www.nature.

com/scientificreports

BUKA
Penyembuhan Membran janin preterm
pecah
Haruta Mogami 1, Annavarapu Hari Kishore 1, Yucel Akgul 2 & R. Ann Word 1

Diterima: 13 Juni 2017 Diterima: 20
September 2017 Diterbitkan: xx xx
xxxx
Ketuban pecah prematur membran (pPROM) dikaitkan dengan 30-40% dari kelahiran prematur. Infeksi dianggap sebagai penyebab
utama pPROM karena peningkatan kadar sitokin proinflamasi dalam cairan ketuban. Hanya 30%, bagaimanapun, positif untuk
organisme mikroba oleh budaya cairan ketuban. Menariknya, pada beberapa kehamilan yang dipersulit oleh ketuban pecah prematur
dini (pPROM), membran-membran sembuh secara spontan dan kehamilan berlanjut sampai term. Di sini, kami menyelidiki

mekanisme penyembuhan amnion. Menggunakan model tikus praklinis, kami menemukan bahwa ruptur kecil dari
ketuban ditutup dalam waktu 72 jam sedangkan penyembuhan pecah besar hanya 40%. pecah kecil diinduksi peningkatan
regulasi sementara sitokin sedangkan pecah besar menimbulkan peningkatan regulasi berkelanjutan sitokin proinflamasi
dalam membran janin. makrofag janin dari cairan ketuban direkrut untuk amnion terluka di mana molekul adhesi makrofag
yang sangat disajikan. makrofag direkrut dirilis dalam jumlah terbatas dan baik-lokal dari IL-1 β dan TNF yang difasilitasi

epitel-mesenchymal transisi (EMT) dan migrasi sel epitel. arg1 + makrofag didominasi
dalam waktu 24 jam. Migrasi dan penyembuhan kompartemen amnion mesenchymal, bagaimanapun, tetap dikompromikan. Temuan ini
memberikan wawasan baru mengenai mekanisme penyembuhan yang unik dari amnion.

persalinan prematur merupakan penyebab utama morbiditas dan mortalitas perinatal 1 . Ketuban pecah dini membran (PPROM) didefinisikan
sebagai pecahnya membran terjadi sebelum 37 minggu kehamilan, yang asso- diasosiasikan dengan 30-40% dari kelahiran prematur dan terjadi
pada sekitar 1-3% dari seluruh kehamilan 2 . budaya cairan ketuban menunjukkan bahwa 30% dari PPROM yang positif bagi organisme mikroba 3 . Infeksi
yang berhubungan dengan PPROM memerlukan intervensi segera (delivery) karena takut infeksi ke janin seperti sindrom inflamasi janin, yang
merupakan risiko morbiditas neonatal berat dengan sindrom pernafasan distress, sepsis neonatal, pneumonia, penyakit paru-paru kronis,
necrotizing enterocolitis, perdarahan intraventrikular, dan cerebral palsy 4 . serta komplikasi maternal seperti sepsis. Di sisi lain, mayoritas kasus
pPROM tidak terkait dengan infeksi tetapi mungkin terkait dengan merokok, indeks massa tubuh rendah, stres ibu, dan perdarahan intrauterus.
Selain itu, pPROM iatrogenik disebabkan oleh amniosentesis atau fetoskopi, dan ketuban pecah secara tidak disengaja selama operasi seperti
cerclage serviks. Secara umum dianggap bahwa pecahnya membran adalah kejadian yang tidak dapat diubah karena kebanyakan wanita dengan
pPROM mulai bekerja secara spontan dalam beberapa hari. Namun, sebagian kecil tetap tidak terkirim 2

dengan penyekatan membran secara spontan 5 . Mekanisme yang mempromosikan penyembuhan membran janin tidak diketahui.

Makrofag memainkan peran penting dalam penyembuhan luka 6 , 7 . Makrofag fagositosis organisme patologis dan puing-puing matriks,
menghilangkan jaringan nekrotik. Makrofag juga melepaskan berbagai faktor pertumbuhan dan sitokin di lokasi luka, menyusun kembali lokasi
luka dengan membentuk pembuluh darah baru dan mengatur perekrutan fibroblast. Meskipun gradasi terjadi dalam klasifikasi makrofag, pada
umumnya makrofag berdiferensiasi menjadi dua fenotip: Interferon klasik. γ ( IFN- γ) - makrofag yang diaktifkan (makrofag M1) oleh T helper 1
(Th1) -jenis respon memainkan peran kekebalan seluler terhadap infeksi sedangkan makrofag yang diaktifkan alternatif (makronom M2) yang
diaktifkan oleh sitokin tipe Th2 IL-4 dan IL-13 adalah penting dalam reaksi alergi, infeksi parasit, toleransi janin, dan perbaikan jaringan 8 , 9 . Makrofag
M2 menunjukkan aktivitas anti-inflamasi yang kuat dan melayani peran penting dalam penyembuhan luka. Selanjutnya, makrofag seperti M2
bertentangan dengan respon M1-makrofag proinflamasi 10 .

Selaput fetus terdiri dari amnion, chorion, dan desidua. Amnion adalah struktur pembebanan utama dari membran janin 1 dan
terdiri dari dua tipe sel: sel epitel superfisial dan sel mesenkhimal yang mendasari. Interstitial collagens (tipe I, III, dan V)
diproduksi oleh sel amnion mesenchymal untuk dipertahankan

1 Pusat Cecil H. dan Ida Green untuk Ilmu Biologi Reproduksi, Departemen Obstetri dan Ginekologi, Pusat Kedokteran Universitas Texas
Barat Daya, Dallas, Texas, AS. 2 Departemen Bedah Plastik, Universitas Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, AS.
Korespondensi dan permintaan untuk materi harus ditujukan kepada RAW (email: ruth.word@utsouthwestern.edu )

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 1

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 1. model tikus membran pecah steril dengan 26 gauge (ø 0,47 mm) jarum. Kebocoran cairan ketuban setelah tusukan melalui membran
janin ( SEBUAH) dan ke dalam vagina melalui leher rahim ( B). (C) Pecah janin membran 24 jam setelah pecah dengan jarum 20 ga. Miometrium
telah dihapus untuk memvisualisasikan cacat membran. Perhatikan bahwa tepi amnion pecah ternoda dengan tinta hitam. ( D) Skema panel C
menggambarkan cacat choriodecidual dan amnion. ( E) Benar-benar sembuh amnion dan choriodecidua 72 jam setelah pecah dengan jarum 26
ga.

integritas mekanis dari amnion. Terlindungi di dalam membran janin yang tahan lama ini, cairan ketuban berfungsi sebagai peran pertahanan sebagai
sistem kekebalan tubuh bawaan 11 , dan reservoir untuk makrofag janin 12 . Makrofag ibu diperkaya dengan desidua yang diturunkan ibu 13 .

Di sini kita menyelidiki mekanisme penyembuhan luka menggunakan pecahnya steril dari selaput janin dalam model pra klinis
tikus (kecil dan pecah besar). Sedangkan pecah kecil dari amnion ditutup oleh 72 h,> 50% dari pecah besar tetap terbuka. Makrofag
dari cairan ketuban direkrut untuk amnion terluka di mana molekul adhesi makrofag yang sangat disajikan. Awalnya, direkrut
makrofag dirilis dalam jumlah terbatas dan baik-lokal dari IL-1 β dan TNF. Sitokin proinflamasi difasilitasi epitel-mesenchymal transisi
(EMT) di sel epitel amnion manusia, dan EMT juga diamati dalam penyembuhan amnion tikus. makrofag arg1-positif dominan dalam
waktu 24 jam. Menggunakan mouse janin Model pecah membran ini, kami menyimpulkan bahwa selaput janin sembuh dengan
mekanisme yang unik dengan kompromi amnion migrasi sel mesenchymal di pecah besar.

hasil
model tikus praklinis membran pecah steril. Sebuah model tikus pecah steril dari selaput janin yang dihasilkan
menggunakan tusukan dari membran amnion dengan 26 atau 20 jarum G (diameter luar
0,47 atau 0,91 mm) pada 15 hari embrio (ED). Dengan tusukan, cairan ketuban bocor melalui miometrium (Gbr.  1A ) Dan dalam vagina melalui leher
rahim (Gbr.  1B ). Setelah penghapusan miometrium, tepi pecah dari choriodecidua adalah mudah terlihat (Gambar.  1C, D ), Dan sumbu panjang
pecah diukur. Tepi amnion biasanya diwarnai dengan tinta hitam (Gambar.  1C ) Sehingga dibedakan dari choriodecidua. sumbu panjang amnion
pecah juga itu dapat mengukur ured (Gambar.  1D ). Untuk kasus di mana pecahnya amnion tidak jelas, choriodecidua dengan lembut meluncur
dengan kapas untuk memperjelas tepi amnion pecah. Jika amnion telah sembuh sepenuhnya, noda amnion tampak seperti titik (Gbr.  1E ). Dua jam
setelah pecah, perforasi yang makroskopik terlihat (Gambar.  2A , 2 h). Pada 24 jam, hampir setengah dari cedera masih terlihat, tapi diameter
perforasi menurun secara signifikan. Ruptur ditutup setelah 48 dan 72 jam (Gambar.  2A ). analisis histologis situs pecah di penampang melintang
mengungkapkan bahwa struktur membran terputus 2 jam setelah pecah (Gambar.  2B , 2 h). Setelah 24 jam, ketebalan amnion meningkat di tepi
cedera (Gambar.  2B , 24 h). Dalam model kami, 26 perforasi G-diinduksi dari amnion yang hampir ditutup oleh monolayer sel epitel yang meliputi sel
mesenchymal stratified dalam waktu 48-72 jam (Gambar.  2B , 24-72 h).

pemindaian mikroskop elektron (SEM) digunakan untuk memperjelas ultrastruktur penyembuhan membran janin. Gambar diambil dari dalam kantung
kehamilan, sehingga gambar mencerminkan permukaan dalam amnion yang melapisi kantung kehamilan. Menariknya, runtuh perforasi dengan tepi
pembedahan-tepat yang mudah diamati 2 jam setelah pecah (Gambar.  2C , 2 h). Pada 24 jam, migrasi sel amnion dan deposisi matriks tercatat di situs
pecah, Star Excursion Balance Test Ating struktur plug atau flap-seperti (Gambar.  2C , 24 h). Pada 48 dan 72 jam, situs pecah ditutup dengan penebalan
dan menggembung, mungkin mencerminkan migrasi sel mesenchymal dan deposisi matriks seperti yang terlihat dengan mikroskop cahaya

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 2

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 2. model tikus praklinis membran pecah steril. ( SEBUAH - F) Tentu saja waktu penyembuhan amnion. ( SEBUAH) gambar
makroskopik membran janin pecah dengan 26 G jarum. Situs pecah ternoda dengan India tinta menghasilkan pewarnaan hitam di pusat
lingkaran diuraikan dalam kuning. ( B) Hematoxylin-Eosin (H & E) pewarnaan membran janin pecah oleh 26 G jarum (x 400). Seluruh
kantung kehamilan termasuk miometrium, membran janin, dan janin tetap dan syectioned di lokasi cedera. Saya, amnion; cho, chorion; Desember,

desidua; CD, choriodecidua; Myo, miometrium. panah merah menunjukkan situs cacat amnion dan panah hitam menunjukkan situs sembuh. Perhatikan
bahwa situs yang pecah bernoda hitam India Ink. Bar, 50 μ m. ( C) Gambar scanning electron microscopy (SEM). Setelah menghilangkan janin dan
plasenta, gambar membran janin ditangkap dari dalam kantung kehamilan. Oleh karena itu, permukaan yang ditunjukkan di sini adalah lapisan epitel
amnion. Bar, 20 µ m. ( D - E) Membran pecah steril dengan jarum 20 gauge (ø 0,91 mm). ( D) Gambar makroskopis dari membran janin yang pecah pada
waktu yang ditunjukkan setelah 20 G pecah. Garis putus-putus kuning mengelilingi situs-situs yang pecah bernoda India Tinta hitam. Garis putus-putus
kuning melingkari luka tusukan terbuka (tidak disembuhkan) sedangkan panah

Ilmiah laporan | 7: 13.139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 3

www.nature.com/scientificreports/

(Ara.  2C , 48 jam dan 72 jam). Selain itu, situs yang pecah tampaknya ditutupi oleh sel epitel amnion (Gambar.  2C , 48 jam dan 72 jam, gambar
beresolusi tinggi ditunjukkan pada Gbr.  S1A , B ).
Berikutnya, kami membandingkan penutupan lengkap cepat dari 26 tusukan G dengan besar 20 pecah G (diameter luar,
0.91 mm). Berbeda dengan hampir 100% penyembuhan pecah kecil, hampir setengah dari 20 situs pecahnya G tetap terbuka bahkan
setelah 72 jam (Gambar.  2D ). analisis histologis dari situs pecahnya mengungkapkan akumulasi amnion mesen- chymal sel (Gambar.  2E ,
48 jam dan 72 jam). SEM gambar dari model pecah besar yang tidak mungkin karena kepatuhan dari membran pecah ke janin dari
kehilangan berat cairan ketuban. Dengan demikian, setelah fiksasi, membran itu rapuh dan hancur selama penghapusan janin dari
kantung kehamilan.
dengan membran Untuk mempelajari
nonruptured dinamika
utuh. Bar, 100 μ m. penyembuhan dari 20 situs pecah G, studi imunofluoresensi dilakukan dengan spidol
epitel dan mesenkim. Dalam membran janin utuh, epitel penanda sel E-cadherin itu didominasi lokal di persimpangan-sel sel sel epitel
amnion dan korion (Gambar.  2F ). Pewarnaan itu sangat lokal dan diselenggarakan secara berkala antara sel-sel epitel pipih. amnion sel
mesenchymal vimentin-positif diterjemahkan ke 1-2 lapisan sel di bawah lapisan epitel (Gambar.  2F , Utuh), dan fibroblas di korion juga
vimentin-positif (Gambar.  2F , Utuh). Dalam epitel terluka, E-cadherin pewarnaan terlokalisasi difus di seluruh membran sel dalam waktu
24 jamdi(Gambar. 
(hijau) 2F , Pecah).
utuh (non-pecah) Sel-sel mesenchymal
dan penyembuhan amnion
pecah selaput 24 jamvimentin-positif yang menonjol
setelah 20 G tusukan. di situs pecah
Catatan kedekatan amnionsehingga tepi janin
menebal kulit menebal
dibandingkan
penyembuhan amnion (Gambar.  2F , Pecah).

Untuk menentukan apakah tepi ini menebal penyembuhan amnion adalah karena proliferasi, Ki67 Imunostaining colocalized dengan HSP70
untuk memastikan lokalisasi yang benar dari cedera situs (Gambar.  2G ). Dalam membran non-pecah, HSP70 adalah belang-belang dan jarang
amnion 24 jam setelah 20 G pecah ( Pecah). Amnion dilingkari oleh garis dasbor putih. Bar, 50 μ m. ( G) Immunolocalization dari HSP70 (merah) dan Ki67
didistribusikan. Dalam membran pecah setelah 24 jam, HSP70 lebih intens dan didistribusikan secara luas di seluruh amnion menebal yang lebih
dekat ke kulit janin karena kehilangan cairan ketuban (Gambar.  2F ). Menariknya, Ki67 tidak meningkat dalam amnion relatif cedera membran utuh
dan kurang dari pewarnaan Ki67 kuat diamati pada berkembang biak kulit janin (Gbr.  2G ).

Diameter rata-rata pecah kecil adalah 0,12 mm pada 24 jam dan 0,03 mm pada 72 h sedangkan di pecah besar, diameter 1,25 mm pada 24 jam
pewarnaan untuk vimentin (hijau), E-cadherin (merah), dan DAPI (biru) dari membran janin dari situs utuh di d15 embrio ( Utuh) atau tepi penyembuhan
(meningkat dibandingkan signifikan dengan pecah kecil di 24 h) menurun menjadi 0,82 mm pada 72 h ( P < 0,01 dibandingkan dengan pecah kecil di 72 h)
(Gambar.  3A ). Dalam model pecah kecil, rata-rata clo- yakin lengkap amnion adalah 83% pada 24 jam dan 98% pada 72 jam (Gambar.  3B ). Dalam model
pecah besar, namun, tingkat penutupan hanya 7% pada 24 jam dan 48% pada 72 jam (Gambar.  3B ). Dalam choriodecidua, diameter rata-rata pecah kecil
0,31 mm pada 24 jam dan 0,24 mm pada 72 h (statistik tidak signifikan), sedangkan di pecah besar, penyembuhan sangat tertunda:

menunjukkan
1,38 situs
mm pada 24 jampenyembuhan tertutup.dengan
( P < 0,01 dibandingkan ( E) Pewarnaan
pecah kecil)Hdan
& E1,29
darimm
membran
pada 72janin
jam (setelah
P < 0,0120 G pecah pada
dibandingkan saat
dengan ditunjukkan.
ruptur Bar, 50
kecil, Gambar.  μ m.
S2A ( F) Imunofluoresensi
). Penutupan
choriodecidua terganggu secara signifikan relatif terhadap amnion dengan 61% dan 78% pada 24 dan 72 jam, masing-masing dalam model ruptur kecil (Gambar.  S2B ).
Pada model ruptur besar, choriodecidua tidak sembuh pada 24 jam (tidak ada penutupan) dan hanya 16% pada 72 jam (Gambar.  S2B ).

Pada saat tusukan, sejumlah besar cairan amnion bocor dari kantung kehamilan dengan peningkatan kerugian pada model ruptur yang besar
(Gambar.  3C ).
angiogenesis, ituMenariknya, meskipun
adalah sonable Reasonluka tusukan
bahwa tertutup
mereka pada kelompok
tidak diatur kecilavaskular.
dalam amnion yang pecah, volume
bahkan cairan
TGF- amnion
β 2 tidak tidak pulih
merangsang pada 48
migrasi baikdan 72
jam. Meskipun penurunan signifikan dalam cairan ketuban, tingkat kelangsungan hidup janin intrauterin tidak menurun setelah pecah kecil (> 86%)
tetapi agak terganggu oleh pecah besar pada 72 jam (dari 100 hingga 82%, P <0,05, χ 2). Peningkatan kehilangan janin ini tampaknya menjadi
prolaps tali pusat melalui situs yang pecah. Mayoritas janin tampak sehat dengan pertumbuhan janin normal meskipun oligohidramnion (berat
janin: 1,06 g dalam keadaan utuh, 1,00 g dalam ø 0,47 mm, dan 1,01 g dalam ø 0,91 mm, n = 4-6 dalam setiap kelompok). Selanjutnya, penanda
diferensiasi epitel paru alveolar serupa pada paru janin dari membran utuh dan pecah pada d18.5 (Tabel Tambahan  2 ).
(dengan pengecualian sedikit peningkatan Tgfb2 setelah pecah besar) (Gambar.  S3 ). Karena faktor pertumbuhan ini sebagian besar terlibat dalam

Profil ekspresi gen yang unik dari penyembuhan luka di amnion yang terluka. Secara klasik, penyembuhan luka dewasa terdiri dari
empat langkah: (1) hemostasis, (2) peradangan, (3) proliferasi dan (4) remodeling 6 , 7 , 14 .
pertumbuhan, Tgfb1 dan 3; faktor pertumbuhan endotel vaskular, Vegf; dan faktor pertumbuhan seperti insulin, Igf1 dan 2) tidak diinduksi oleh ruptur steril
Kapal yang cedera memainkan peran utama dalam proses ini dari proses awal pembentukan gumpalan, perekrutan sel kekebalan tubuh, dan pelepasan
faktor pertumbuhan dari neoangiogenesis. Sifat unik dari amnion avaskular yang terdiri dari sel-sel janin menunjukkan bahwa mekanisme penyembuhan
luka dasar harus berbeda dalam membran janin. Untuk menyelidiki mekanisme ini, profil ekspresi gen yang terkait dengan penyembuhan luka
dikuantifikasi dalam membran janin dengan atau tanpa cedera (Gambar.  4 ). Menggunakan selaput janin in vivo ( sampel yang meliputi amnion, chorion,
desidua, dan semua sel yang melekat pada membran), tingkat mRNA sitokin proinflamasi, interleukin-1 β ( Il1b), tumor necrosis factor
fetal, tingkat mRNA dari faktor pertumbuhan ini (faktor pertumbuhan epidermal, Egf; faktor pertumbuhan fibroblast dasar, Bfgf) atau Fgf2; mengubah faktor

( Tnf), dan Il6 meningkat dalam 2 jam setelah tusukan kecil, kembali ke tingkat normal 24 jam. Sebaliknya, setelah pecah besar, kadar relatif
tinggi Il1b, Tnf, dan Il6 mRNA bertahan hingga 72 jam. Menariknya, sitokin anti-inflamasi, Il10, juga sangat teregulasi dalam membran yang
pecah, terutama setelah ruptur besar (60 kali lipat dibandingkan dengan 8 kali lipat untuk Tnf, Ara.  4 ).

Faktor pertumbuhan memainkan peran penting dalam penyembuhan luka dari banyak jaringan dewasa. Namun, dalam penyembuhan membran

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 4

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 3. Penyembuhan tingkat dan perforasi diameter amnion setelah tusukan membran. ( SEBUAH) Diameter situs membran pecah di
amnion dengan 26 G (ø 0,47 mm) atau 20 G jarum (ø 0.91 mm) pada 24 dan 72 jam tusukan. Setiap simbol mewakili satu pecah. Biru bar
menunjukkan mean dan SEM. ** P < 0.01, ANOVA. ( B)
Persen penutupan lengkap amnion pecah pada 24 dan 72 h. Jumlah sepenuhnya ditutup pecah / total pecah ditampilkan sebagai bar. * P < 0,05, * P
< 0,01, χ 2. n = 41–64 tusukan dari 12-17 selaput janin dari 3–7 tikus hamil pada masing-masing kelompok. ( C) Volume cairan ketuban setelah pecah
dengan jarum 26 G (ø 0,47 mm) atau 20 G (ø 0,91 mm). ED, hari embrio. Nilai dibandingkan dengan volume kantung kehamilan utuh pada setiap
titik waktu. Bar kesalahan mewakili SEM. n = 6-20 kantung kehamilan dari 3–7 tikus hamil di masing-masing kelompok. * P < 0,05,

* * P < 0,01.

sel-sel epitel atau mesenkimal amnion (data tidak ditunjukkan). Secara keseluruhan, hasil menggambarkan bahwa amnion tidak sembuh dengan mekanisme yang
sama dari jaringan vaskularisasi lainnya.
Matriks kolagen dirombak dalam tahap penyembuhan luka selanjutnya. Oleh karena itu, pembentukan kolagen di situs penyembuhan dibandingkan
menggunakan pewarnaan trichrome pada 72 jam dan qPCR mRNA kolagen setelah 26 atau 20G pecah. Setelah 26 G pecah, serat kolagen yang tipis
membentuk jaringan pendukung longgar dari amnion yang disembuhkan (Gambar.  5A ) dan tingkat mRNA tipe 1, 3 dan 5 kolagen tidak meningkat
(Gambar.  5C ). Sebaliknya, deposisi kolagen padat dengan deposit besar di penampakan penyembuhan menebal setelah 20 G pecah (Gambar.  5B ).
Selanjutnya, mRNA kolagen tipe 1 dan 3 meningkat pada 72 jam (Gbr.  5C ). MMP9 mRNA juga diregulasi dari 24 jam dalam pecahnya besar (Gambar.  5C ).
Secara kolektif, aktif sintesis kolagen dan matriks renovasi terjadi di membran penyembuhan setelah ture rup- besar. Kurangnya meningkat Ki67 di lokasi
luka, bersama-sama dengan sel vimentin-positif dalam tepi menebal, menunjukkan bahwa penyembuhan luka adalah karena migrasi, EMT, dan deposisi
matriks.

Rekrutmen makrofag cairan ketuban di amnion pecah. imunitas bawaan membantu luka
penyembuhan, dan makrofag memainkan peran sentral 10 . Untuk menyelidiki keterlibatan makrofag dalam penyembuhan dari membran janin pecah,
immunostaining dari makrofag dilakukan di lokasi penyembuhan baik kecil (Gambar.  S4B, saya ) Dan besar pecah amnion 24 jam setelah cedera
(Gambar  6B dan S4i ). Dua penanda makrofag (F4 / 80 dan CD68) yang digunakan menunjukkan hasil yang sama mengenai jumlah makrofag dan
lokasi. Makrofag yang hampir tidak ada di amnion utuh sebelum pecah (Gambar  6A . S4A . saya ). Sebaliknya, makrofag terlokalisasi pada amnion
24 jam setelah cedera (Gambar  6B dan S4B ) Dengan makrofag langka di korion dan desidua (Gambar.  6C ). Sebaliknya

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 5

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 4. Pecah ketuban janin mengubah ekspresi gen inflamasi in vivo. Ekspresi dari Il1b, TNF, IL6, dan Il10 di utuh atau pecah (ø 0,47
mm: 26 G jarum dengan 8 tusukan / kantung, dan ø 0,91 mm: 20 G jarum dengan 4 tusukan / kantung) membran janin. mRNA ekspresi
relatif dari setiap gen dinormalisasi dengan yang β 2
microglobulin dibandingkan dengan tingkat membran utuh pada 2 h. Untuk analisis statistik, ekspresi gen pada membran pecah dibandingkan
dengan yang dari membran utuh pada setiap titik waktu. Kesalahan bar mewakili SEM. n = 5-6 selaput janin dari 5-6 tikus hamil di masing-masing
kelompok. * P < 0,05, ** P < 0.01.

dengan jaringan lain di mana neutrofil direkrut pada fase awal penyembuhan luka, neutrofil jarang terjadi pada penyembuhan amnion (Gambar.  S4C
, D ).
Selanjutnya, kami berusaha menentukan asal makrofag yang direkrut ke lokasi cedera. Makrofag yang melekat pada amnion yang pecah
sedini 2 jam (Gbr.  6D ), dan melekat kuat ke situs yang pecah dalam 24 jam (Gambar  6E - F
dan 7C ), dengan beberapa dimasukkan dalam amnion (Gambar  6B , 7 dan S4 ). Hebatnya, perlekatan makrofag terbatas pada sisi janin (Gambar.  6D
– F ). Pada membran janin yang berasal dari janin laki-laki, makrofag yang dimasukkan dalam amnion penyembuhan adalah Y-kromosom positif
menggunakan fluoresen in situ hibridisasi (IKAN, Gbr.  6G ), mengkonfirmasi bahwa makrofag ini berasal dari janin. Sebaliknya, makrofag di
miometrium adalah kromosom Y negatif (asal maternal, Gambar.  6 jam ).

Molekul adhesi (misalnya, molekul adhesi intraseluler 1 (ICAM1), molekul adhesi sel vaskular 1 (VCAM1), E- dan P-selectin)
diekspresikan pada permukaan tempat yang meradang di mana makrofag menempel 15 .
Meskipun immunostaining VCAM1 dan P-selectin tidak ada dalam amnion utuh (Gambar.  S5B, E ), keduanya di-lokalisasi ke situs-situs cedera amnion di
kedua kecil (Gambar.  S5A, D ) dan besar (Gbr.  6I, J ) situs yang rusak. Makrofag melekat pada P-selectin-expressing amnion dalam 24 jam (Gbr.  6J , panah).
Demikian juga, mRNA VCAM1 dan P-selectin meningkat sedini 2 jam setelah ruptur kecil dan besar (Gambar  6K – L dan S5C, F ). Secara keseluruhan, data
menunjukkan bahwa sel-sel epitel yang cedera mengekspresikan molekul adhesi sebagai respons terhadap cedera yang mungkin melekat pada makrofag
amniotik yang direkrut untuk penyembuhan. Mirip dengan pola ekspresi sitokin (Gbr.  4 ), peningkatan level VCAM1 dan P-selectin

mRNA bertahan setelah 20 G pecah (Gbr.  6K, L ), menyarankan perekrutan makrofag terus sampai penyembuhan amnion selesai. E-selectin mRNA
juga meningkat pada membran janin yang pecah pada 2 jam tetapi ICAM1 ekspresi gen tidak diatur (data tidak ditampilkan).

Berikutnya, spidol perwakilan dari makrofag M1-fenotipe (NO synthase-2, NOS2) dan M2 makrofag (arginase 1, arg1) digunakan untuk
mengkarakterisasi fenotip dari makrofag dalam amnion terluka 8 . Dalam situs penyembuhan, makrofag ini adalah NOS2-negatif (Gambar.  7A ),
Meskipun miometrium bernoda positif dengan NOS2 (Gambar.  S4G ). Sebaliknya, ARG1-positif M2-makrofag yang diamati pada situs
penyembuhan amnion (Gambar.  7B, C ). Sehingga makrofag di amnion pecah adalah M2 dominan, luka penyembuhan fenotipe, meskipun
fenotip dapat dicampur dalam fase awal dimana sitokin proinflamasi yang terlokalisasi cedera. Tanpa diduga, kami juga menemukan
pewarnaan yang kuat dari ARG1 di sel epitel amnion (Gambar.  7B, C ). Dalam amnion utuh, TNF dan IL-1 β tidak diamati (Gambar.  7D, G ).
Dalam situs pecah, TNF dinyatakan dalam mac

rophages dan sel epitel amnion (Gambar.  7E ). Demikian pula, IL-1 β dinyatakan dalam makrofag (Gambar  7H, saya dan S7F ). IL-1 β juga
dinyatakan dalam desidua utuh (Gbr.  7G ). Hebatnya, sekresi sitokin ini terlokalisasi ke situs pecah amnion. Menariknya, jumlah makrofag
CD68-positif per volume cairan amnion meningkat secara signifikan dengan ruptur membran dalam waktu 6 jam (Gambar.  7J ). Pada 24-72 jam,
meningkat kepadatan makrofag dalam cairan ketuban cenderung untuk kembali ke tingkat basal, menunjukkan bahwa cairan ketuban
floating-makrofag melampirkan dan dimasukkan ke dalam amnion terluka dalam waktu 24 jam. Bersama-sama, pelepasan sitokin sangat
lokal-terwujud di lokasi penyembuhan amnion oleh makrofag dan sel epitel responsif.

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 6

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 5. Deposisi kolagen pada membran janin setelah ruptur kecil atau besar. Trichrome pewarnaan membran janin pecah 72 jam setelah tusukan
dengan 26 G ( SEBUAH) atau 20 G ( B) jarum. Amnion ditandai dengan garis putus-putus berwarna hijau. Bar, 50 µ m. (C) Ekspresi dari Col1a1, Col3a1,
Col5a1, Mmp2, dan Mmp9 di utuh atau pecah (ø 0,47 mm: jarum 26 G dengan 8 tusukan / kantung, dan Ø 0,91 mm: jarum 20G dengan 4 tusukan /
kantung) selaput janin. Ungkapan mRNA relatif dari setiap gen dinormalisasi dengan yang ada β 2 mikroglobulin dibandingkan dengan tingkat membran
utuh pada 2 jam. Untuk analisis statistik, ekspresi gen dalam membran pecah dibandingkan dengan membran utuh pada setiap titik waktu. Bar
kesalahan mewakili SEM. n = 5–6 selaput janin dari 5–6 tikus hamil di masing-masing kelompok. * P < 0,05, ** P < 0,01.

Epitel-mesenchymal transisi (EMT) oleh IL-1 β dan TNF. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) adalah proses biologis yang
mengubah fenotipe sel epitel ke fenotip sel mesenkim. Karena EMT sangat meningkatkan migrasi seluler dan perbaikan jaringan, kami
menyelidiki kemungkinan bahwa EMT dapat berpartisipasi dalam penyembuhan amnion yang terluka. Vimenin-positif atau
E-cadherin-vimentin sel-sel positif ganda yang tersebar di lapisan sel epitel amnion yang terluka dalam 6 jam (Gambar  8A dan S6F ).
Sel-sel vimentin-positif ini juga diamati pada 24 jam (Gambar  8B, C dan S6F ). Temuan bahwa lapisan epitel jelas dipisahkan dari
akumulasi lapisan sel mesenchymal di tempat penyembuhan amnion menunjukkan kemungkinan EMT. in vivo.

Sitokin proinflamasi memiliki potensi untuk menginduksi EMT dalam penyembuhan kulit 16 . Jadi, kami menguji apakah IL-1 β
atau TNF menginduksi EMT di sel-sel epitel manusia amnion primer. Dalam penyembuhan luka tes awal dari sel-sel epigen amnion,
migrasi meningkat tergantung dosis oleh IL-1 β atau TNF (Gbr.  8D, E ). Sebaliknya, IL-1 β atau TNF tidak merangsang migrasi sel
mesenkimal (Gbr.  8E ). Penutupan awal dianggap dirangsang oleh migrasi, bukan proliferasi, sel epitel, karena IL-1 β atau TNF tidak
mengubah jumlah sel yang layak dalam uji proliferasi sel epitel amnion (data tidak ditampilkan). Selain itu, IL-6 tidak menstimulasi
migrasi sel epitel atau mesenkimal amnion (data tidak ditampilkan). Di daerah tergores, IL-1 β atau TNF mengubah morfologi sel epitel
amnion menjadi sel-sel berbentuk spindle (Gbr.  8D , panah hijau di kolom kedua). Immunofluorescence mengungkapkan bahwa sel-sel
berbentuk spindle ini vimentin-positif (Gambar.  8D , Kolom ke-3), menyarankan EMT, dan sel-sel vimentin-positif juga tersebar di daerah
yang tidak terluka (Gbr.  8D , Kolom ke-3). Sel positif Vimenin tidak diamati dalam sel kontrol tanpa cedera. IL-1 β dan TNF juga
mengubah morfologi sel epitel menjadi berbentuk gelendong (Gambar.  8D , Kolom ke-2). Sebagian besar sel-sel ini mempertahankan
fenotipe epi- thial (yaitu, E-cadherin positif dan vimentin-negatif) (Gambar.  8D , Kolom ke 3 dan 4) meskipun

Ilmiah laporan | 7: 13.139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 7

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 6. Makrofag dan molekul adhesi di tempat pecah. ( SEBUAH - C) Imunostaining untuk F4 / 80 (hijau) dan DAPI (biru) dari membran 24 jam
setelah pecah dengan jarum 20 G. Garis putus-putus menunjukkan amnion ( Saya, putih), permukaan kulit janin (kuning), chorion ( Cho, biru muda),
dan desidua ( Des, ungu). Myo, miometrium. ( SEBUAH) Membran janin utuh. ( B) Makrofag dalam penyembuhan amnion (panah). ( C) Ruptur tepi
chorio-desidua. Bar, 50 µ m. ( D - F) Pewarnaan H & E dari membran yang pecah. ( D) Makrofag cairan ketuban (kepala panah) menempel amnion
pecah pada 2 jam (panah). ( E dan tampilan yang diperbesar di F) Makrofag cairan amnion (hijau) menempel pada permukaan amnion pada 24 jam,
dan sel mesenchymal bermigrasi (kepala panah). Catatan perubahan bentuk mesenchymal dari sel epitel di F. Bar, 50 µ m. ( G dan H) Berpendar in situ hibridisasi
(IKAN) dari kromosom Y (merah) dan immunostaining untuk F4 / 80 (hijau) pada penyembuhan amnion ( G) dan miometrium utuh ( H) pada 48 jam.
Bar, 10 µ m. ( saya - L) Molekul adhesi makrofag di tempat yang pecah. Immunostaining untuk F4 / 80 (hijau), VCAM1 ( SAYA)

atau P-selectin ( J, merah) dan DAPI (biru) pada amnion yang pecah pada 24 jam setelah ruptur dengan jarum 20 G. Bar, 50 µ m. ( K
dan L) Ekspresi gen VCAM1 ( K) atau P-selectin ( L) membran janin utuh atau pecah dengan jarum 20 G pada waktu yang ditentukan. Bar kesalahan
mewakili SEM. n = 5–6 selaput janin dari 5–6 tikus hamil di masing-masing kelompok.
* P < 0,05, ** P < 0,01.

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 8

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 7. Sekresi sitokin lokal dari makrofag M-2. ( SEBUAH - C) Pewarnaan imunofluoresensi membran janin untuk F4 / 80 (hijau) atau CD68 (hijau),
NO synthase-2 (NOS2, merah pada SEBUAH), arginase-1 (Arg1, merah masuk B) dan DAPI (biru) pada 24 jam pecah dengan jarum 20 G (ø 0,91 mm).
Garis putus-putus menunjukkan amnion (putih), permukaan kulit janin (kuning), chorion (biru muda), dan desidua (ungu). Perhatikan bahwa Arg1
diekspresikan baik dalam makrofag ( B dan C, arrowhead) dan sel-sel epitel amnion ( B dan C, panah). Angka  7C lokasi yang sama dengan Gambar.  6E
dan F . Bar, 50 µ m. ( D - SAYA) Pewarnaan imunofluoresensi membran janin untuk F4 / 80 (hijau), TNF (merah in D - F), IL-1 β ( merah G - SAYA) dan DAPI
(biru) dengan jarum 20 G (ø 0,91 mm). ( E dan F) TNF di tempat penyembuhan amnion di makrofag (kepala panah) dan sel epitel amnion (panah) pada
6 jam setelah ruptur. ( D) Membran janin utuh pada 6 jam. ( H dan SAYA) IL-1 β di penyembuhan amnion di makrofag (panah) pada 24 jam setelah pecah.
( G) Membran janin utuh pada 24 jam. Bar, 50 µ m. ( J) Kuantifikasi sel CD68-positif dalam cairan ketuban setiap kantung kehamilan. Bilah biru
menunjukkan mean dan SEM. n = 4-9 dari 2-5 tikus hamil di masing-masing kelompok. ** P < 0,01, ANOVA.

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 9

www.nature.com/scientificreports/

Angka 8. Epitel-mesenchymal transisi (EMT) di PPROM mouse dan sel epitel amnion manusia. ( SEBUAH - C) Immunostaining untuk vimentin (hijau),
E-cadherin (merah) dan DAPI (biru) di situs amnion yang pecah oleh jarum 20 G (ø 0,91 mm). Amnion pecah setelah 6 jam ( SEBUAH, 26 G) dan 24
jam ( B dan C, 20 G). ( C) adalah gambar yang diperbesar ( B). Perhatikan bahwa sel-sel vimentin-positif diamati pada lapisan epitel amnion (panah).
Bar, 20 µ m. ( D dan E) Penyembuhan luka uji awal dari sel epitel amnion manusia primer. Sel diobati dengan kontrol kendaraan, IL-1 β ( 1 ng / ml) atau
TNF (10 ng / ml) setelah menggaruk. Tahap kontras atau gambar immunostaining dengan vimentin (hijau), E-cadherin (merah), atau DAPI (biru)
diperoleh pada 0 atau 72 jam. Panah hijau menunjukkan sel-sel berbentuk mesenchymal-seperti di daerah luka sel epitel. Bar, 200 µ m. ( E) Penutupan
persen dari sel epitel amnion manusia dan mesenkimal tergores yang diperlakukan dengan dosis IL-1 yang berbeda β ( panel atas) atau TNF (panel
bawah). Baris kesalahan mewakili SD. n = 3 di setiap grup. * P < 0,05, ** P < 0,01, dibandingkan dengan kontrol (0 ng / ml) pada setiap titik waktu.

mengubah bentuk sel epitel. Perpanjangan budaya selama 5 hari mengakibatkan munculnya sel vimentin-positif di daerah tergores sel epitel amnion
primer manusia bahkan tanpa pengobatan sitokin (Gambar.  S6C ). ekspresi gen menunjukkan bahwa vimentin mRNA meningkat secara signifikan
dalam sel tergores dibandingkan dengan sel kontrol tanpa cedera, sedangkan E-cadherin mRNA tidak berubah (Gambar.  S6D ). Selain itu, budaya
dengan 10% FBS selama 8 hari secara dramatis meningkatkan EMT sel epitel amnion (Gambar.  S6A, B ). Sejak FBS mencakup berbagai sitokin dan
faktor pertumbuhan, kami menyarankan bahwa sel-sel amnion epitel mudah menjalani EMT setelah stimulasi dengan ini

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 10

www.nature.com/scientificreports/

faktor-faktor. Tingkat migrasi sel epitel lebih lambat daripada sel mesenkimal (Gbr.  S5E ). EMT dengan demikian akan meningkatkan laju
migrasi sel epitel sehingga mempercepat penutupan amnion yang pecah. Beberapa sel mesenchymal masif berkumpul di pusat
penyembuhan in vivo mungkin berasal dari sel-sel epitel amnion yang diinduksi oleh sitokin melalui EMT.

Diskusi
Di sini, kami menyelidiki mekanisme penyembuhan ruptur prematur prematur steril dari membran janin. Dengan menggunakan model
praklinis pPROM pada tikus dan sel amnion manusia primer dalam kultur, kami menunjukkan bahwa (i) ruptur amnion steril yang steril
pada hari embrio 15 sembuh secara spontan, (ii) penyembuhan ruptur amnion yang steril tidak lengkap dalam 72 jam, (Iii) makrofag janin
cairan ketuban arg1-positif direkrut ke lokasi cedera dan dimasukkan ke dalam amnion pada titik waktu kemudian, dan (iv) sitokin
proinflamasi, IL-1 β
dan TNF, disekresikan dari makrofag yang direkrut pada titik waktu awal, menstimulasi EMT sel epitel amnion.

Penyembuhan membran janin. Dalam model tusukan steril kami, kami menemukan bahwa pecahan kecil dari penis janin
brane pada pertengahan gestasi (ø 0,47 mm) sembuh dalam 3 hari. Mungkin, ini tidak mengejutkan dalam tusukan kecil dari membran janin oleh
amniosentesis pada manusia yang sembuh secara spontan 17 . Meskipun demikian, penyembuhan tusukan 0,47 mm pada tikus menggambarkan
bahwa (i) amnion menunjukkan potensi regeneratif yang mencolok. 18 , dan (ii) penyembuhan luka embrio cepat dan lengkap dibandingkan dengan
jaringan dewasa 7 , 19 . Selain itu, permukaan migrasi sel mesenchymal amnion ditutupi oleh monolayer sel epitel. Gambaran morfologi ini mirip dengan
laporan klasik ruptur steril dari membran janin tikus di tepi amnion yang menebal muncul sebagai tonjolan dengan ujung runcing pada 24 jam dan sel
mesenkim berbentuk spindel berserat ditutupi oleh satu lapisan sel epitel pipih 20 . Namun demikian, tingkat penyembuhan ukuran ruptur yang besar (ø
0,91 mm) hanya 40%. Ini kompatibel dengan temuan klinis di mana ukuran ruptur yang cukup besar yang disebabkan oleh fetoskopi tidak sembuh 21 . Meskipun
choriodecidua tidak berkontribusi pada kapasitas menahan beban dari selaput janin dan bukan fokus penyelidikan ini, penyembuhan choriodecidua
lambat dan tidak lengkap dibandingkan dengan amnion. Kami berspekulasi bahwa jaringan desidual asal ibu menunjukkan tingkat penyembuhan
yang lambat relatif terhadap sel-sel janin amnion. Selanjutnya, makrofag siap diamati setelah cedera pada amnion yang jarang setelah cedera
desidua, menunjukkan bahwa choriodecidua kurang dibantu oleh kekebalan bawaan penyembuhan luka.

Menariknya, volume cairan ketuban tidak pulih meskipun penutupan amnion. Selama kehamilan normal dalam mouse, cairan ketuban menurun
secara signifikan selama akhir kehamilan (dari ~ 120-55 μ l, Gambar.  3C ) Menunjukkan bahwa kegagalan untuk meningkatkan cairan ketuban setelah
pecah selaput di d15 hanya dapat mewakili saldo negatif normal akumulasi cairan pada saat ini dalam kehamilan. Hasil ini juga didukung oleh laporan
sebelumnya yang volume cairan ketuban menurun secara signifikan pada tikus dari ED 15 sampai ED 18, tidak seperti manusia 22 . indicat- ing bahwa
penyerapan cairan ketuban mengatasi sintesis menuju jangka. Selain itu, meskipun kita histologi dikonfirmasi penutupan amnion, penutupan
choriodecidua tidak lengkap pada 72 jam (Gambar.  S2 ). Ada kemungkinan bahwa kurangnya perbaikan ketuban penuh mengakibatkan kebocoran terus
menerus dari cairan ketuban. Salah satu risiko pecah berkepanjangan dari membran adalah kurangnya kematangan paru janin. Pemeriksaan janin paru
3 d setelah pecah, bagaimanapun, tidak mengungkapkan efek negatif dari oligohidramnion sederhana selama ini dalam kehamilan.

Berbagai bentuk bahan biologis telah digunakan untuk memperbaiki prematur membran pecah dini termasuk lem fibrin, trombosit
kaya plasma, cryoprecipitates, fibrinogen, trombin, polytetrafluoroethylene mate- rial, matrigel, dan spons gelatin 23 . Namun hasil uji coba
ini tidak selalu memuaskan atau tetap pada tingkat praklinis. Kami percaya bahwa model PPROM mouse kita akan berguna untuk
menyelidiki mekanisme-mekanisme dasar dan pengobatan PPROM.

infiltrasi makrofag. Kehadiran makrofag awal setelah cedera amnion itu menarik karena makrofag penduduk tidak diamati dalam
amnion utuh dan sifat avaskular dari amnion akan menghalangi makrofag berasal dari beredar monosit. Tiga potensi sumber makrofag
amnion dianggap: 1) desidua, 2) cairan ketuban, atau 3) diferensiasi sel-sel amnion induk penduduk. Penampilan makrofag pada lokasi
cedera sedini 2 jam dari pecahnya berbicara terhadap kemungkinan monosit asi diferensiasi yang memerlukan beberapa hari 24 . Demikian
juga, diferensiasi sel-sel induk penduduk tidak mungkin dalam waktu tersebut. Rekrutmen makrofag desidua menjadi amnion dianggap
karena desidua diperkaya dalam makrofag penduduk 13 Namun, makrofag tidak diamati di choriodecidua terluka. Selanjutnya, akumulasi
luka yang disebabkan dari makrofag amnion yang melekat pada sisi janin amnion (epitel) di mana molekul adhesi P-selectin dan
VCAM1 yang sangat diungkapkan tapi tidak lapisan sel mesenchymal yang berdekatan. Selanjutnya, sel-sel ini berada Y positif dalam
kasus janin laki-laki. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa cairan ketuban adalah asal makrofag amnion-penyembuhan. Konsep
“migrasi makrofag cairan ketuban” juga dilaporkan dalam situasi lain selama kehamilan 25 . 26 . Secara fisiologis, diketahui bahwa jumlah
makrofag cairan ketuban meningkatkan ke arah jangka pada tikus 27 . Dalam data kami, konsisten dengan laporan sebelumnya, jumlah
makrofag dalam cairan ketuban meningkat 6 h (ED 15) ke 72 h (ED18) (Gambar.  7J ). meningkat makrofag cairan ketuban ini dianggap
untuk menyusup miometrium dan mengaktifkan myocytes untuk memulai proses kelahiran 25 . 26 .

Selain makrofag, ARG1 juga diungkapkan dalam sel epitel amnion. Fenomena ini di mana ARG1 sangat disajikan dalam sel epitel
yang meradang telah dilaporkan dalam jaringan lain (misalnya, paru-paru sel epitel pasien asma 28 dan epidermis kulit pasien dengan
psoriasis 29 ). Sejak penghambatan aktivitas ARG1 penundaan penyembuhan kulit 30 . kita berpose bahwa arginase-1 tidak hanya penanda
makrofag M2 tetapi juga berperan dalam penyembuhan amnion.

Dalam proses penyembuhan luka, makrofag menfagositosis organisme dan puing-puing matriks, dan melepaskan berbagai faktor
pertumbuhan dan sitokin. Dalam studi ini, kami mengamati sekresi IL-1 β dan TNF dari makrofag yang dirangsang EMT sel epitel amnion.
EMT diamati selama embriogenesis, perkembangan organ, luka

Ilmiah RePoRT | 7: 13139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 11

www.nature.com/scientificreports/

penyembuhan, regenerasi jaringan, dan kanker dan metastasis nya 31 . kontak-sel sel yang penting dalam pemeliharaan fenotip epitel. Gangguan
kontak-sel sel memulai EMT melalui cadherin beralih 32 . yang mengakibatkan generasi sel mesenchymal berbentuk dalam model tikus dan sel-sel
amnion primer. Jadi, meskipun rophages mac dapat melayani peran positif dalam penyembuhan akut, berlebihan atau kronis penundaan
peradangan penyembuhan luka 33 .
Dalam model kami PPROM steril, peningkatan ekspresi sitokin anti-inflamasi IL-10 ditemani diperkuat ekspresi sitokin inflamasi. IL-10
menghambat produksi sitokin proinflamasi (misalnya, IL-1 α, IL-1 β, TNF, dan IL-6) dari makrofag diaktifkan 34 . Selanjutnya, pengobatan
luka kulit dengan IL-10 menetralkan hasil antibodi dalam berlebih dari kemokin dan sitokin dan produksi berlebihan dari
chemoattractants neutrofil 35 . Dalam model membran ini pecah, sekresi IL-1 β dan TNF baik-lokal dan terbatas, menunjukkan bahwa
mekanisme anti-inflamasi (misalnya, IL-10) erat mengatur respon inflamasi untuk mengoptimalkan penyembuhan luka amnion. Hal ini
juga harus ditekankan bahwa mekanisme yang unik menjadi sangat penting dalam jaringan yang tidak dapat bergantung pada
faktor-faktor pertumbuhan dan stimulan lainnya dari pembuluh darah.

mekanisme keseluruhan penyembuhan membran: kecil vs cedera besar. mouse model kami PPROM menunjukkan bahwa pecah kecil
menyembuhkan namun sebagian besar pecah besar tidak. Perbandingan antara dua model mengungkapkan mekanisme potensial untuk perbedaan
ini. Pertama, sitokin dan kemokin tanggapan bersifat sementara setelah pecah kecil, tapi lama setelah cedera yang lebih besar. Kedua, MMP9 ekspresi
gen diregulasi secara dramatis pada tahap selanjutnya penyembuhan luka di pecah besar tapi tidak kecil. Ketiga, sisa cairan ketuban hadir setelah
kecil, tapi tidak besar, pecah. cairan ketuban ini, meskipun mengalami penurunan relatif terhadap membran utuh, dapat berfungsi sebagai reservoir
untuk makrofag dan faktor penyembuhan lain atau protein yang mengikat mereka. Apapun, masalah utama dalam penyembuhan setelah pecah besar
tampaknya menjadi kurangnya migrasi sel mesenchymal dan deposisi matriks. Dalam kasus pecah kecil, EMT mungkin cukup untuk menjembatani
dukungan matriks dan kekuatan membran. Setelah pecah besar, namun, kemungkinan tidak cukup untuk perancah cacat mesenchymal besar,
terutama di hadapan aktivasi protease.

Ringkasan. Kesimpulannya, kami menganalisis secara rinci penyembuhan spontan amnion janin menggunakan praklinis
model ketuban pecah dini kecil dan besar dari membran. Kami menyimpulkan bahwa amnion memiliki potensi regeneratif tinggi melalui
mekanisme yang unik termasuk (i) rekrutmen makrofag janin dari cairan ketuban, dan (ii) IL-1 β- dan TNF-induced EMT dan migrasi sel
epitel amnion. Penyembuhan pecah besar dikompromikan mungkin karena cacat pada migrasi sel mesenchymal dan deposisi matriks.
Kami sarankan, karena itu, bahwa model merupakan langkah pertama yang menarik dalam memahami peran “peradangan steril” dan
penyembuhan amnion.

Bahan dan metode

Model praklinis membran pecah steril. Semua hewan ditangani dan eutanasia di Ance accord- dengan standar perawatan hewan manusiawi dijelaskan oleh
National Institutes of Health Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Laboratorium Hewan, menggunakan protokol disetujui oleh Komite Perawatan dan
Penggunaan Kelembagaan Animal (IACUC) dari university of Texas Southwestern Medical Center di Dallas. Pada 15 hari pasca coitum (DPC), tikus hamil C57 / BL6
dibius dengan isoflurane. Sebuah sayatan ventral dibuat dan uterus dan brane mem- janin ditusuk dengan jarum steril (26 atau 20 gauge). Dalam setiap uterus,
setengah dari kantung kehamilan yang tertusuk (kelompok pecah) dan setengah tidak (utuh control). Dalam kasus 20 G cedera, 4 tusukan dilakukan per kantung
sedangkan 8 tusukan per kantung dilakukan dengan 26 jarum G. Pecahnya membran dikonfirmasi oleh kebocoran cairan ketuban. Untuk menandai situs tusukan, jarum
yang direndam dalam 10% India Ink sebelum pungsi mengakibatkan pewarnaan hitam dari situs tusukan dengan kontak dari permukaan luar jarum. Setelah setiap
prosedur, perut ibu ditutup dengan 5-0 Polysorb. Pada saat pengambilan sampel, diameter pecah diukur dengan caliper digital di bawah mikroskop. Penutupan
didefinisikan sebagai lubang tak terlihat di bawah mikroskop dan membran contin- uous di lokasi pecah. selaput janin dikumpulkan setelah mencuci dengan PBS, cepat
beku dalam nitrogen cair, dan disimpan pada diameter pecah diukur dengan caliper digital di bawah mikroskop. Penutupan didefinisikan sebagai lubang tak terlihat di
bawah mikroskop dan membran contin- uous di lokasi pecah. selaput janin dikumpulkan setelah mencuci dengan PBS, cepat beku dalam nitrogen cair, dan disimpan
pada diameter pecah diukur dengan caliper digital di bawah mikroskop. Penutupan didefinisikan sebagai lubang tak terlihat di bawah mikroskop dan membran contin-
uous di lokasi pecah. selaput janin dikumpulkan setelah mencuci dengan PBS, cepat beku dalam nitrogen cair, dan disimpan pada - 80 ° C. Semua prosedur berpegang
pada Panduan NIH untuk Perawatan dan Penggunaan Laboratorium.

Scanning Electron Microscope (SEM). Janin, membran janin, dan plasenta yang tetap dengan 2,5% (v / v) glutaraldehida di 0,1 M sodium
cacodylate penyangga semalam pada 4 ° C. Setelah tiga bilasan dalam 0,1 M sodium caco- dylate penyangga, mereka pasca-tetap dengan 2%
osmium ferri dalam buffer yang sama selama 2 jam. Sampel dibilas dengan air dan dehidrasi dengan meningkatnya konsentrasi etanol, diikuti
oleh titik kritis pengeringan (Tousimis Samdri-795). ketuban kering dipotong sekitar plasenta, dan janin dan plasenta telah dihapus. membran
janin yang terpasang pada bertopik SEM seperti “shell” dan tetap dengan bagian dalam kulit ketuban (amnion sisi) ke atas. Membran
menggerutu dilapisi dengan emas / paladium (Cressington 108 auto menggerutu coater) dan gambar yang diperoleh pada lapangan-Emission
Scanning Electron Microscope (Zeiss Sigma) pada 3,0 kV tegangan diakselerasi Ating.

Kuantitatif real-time PCR. Non-luka jaringan di sekitar lokasi pecah akan mencairkan perubahan tingkat mRNA, jadi kami membuat
beberapa tusukan per kehamilan kantung untuk meningkatkan area pecah. Selain itu, kami memotong situs non-pecah membran janin sejauh
mungkin di sampling. Kuantitatif RT-PCR digunakan untuk menentukan tingkat relatif ekspresi gen. urutan primer untuk amplifikasi ditunjukkan
pada Tabel Tambahan  1 . SYBR hijau untuk mendeteksi amplifikasi dan ekspresi gen dinormalisasi dengan yang gen rumah tangga
ditunjukkan.

Isolasi dan budaya amnion epitel dan mesenchymal sel. Pemisahan dan isolasi amnion epitel dan mesenchymal sel manusia
dilakukan sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya 36 . Protokol untuk mendapatkan plasenta dan selaput janin telah disetujui oleh
Institutional Review Board dari University of Texas Southwestern Medical Center. Secara singkat, jaringan amnion dipisahkan oleh
diseksi tumpul dan kemudian cincang.

Ilmiah laporan | 7: 13.139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 12

www.nature.com/scientificreports/

Sel dibubarkan oleh pencernaan enzimatik dengan tripsin (Trypsin 1: 250, # 27.250-018, Gibco), dan kemudian colla- genase (Kolagenase B, #
11088831001, Roche) dan DNase I (10104159001, Roche). Sel-sel amnion terisolasi dihentikan pada DMEM / F12 (D8437, Sigma) dengan 10%
serum janin sapi dan 1% antibiotik-antimycotic solusi (Anti Anti 100X, # 15.240-062, Gibco). Sel berlapis di piring budaya plastik, dipertahankan pada
37 ° C dalam suasana ified humid- dari 5% CO 2 di udara, dan memungkinkan untuk mereplikasi di monolayer untuk pertemuan.

pewarnaan immunofluorescent. Mouse uterus tetap di paraformaldehyde 4% semalam dan disimpan dalam 50% etanol sampai parafin embedding.
Untuk memastikan bahwa situs dari cedera yang terlokalisasi, bagian yang ditargetkan pada noda hitam yang ditinggalkan oleh jarum Ink India. Kedua,
bagian seri diambil setiap 500 μ m seluruh cedera, dan seri bagian kantung nonruptured juga diperoleh untuk memastikan bahwa cacat tidak karena fakta
persiapan arte-. Setelah bagian (5 μ m) yang deparaffinized, pengambilan antigen dilakukan dengan inkubasi dengan proteinase K (P8107S, New England
Biolab, konsentrasi bekerja, 0,6 unit / ml) selama 1 menit pada 37 ° C. Untuk pengambilan antigen dari CD68, E-cadherin, dan vimentin, bagian yang
direbus dalam 10 mM sodium sitrat penyangga (pH 6,0) oleh microwave selama 20 menit, dan kemudian didinginkan selama 30 menit pada suhu kamar.
Setelah pengambilan antigen, bagian yang preincubated dengan 10% yang normal serum kambing (50062Z, Life Technologies) dengan 0,3% Triton
X-100 selama 30 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, bagian jaringan diinkubasi dengan antibodi primer di PBS dengan 1% BSA dan 0,3% Triton X-100
pada 4 ° C semalam. antibodi utama yang digunakan dan konsentrasi adalah sebagai berikut: F4 / 80 (clone BM8, eBioscience,

# 14-4801, 01:50), vimentin (D21H3, Sel Signaling, # 5741, 1: 100), E-cadherin (4A2, Sel Signaling, # 14.472, 01:50), VCAM1 (EPR5047, Abcam, #
134.047, 1: 100), P-selectin (CD62P, Abcam, # 202.983, 1: 100), NOS2 (iNOS, Abcam,
# 15.323, 1: 100), ARG1 (arginase-1, D4E3M, Sel Signaling, # 93.668, 1: 100), TNF (Abcam, # 6671, 1: 100), IL-1 β
(Abcam, # 9722, 1: 100), Ly-6G (eBioscience, # 14-5931, 1: 100), CD68 (KP1, Abcam, # 955, 1: 100), Ki67 (Abcam
# 15.580, 1: 100), HSP70 (Abcam # 2787, 1: 100). Setelah itu, bagian diinkubasi dengan Alexa Fluor 488, 549, atau 594-terkonjugasi (rantai Ig, berat
dan ringan, Invitrogen, 1: 500) antibodi sekunder di 10% yang normal serum kambing selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah itu, slide yang dipasang
dengan Memperpanjang Emas Antifade Reagen dengan DAPI (P36935, Molecular Probe). Gambar yang diambil oleh Leica SP5 confocal microscopy.
software ImageJ digunakan untuk menghasilkan gambar individu.

fluoresensi in situ hibridisasi dari kromosom Y. Gambar bagian immunostained dengan F4 / 80

dan DAPI (pengambilan antigen, proteinase K pada 37 ° C selama 1 menit) diperoleh sebelum hibridisasi menggunakan Leica SP5 confocal microscopy.
Setelah itu, kaca penutup telah dihapus oleh gemetar di dihangatkan PBS (37 ° C, 30 menit)., Bagian yang dicuci oleh 2X garam sodium penyangga sitrat
(SSC), dan kemudian pra-perawatan dengan 10 mM natrium sitrat (pH 6,0) / 2 mM EDTA (pH 8,0) pada 80 ° C selama 45 menit. Setelah mencuci
dengan 2X SSC, bagian yang dehidrasi dengan 70% etanol (1 menit) dari 100% ethanol (1 menit). bagian kering dan murine kromosom Y Probe
(Cytocell, AMP0YR) pra-pemanasan pada suhu 37 ° C selama 5 menit. 10 μ l dari FISH probe diterapkan untuk 22 mm × 22 daerah mm, dan ditutup
dengan kaca penutup dan disegel dengan semen karet. Setelah lem kering, bagian yang didenaturasi pada hot-plate pada suhu 75 ° C selama 5 menit.
Bagian kemudian diinkubasi di dalam kotak dilembabkan pada 37 ° C semalam. Setelah menghapus kaca penutup, bagian dicuci dengan 2X SSC (suhu
kamar, 5 menit), 2X SSC / 0,3% NP-40 (75 ° C, 5 menit), maka 2X SSC (suhu kamar, 1 menit), dan dipasang dengan memperpanjang Emas Antifade
Reagen dengan DAPI. Gambar diperoleh dengan Leica SP5 confocal microscopy. Bidang immunostaining dan IKAN gambar yang cocok sesuai dengan
lokasi distribusi nuklir untuk menjadi seperti dekat satu sama lain mungkin 37 . software ImageJ digunakan untuk pengolahan citra.

Penyembuhan luka assay awal. amnion epitel atau mesenchymal sel manusia utama dipanen di piring 12-baik. Pada confluency, pusat
setiap baik menggaruk dengan 10 μ l ujung (sel epitel) atau 200 μ l ujung (sel mesenchymal). Setelah mencuci dengan PBS, IL-1 β (# 201-LB, R
& D Systems), atau TNF (# 210-TA, R & D Systems) ditambahkan dalam medium bebas serum. Lebar luka diukur secara mikroskopis dengan
3 poin di masing-masing bidang. Tiga bidang yang berbeda dipilih di setiap baik, dan lebar itu rata-rata. Persen penutupan dihitung dengan
divid- ing lebar rata-rata waktu yang ditunjukkan oleh lebar 0 h.

Immunocytochemistry. amnion epitel atau mesenchymal sel manusia primer tumbuh di 8-baik chamber slide. Sel-sel tetap dalam
paraformaldehyde 4% selama 10 menit. Setelah mencuci dengan PBS, slide diinkubasi dengan 10% yang normal serum kambing selama 30 menit
pada suhu kamar. Setelah itu, slide diinkubasi dengan antibodi primer semalam pada 4 ° C. antibodi utama yang digunakan dan konsentrasi adalah
sebagai berikut: vimentin (D21H3, Sel Signaling, # 5741, 1: 100), E-cadherin (4A2, Sel Signaling, # 14.472, 01:50), dan CD68 (KP1, Abcam, # 955 ,
1: 100). Setelah inkubasi dengan antibodi sekunder (Alexa Fluor 488, 549, atau 594, Invitrogen, 1: 500 dilusi), slide yang dipasang dengan
Memperpanjang Emas DAPI. Gambar yang diambil oleh Leica SP5 confocal microscopy, dan dihasilkan oleh perangkat lunak ImageJ.

Isolasi mouse makrofag cairan ketuban. makrofag cairan ketuban diisolasi dari tikus seperti yang dijelaskan sebelumnya 26 . Secara
singkat, cairan ketuban dari kantung individu itu disedot dengan jarum 20-gauge dengan
1.0-ml jarum suntik yang mengandung 100 μ l medium RPMI 1640. Dikumpulkan cairan ketuban masing-masing kantung kehamilan ditambahkan ke
8-baik ruang slide, dan diinkubasi pada 37 ° C selama 1 jam dalam inkubator. Setelah mengkonfirmasi lampiran sel ke slide, sel-sel tetap dengan
paraformaldehyde 4% selama 10 menit, dan kemudian diproses untuk imunohistokimia. Untuk kuantifikasi makrofag, lima bidang yang dipilih secara acak
dengan menggunakan 20 × obyektif dan rata-rata ber NUM sel CD68-positif per lapangan dibagi dengan volume cairan amnion ( μ l).

Analisis statistik. Nilai dinyatakan sebagai sarana ± SD in vitro eksperimen atau cara ± SEM dalam percobaan tikus. Data dianalisis
dengan berpasangan Mahasiswa t Tes kecuali dinyatakan lain. Untuk perbandingan diameter pecahnya amnion dan choriodecidua, dan
jumlah sel CD68 positif dalam cairan ketuban, ANOVA

Ilmiah laporan | 7: 13.139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 13

www.nature.com/scientificreports/

telah dilakukan. Untuk penutupan lengkap amnion, uji chi-square digunakan. P nilai kurang dari 0,05 dianggap sebagai signifikan secara
statistik.

Referensi
1. Parry, S. & Strauss, JF-3 pecahnya Prematur selaput janin. N Engl J Med 338, 663-670, https://doi.org/10.1056/
NEJM199803053381006 (1998).
2. Goldenberg, RL, Culhane, JF, Iams, JD & Romero, R. Epidemiologi dan penyebab kelahiran prematur. Lanset 371, 75-84, https: // doi.
org / 10,1016 / S0140-6736 (08) 60.074-4 (2008).
3. Romero, R. et al. infeksi intraamniotik dan awal persalinan di ketuban pecah prematur membran. Am J Obstet
Gynecol 159, 661-666 (1988).
4. Gomez, R. et al. Janin sindrom respon inflamasi. Am J Obstet Gynecol 179, 194-202 (1998).
5. Johnson, JW, Egerman, RS & Moorhead, J. Kasus dengan membran pecah yang “reseal”. Am J Obstet Gynecol 163, 1024-1030;
Diskusi 1030-1022 (1990).
6. Martin, P. penyembuhan luka-bertujuan untuk regenerasi kulit yang sempurna. Ilmu 276, 75-81 (1997).
7. Sonnemann, KJ & Bement, WM Luka perbaikan: menuju pemahaman dan integrasi tunggal-sel dan respon luka multiseluler. Annu Rev Sel Dev Biol 27, 237-263,
https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-092910-154251 (2011).
8. Gordon, aktivasi S. Alternatif makrofag. Nat Rev Immunol 3, 23-35, https://doi.org/10.1038/nri978 (2003).
9. Gordon, S. & Martinez, aktivasi FO Alternatif makrofag: mekanisme dan fungsi. Kekebalan 32, 593-604, https: // doi.
org / 10,1016 / j.immuni.2010.05.007 (2010).
10. Murray, PJ & Wynn, TA pelindung dan fungsi patogen dari subset makrofag. Nat Rev Immunol 11, 723-737, https: // doi.
org / 10.1038 / nri3073 (2011).
11. Underwood, MA, Gilbert, WM & Sherman, MP cairan amnion: tidak hanya urine janin lagi. J Perinatol 25, 341-348, https: //
doi.org/10.1038/sj.jp.7211290 (2005).
12. Sutherland, GR, Bauld, R. & Bain, AD Pengamatan pada strain sel manusia cairan ketuban dalam budaya serial. J Med Genet 11,
190-195 (1974).
13. Sutton, L., Mason, DY & Redman, sel CW HLA-DR positif dalam plasenta manusia. Imunologi 49, 103-112 (1983).
14. Shaw, TJ & Martin, P. perbaikan luka sekilas. J Sel Sci 122, 3209-3213, https://doi.org/10.1242/jcs.031187 (2009).
15. Imhof, BA & Aurrand-Lions, mekanisme M. Adhesi mengatur migrasi monosit. Nat Rev Immunol 4, 432-444,
https://doi.org/10.1038/nri1375 (2004).
16. Yan, C. et al. Transisi epitelial-mesenkimal dalam penyembuhan luka kulit manusia disebabkan oleh tumor necrosis factor-alpha melalui
morphogenic tulang protein-2. Am J Pathol 176, 2247-2258, https://doi.org/10.2353/ajpath.2010.090048 (2010).
17. Borgida, AF, Mills, AA, Feldman, DM, Rodis, JF & Egan, JF Hasil dari kehamilan dengan komplikasi selaput pecah setelah amniosentesis genetik. Am J
Obstet Gynecol 183, 937-939, https://doi.org/10.1067/mob.2000.108872 (2000).
18. Maxson, S., Lopez, EA, Yoo, D., Danilkovitch-Miagkova, A. & Leroux, MA Concise ulasan: Peran sel induk mesenchymal dalam perbaikan luka. Stem Cells transl
Med 1, 142-149, https://doi.org/10.5966/sctm.2011-0018 (2012).
19. Redd, MJ, Cooper, L., Wood, W., Stramer, B. & Martin, P. luka penyembuhan dan peradangan: embrio mengungkapkan cara untuk memperbaiki sempurna. Philos Trans R Soc
Lond B Biol Sci 359, 777-784, https://doi.org/10.1098/rstb.2004.1466 (2004).
20. Sopher, D. Respon dari membran janin tikus cedera. Ann R Coll Surg Engl 51, 240-249 (1972).
21. Gratacos, E. et al. Sebuah studi histologis cacat membran fetoscopic untuk mendokumentasikan penyembuhan membran. tembuni 27, 452-456,
https://doi.org/10.1016/j.placenta.2005.03.008 (2006).
22. Cheung, CY & Brace, RA ketuban volume cairan dan komposisi pada kehamilan tikus. Jurnal Masyarakat untuk Gynecologic
Penyelidikan 12, 558-562, https://doi.org/10.1016/j.jsgi.2005.08.008 (2005).
23. Devlieger, R., Millar, LK, Bryant-Greenwood, G., Lewi, L. & Deprest, JA janin penyembuhan membran setelah pecah spontan dan iatrogenik membran: review
dari bukti saat ini. Am J Obstet Gynecol 195, 1512-1520, https://doi.org/10.1016/j. ajog.2006.01.074 (2006).

24. Geissmann, F. et al. Pengembangan monosit, makrofag, dan sel dendritik. Ilmu 327, 656-661, https://doi.org/10.1126/
science.1178331 (2010).
25. Thomson, AJ et al. Leukosit menyusup miometrium selama proses kelahiran manusia: bukti lebih lanjut bahwa tenaga kerja adalah
proses inflamasi. Hum Reprod 14, 229-236 (1999).
26. Condon, JC, Jeyasuria, P., Faust, JM & Mendelson, CR Surfaktan protein disekresikan oleh jatuh tempo tikus janin bertindak paru-paru sebagai hormon yang sinyal
inisiasi kelahiran. Proc Natl Acad Sci USA 101, 4978-4983, https://doi.org/10.1073/pnas.0401124101
(2004).
27. Kobayashi, K., Umezawa, K. & Yasui, M. Apoptosis pada tikus epitel amnion diinduksi oleh makrofag diaktifkan melalui TNF tipe reseptor 1 / TNF jalur. Biol
Reprod 84, 248-254, https://doi.org/10.1095/biolreprod.110.087577 (2011).
28. Utara, ML, Khanna, N., Marsden, PA, Grasemann, H. & Scott, JA peran fungsional penting bagi arginase 1 di hyperresponsiveness saluran napas asma. Am J
Physiol Paru Sel Mol Physiol 296, L911-920, https://doi.org/10.1152/ajplung.00025.2009
(2009).
29. Bruch-Gerharz, D. et al. Arginase 1 berlebih pada psoriasis: pembatasan kegiatan nitrat oksida sintase diinduksi sebagai molekul
mekanisme untuk keratinosit hyperproliferation. Am J Pathol 162, 203-211, https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)63811-4 (2003).
30. Campbell, L., Saville, CR, Murray, PJ, Cruickshank, SM & Hardman, MJ lokal arginase 1 aktivitas diperlukan untuk penyembuhan luka kulit. J Invest Dermatol 133,
2461-2470, https://doi.org/10.1038/jid.2013.164 (2013).
31. Kalluri, R. & Weinberg, RA Dasar-dasar transisi epithelial-mesenchymal. J Clin Invest 119, 1420-1428, https://doi.org/10.1172/
JCI39104 (2009).
32. Wheelock, MJ, Shintani, Y., Maeda, M., Fukumoto, Y. & Johnson, KR Cadherin switching. J Sel Sci 121, 727-735, https: // doi.
org / 10,1242 / jcs.000455 (2008).
33. Eming, SA, Martin, P. & Tomic-Canic, M. luka perbaikan dan regenerasi: mekanisme, sinyal, dan terjemahan. Sci transl Med
6, 265sr266, https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3009337 (2014).
34. Moore, KW, de W Malefyt, R., Coffman, RL & O'Garra, A. Interleukin-10 dan interleukin-10 reseptor. Annu Rev Immunol
19, 683-765, https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.19.1.683 (2001).
35. Sato, Y., Ohshima, T. & Kondo, T. peran Regulatory endogen interleukin-10 di respon inflamasi kulit penyembuhan luka murine. Biochem Biophys Res
Commun 265, 194-199, https://doi.org/10.1006/bbrc.1999.1455 (1999).
36. Casey, ML & MacDonald, sintesis kolagen PC interstitial dan pengolahan di amnion manusia: properti dari sel-sel mesenchymal. Biol Reprod 55, 1253-1260
(1996).
37. Miyata, E. et al. asal hematopoietik dari sel ito di hati dewasa. Darah 111, 2427-2435, https://doi.org/10.1182/
darah-2007-07-101261 (2008).

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada Bapak Yesus Acevedo dan Ms. Haolin Shi untuk persiapan tikus hamil, dokter dan staf dari Parkland Memorial Hospital, dan
Ms Sylvia Wright untuk bantuan berharga dalam pengadaan jaringan. Kami juga berterima kasih

Ilmiah laporan | 7: 13.139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 14

www.nature.com/scientificreports/

core bersama sumber daya dalam mikroskopis Imaging, Molecular Pathology (Mr John Shelton), Electron Microscopy (Dr. Anza
Darehshouri dan Ibu Phoebe Doss) di UTSWMC untuk dukungan teknis. Karya ini didukung oleh March of Dimes Yayasan Inisiasi
Penelitian prematur memberikan # 21-FY13-35 dan # 21-FY15-138. The Tissue Akuisisi Inti didukung oleh NIH P01HD087150 sangat
kami hargai.

penulis Kontribusi
HM dilakukan semua percobaan. AHK dibantu HM dalam percobaan terkait percobaan kultur sel. YA dibantu dalam pencitraan
immunofluorescent membran janin. HM dan RAW menulis teks naskah utama dan disiapkan semua angka. Semua penulis Ulasan
naskah.

informasi tambahan
Informasi tambahan menyertai tulisan ini di https://doi.org/10.1038/s41598-017-13296-1 .

Bersaing Minat: Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan bersaing.

Penerbit catatan: Springer Nature tetap netral berkaitan dengan klaim yurisdiksi di peta yang diterbitkan dan afiliasi institusional.

Akses terbuka Artikel ini berlisensi di bawah Creative Commons Attribution 4.0 License International, yang memungkinkan
penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi dan reproduksi di media atau format, selama Anda memberikan kredit sesuai dengan penulis asli (s) dan
sumber, memberikan link ke lisensi CRE ative Commons, dan menunjukkan jika perubahan yang dilakukan. Gambar atau materi pihak ketiga
lainnya dalam artikel ini termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel ini, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit untuk materi. Jika bahan
tidak termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel dan penggunaan yang dimaksud tidak diizinkan oleh peraturan perundang-undangan atau
melebihi penggunaan yang diizinkan, Anda akan perlu untuk mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi
ini, kunjungi http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . © The Author (s) 2017

Ilmiah laporan | 7: 13.139 | DOI: 10.1038 / s41598-017-13296-1 15