti yang dilakukan oleh Streptococcus muans (Darkuni, 2008).

Tanpa pewarnaan, kapsul bakteri sangat sukar diamati dengan mikroskop cahaya biasa karena tidak berwarna dan
mempunyai ideks bias yang rendah. Karena kapsul bersifat non-ionik, maka pewarnaanya tidak dapat dilakukan
menggunakan prosedur yang sederhana dan biasa. Masalah utama dalam pewarnaan kapsul ialah bila olean bakteri
yang telah isiapkan itu difiksasi dengan panas menurut metode yang biasa, maka kapsul tersebut akan rusak, namun
apabila tidak difikasi dengan panas, maka organisme tersebut akan meluncur pada waktu pencucian. Dalam banyak
pekerjaan bakteriologis, yang kita perlukan hanyalah sekedar memperagakan ada atau tidaknya kapsul. Tujuan ini
dapat digunakan dengan cara menggabungkan proses pewarnaan negatif dengan pewarnaan sederhana. Teknik
pewarnaan lain untuk melihat kapsul pada bakteri antara lai dengan metoda pewarnaan Anthony, Pewarnaan Hiss,
Pewarnaan Leifson, pewarnaan Tyler, Pewarnaan Tinta India

a. Pewarnaan kapsula metode Tinta India ( India Ink Method)


Dalam metode ini dua pewarna, kristal violet dan tinta india digunakan. Kapsul ini terlihat sebagai lingkaran
cahaya yang jelas di sekitar mikroorganisme dengan latar belakang hitam. Metode ini digunakan untuk
mengamati Cryptococcus.
 Latar belakang akan gelap (warna tinta india).
 Sel-sel bakteri akan berwarna ungu (sel bakteri mengambil pewarna dasar kristal violet karena mereka
bermuatan negatif).
 Kapsul (jika ada) akan tampak jernih dengan latar belakang gelap (kapsul tidak mengambil noda apa
pun)
Cara Kerja
1. Teteskan tinta india di atas kaca preparat
2. Oleskan sample mikroba tepat diatas tinta india
3. Gunakan slide lainnya untuk menyeret campuran sel tinta hingga rata dan tipis di sepanjang slide pertama
dan diamkan selama 5-7 menit.
4. Biarkan mongering ( ingat jangan dipanaskan)
5. Bilas noda dengan noda violet kristal (ini akan menodai sel tetapi tidak kapsul) selama sekitar 1 menit.
Tiriskan violet kristal dengan memiringkan slide pada sudut 45 derajat dan biarkan noda mengalir sampai
udara mengering.
6. Amati hasil pewarnaan dengan mikroskop

b. Pewarnaan kapsula metode Anthony (Anthony’s Stain Method)


Dalam jenis prosedur pewarnaan kapsul ini, pewarnaan primer adalah kristal violet, dan semua bagian sel
mengambil noda ungu kristal ungu. Tidak ada mordan dalam prosedur pewarnaan kapsul. Larutan sulfat
tembaga 20% berfungsi sebagai peran ganda sebagai dekolorisasi agen dan counterstain. Sulfat tembaga akan
mendekolorisasi kapsul dengan mencuci kristal ungu, tetapi tidak akan menghitamkan sel. Ketika tembaga
sulfat menipiskan kapsul, ia juga menebalkan noda kapsul. Dengan demikian, kapsul muncul sebagai lingkaran
biru samar di sekitar sel ungu.
Cara Kerja
1. Teteskan crystal violet di atas kaca preparat
2. Oleskan sample mikroba tepat diatas tinta india
3. Gunakan slide lainnya untuk menyeret campuran sel tinta hingga rata dan tipis di sepanjang slide pertama
dan diamkan selama 5-7 menit. (jangan dipanaskan)
4. Miringkan slide dan bilas dengan menggunakan tembaga sulfat 20 %. JANGAN BILAS DENGAN AIR, KARENA
AKAN MELUNTURKAN SAMPEL BAKTERI
5. Biarkan mongering. Jangan keringkan menggunakan kertas hisap
6. Amati hasil pewarnaan dengan mikroskop

C. Pewarnaan Endospora