CÓDIGO: IIL-LAB-01

INFORME DE
LABORATORIO Versión: 00
DE Q. A. Fecha de vigencia: Marzo 2015
INSTRUMENTAL II
UCE- FAC.CCQQ
Página 1 de 8

Número : 13
Título : CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA HPLC I
Fecha : 2018-07-23
Integrantes / Grupo : Alvarado J.; Bagua P.; Batallas K.; Falconí N.; Guanoliquín C.;
Guerra K. /GRUPO 3

RESUMEN
En el presente trabajo se realizó el análisis de la concentración ácido ascórbico en una
forma farmacéutica mediante la aplicación del método de cromatografía de líquidos de
alta resolución (HPLC), para este fin se realizó la preparación de la fase móvil, así como
de la solución diluyente, adicionalmente se preparó el estándar y la muestra para ser
analizada. Los resultados obtenidos del cromatógrafo para el estándar fueron: tiempo
de retención de 1,613 min y área del pico 590,2422 mAU*min; mientras que para la
muestra se detectó un área de pico de 18,3042 mAu*min y el tiempo de retención fue
1,627 min. La comparación del área del pico del estándar con respecto al área de la
muestra determinó que la tableta de vitamina C en función del patrón externo tuvo una
concentración de 3,1011 𝑝𝑝𝑚.

Palabras Clave: HPLC, cromatógrafo, tiempo de retención, área de pico.

ABSTRACT

In the present work was carried out the analysis of the ascorbic acid concentration in a
pharmaceutical form by the application of the liquid chromatography method of high
resolution (HPLC), for this purpose the preparation of the mobile phase was done, as
well as the solution diluent, additionally the standard and the sample were prepared to
be analyzed. The results obtained from the chromatograph, for the standard, were:
retention time of 1.613 min and peak area 590.2422 mAU * min; while for the sample
was detected a peak area of 18,3042 mAu * min and the retention time was 1,627 min.
The comparison of the peak area of the standard with respect to the sample area
determined that the vitamin C tablet as a function of the external standard had a
concentration of 3.1011 ppm.

Key Words: HPLC, chromatograph, retention time, peak área.


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FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía líquida (HPLC), es una
técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste
en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La fase
estacionaria es sílica, mientras que la
fase móvil actúa de portador de la
muestra. La muestra en solución es
inyectada en la fase móvil. Los
componentes de la solución emigran de
acuerdo a las interacciones no-
covalentes de los compuestos con la
columna. Estas interacciones químicas,
determinan la separación de los
contenidos en la muestra. La utilización
de los diferentes detectores dependerá
de la naturaleza de los compuestos a
determinar (Miranda, 2012)
En tal virtud al presentar las
especificaciones mencionadas
anteriormente es posible que la eficacia
del sistema sea muy elevada
proporcionando columnas con un
número muy grande de platos teóricos.
Para vencer la enorme resistencia que
ofrece la fase estacionaria al paso de la
fase móvil es necesario emplear un
sistema de bombeo a alta presión. Otra
característica importante de la HPLC es
la detección continua de los analitos
conforme son eluidos.
Esta técnica es indicada para la
separación de compuestos orgánicos
semivólatiles como: Hidrocarburos
Poliaromáticos, Aminoácidos (Ácido
Fólico, Herbicidas, Vitaminas,
Formaldehído). (Belmonte, 2016)
Objetivos
 Conocer el método de
cromatografía de líquidos de
alta resolución (HPLC)
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 Estudiar las aplicaciones
cuantitativas de los métodos de
HPLC
 Analizar una mezcla de
vitaminas hidrosolubles y ácido
fólico
 Determinar la concentración de
ácido ascórbico en una forma
farmacéutica
Materiales y reactivos
– Balón aforado de 100ml
– Filtro milipore
– Jeringuilla hipodérmica de 50ml
– Jeringuilla para HPLC
– Pipeta graduada de 1ml
– Pipeta volumétrica de 10ml
– Acido fosfórico 0.1% pH 2.2 (grado
cromatográfico)
– PIC B6 (Ácido hexano sulfónico
20mM grado cromatográfico)
– Vitamina C (grado cromatográfico)
– Agua destilada
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DE LA FASE MOVIL
Para preparar 300ml:
Pesar 0.8470g de PIC B6
Mezclar 0.23ml de ácido fosfórico con
200ml de agua destilada, agregar el PIC
B6 y completar el volumen hasta 225ml.
Para completar la fase móvil, agregar
metanol hasta completar 300ml de
mezcla.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCION
DILUYENTE
 Para preparar 500ml:
Mezclar 470ml de agua destilada, 25ml
de acetonitrilo y 5ml de ácido acético
glacial.
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PREPARACIÓN DEL ESTANDAR PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

 Pesar con exactitud de 0.1mg, la  Pesar 1 tableta y calcular el peso

masa calculada de estandár y
diluir con una solución diluyente
en un balón aforado de 100ml.
Agitar en vortex durante diez
minutos, filtrar en caso de ser
necesario.
promedio.
 Moler finamente y pesar con
exactitud 0.1 g de muestra.
 Diluir con solución diluyente en
un balón aforado de 100ml.
Agitar en vortex para asegurar
una disolución completa.

RESULTADOS

Tabla 1. Valor del área del pico del estándar.

Estándar Concentración Área del pico
(ppm) (mAU*min)
1 100 590,2422
Elaborado por: Bagua P & Otros

Figura 1: Cromatograma del estándar de 100ppm

Elaborado por: Bagua P & otros

Tabla 2. Valor del área del pico de la muestra Cebión.

Muestra FD Área del pico (mAU*min)
1 10 18,3042
Elaborado por: Bagua P & Otros
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Figura 1: Cromatograma de la muestra Cebión

Elaborado por: Bagua P & otros

Cálculo de la concentración de ácido ascórbico para la muestra de Cebión

CST ∗ AM
𝑪𝒎 =
AST
100 ppm ∗ 18,3042 mAU ∗ min
𝑪𝒎 =
590,2422 mAU ∗ min
𝑪𝒎 = 𝟑, 𝟏𝟎𝟏𝟏 𝒑𝒑𝒎
DISCUSIONES en forma diferente entre la fase
determinando así ciertas características
La cromatografía es un método de
que permitirán evaluar a la muestra
separación de componentes de una
cualitativa y cuantitativamente (Harris,
muestra, a través del paso de ésta por
2003)
una fase estacionaria con la ayuda de la
fase móvil, donde cada componente de La cromatografía para el análisis
la muestra tiene propiedades cuantitativo se fundamenta en la
particulares que permitirá su interacción comparación de la altura, o del área, del

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pico del analito con la de uno o más
patrones inyectados bajo las mismas
condiciones cromatográficas siendo
este factor directamente proporcional a
la concentración. Basado en esto se
analizó Ácido ascórbico en una tableta
efervescente de vitamina C marca
“Cebión” caracterizada por el tiempo de
retención constante para un sistema
cromatógrafo que representa el tiempo
transcurrido desde la introducción de la
muestra en la columna hasta el
momento en el que un constituyente de
interés alcanza el máximo de señal en el
detector (Sierra, Gómez, Pérez, &
Morante, 2010).
Para una muestra de concentración
conocida de Ac. Ascórbico (100ppm) el
tiempo de retención fue 1,613 min con
área del pico de 590,2422 mUA*min en
comparación con la de la muestra que
obtuvo un tiempo de retención de 1,627
min con área del pico de 18,3042
mUA*min. La comparación del área del
pico del estándar con respecto al área
de la muestra determinó que la tableta
de vitamina C en función del patrón
externo tiene una concentración de
3,1011 𝑝𝑝𝑚
El Ác. Ascórbico puede ser oxidado
rápidamente además de que presenta
inestabilidad en soluciones acuosas
aisladas por lo que si se expone al aire
por tiempos prolongados o el agua al
preparar la solución tiene una cantidad
de oxígeno disuelto alta se favorecerá la
oxidación del analito y se generará un
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error en la medición, por lo que es
necesario trabajar con muestras frescas
y recién preparadas.
CONCLUSIONES
Se conoció que el método de
cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC), es un tipo de
cromatografía en columna,
generalmente utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose
en diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias
analizadas y la columna cromatografíca.
Es importante conocer las aplicaciones
de las cuales se puede sacar provecho
en este método puesto que son usadas
principalmente en la separación de
compuestos orgánicos semi-volátites
como Hidrocarburos Poliaromáticos,
Aminoácidos (Ácido Fólico, Herbicidas,
Vitaminas, Formaldehído etc.
El ácido ascórbico es relativamente
estable en el aire, en ausencia completa
de humedad, mientras la sal sódica
tiende a volverse amarilla. Las
soluciones acuosas son atacadas por el
oxígeno atmosférico y otros agentes
oxidantes. Los álcalis y los iones de
metales pesados (por ejemplo, cobre)
actúan como catalizadores.
Se determinó la concentración de ácido
ascórbico en forma farmacéutica de la
marca “Cebión” a través del método de
cromatografía liquida HPLC misma que
presenta una concentración de
3,1011 𝑝𝑝𝑚
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CUESTIONARIO
a) Diseño y funcionamiento de un Cromatógrafo HPLC
La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas de análisis basadas en la
separación de componentes de una mezcla y su posterior detección. Las técnicas
cromatografías son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que
consiste en un fluido (gas, líquido, o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra
con un flujo constante de presión proporcionado por una bomba, hasta llegar al punto
donde es introducida la muestra. Siguiendo el flujo de presión la lleva a una columna
donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado
en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la
fase estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la
fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de haber
pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado, pasan por un
detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo
del compuesto.
El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase móvil con presión y flujo
constante, el proceso de inyección de la muestra en la actualidad es automática, las
columnas que se utilizan normalmente son de acero inoxidable y los detectores su
papel fundamentalmente es de indicar el momento de aparición de los diferentes
componentes que constituyen la muestra, calificarlo cuantitativamente como
cualitativamente. (Fogler, H. S., 1992)

Componentes básicos de un cromatógrafo.

Figura 1. Componentes básicos del cromatógrafo

Fuente. (Fogler, H. S., 1992)
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Figura 2. Fundamento de la composición del HPLC

Fuente. (Fogler, H. S., 1992)

Bibliografía
Belmonte, M. I. (04 de 11 de 2016). Tecnicas Instrumentales . Obtenido de
http://laboratorio.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc
Fogler, H. S. (1992). Elements of Chemical Reaction Engineering. Prentice-Hall
International.
Harris, D. (2003). Análisis químico cuantitativo: Cromatografía . Barcelona : Reverte,
S.A.
Miranda, A. (23 de 02 de 2012). Cromatografia liquida HPLC. Obtenido de
https://www.ucm.es/data/cont/docs/650--gas20C3ADquidos.pdf
Sierra, I., Gómez, S., Pérez, D., & Morante, S. (2010). Análisis instrumental : algunas
herramientas de enseñanza-aprendizaje. La Coruña: Netbiblo.
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ANEXOS

Anexo 1. Fotografía de la formulación

química utilizada para el análisis
Anexo 2. Fotografía de las soluciones
preparadas de la muestra.