Food Chemistry 214 (2017) 631-636

listas de contenidos ofrecidos en ScienceDirect

Química de Alimentos

Diario página de inicio: www.elsevier .com / localizar / Foodchem

herramientas NGS para la trazabilidad en caramelos como productos alimenticios de alta procesados: Ion Torrent
PGM frente PCR-clonación convencional

Marta Muñoz-Colmenero un , ⇑ , José Luis Martínez segundo , Agustín Roca un , Eva García-Vázquez un
un Laboratorio de Genética de Recursos Naturales, Área de Genética, Departamento de Biología Funcional de la Universidad de Oviedo, Asturias, España
segundo Unidad de secuenciación de la Universidad de Oviedo, Asturias, España

información del artículo abstracto

Historia del artículo: Las metodologías de secuenciación de nueva generación son considerados está siendo evaluado el siguiente paso dentro de los métodos
Recibido el 2 de de marzo de el año 2016
basados ​en el ADN y su aplicabilidad en diferentes campos. Aquí, hemos probado la utilidad de la Ion Torrent Personal Genome Machine
Recibida en forma Revisado el 12 de de julio de el año 2016 aceptado el
(PGM) en trazabilidad de los alimentos analizar caramelos como un modelo de altos alimentos procesados, y se compararon los resultados con
20 de julio de el año 2016 Disponible en Internet el 21 de julio de el año
los obtenidos por PCR-clonación-secuenciación (PCR-CS). La mayoría de las muestras mostró consistencia entre las metodologías,
2016
produciendo más información y especies por producto de la plataforma PGM de PCR-CS. Significativamente mayor AT-contenido en las
secuencias de la misma especie también se obtuvo de PGM. Esto, junto con algunas discrepancias taxonómicas entre metodologías sugieren
palabras clave:
que la plataforma PGM es todavía pre-madura para su uso en la trazabilidad de los alimentos de los productos altamente procesados
Caramelo
​complejos.
trazabilidad
Next-Generation-Sequencing PGM Ion
Torrent PCR-clonación
2016 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción
En un comercio de alimentos en constante crecimiento en todo el mundo ( Chang, ChungHui, y
Min-ye, 2013 ), El control es esencial para asegurar un comercio transparente y fiable y salvaguardar
los derechos y la salud de los consumidores (por ejemplo, Barling, Sharpe, y Lang, 2009; Charlebois,
Sterling, Haratifar, y Naing, 2014 ). Cuando el alimento llega al mercado y está disponible para los
consumidores, debe ir acompañada de información relevante para caracterizar el producto: la lista de
ingredientes, alérgenos potenciales y / o trazas de alérgenos adquiridos, valor nutricional,
recomendaciones de conservación, instrucciones para utilizar en el caso de pre-cocinada producto,
método de producción, el origen en el caso de las materias primas, así como la información
necesaria para seguir el producto a través de la cadena de suministro ( Germain, 2003 ). Esta
información debe ser revelada en la etiqueta para los consumidores a tomar decisiones informadas
de acuerdo a sus necesidades y / o preferencias, por ejemplo específico alergias, preocupaciones
religiosas, ética, veganismo, etc. ( Woolfe y la primavera de 2004 ).
Para garantizar la exactitud de la información proporcionada sobre los ingredientes de alimentos
y la composición de numerosas técnicas son, por ejemplo, disponibles: métodos geoquímicas ( Reis-Santos
et al., 2012 ), Los análisis de ácidos grasos (FA) ( Hall, Parrish, y Thompson, 2002 ), Análisis acoplado
inductivamente espectrometría de masas de plasma (ICP-MS) ( S Ahan, Basoglu, y Gücer de 2007 ),
Espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) ( Kelly, Heaton, y Hoogewerff de 2005 ),
inmunoensayos ( Lipton et al., 2000 ), Etc. Alrededor de los últimos veinte cinco años las herramientas
basadas en ADN han crecido en importancia debido a su poder de discriminación entre diferentes
especies, incluso entre especies estrechamente relacionadas taxonómicamente. Otra ventaja es la
resistencia de las moléculas de ADN para la cocción o procesamiento fuerte mientras que otras
moléculas, tales como proteínas, se destruyen ( Woolfe y la primavera de 2004 ). Además, los costes
de las metodologías basadas en ADN están disminuyendo progresivamente ( Costa Leal, Pimentel,
Ricardo, Rosa, y Calado, 2015 ). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el ADN ampli fi
cación proporciona amplicones que, tratados posteriormente con otras técnicas moleculares, tales
como: PCR-DGGE ( Hovda, Sivertsvika, Lunestadb, Lorentzenc, y Rosnesa de 2007 ), Los códigos de
barras de ADN ( Carvalho, Palhares, Drummond, y Frigo, 2015 ), Los microsatélites ( Sardaro,
Marmiroli, Maestri, y Marmiroli, 2013 ), O PCR-clonación ( Muñoz-Colmenero, Martínez, Roca, y
GarciaVazquez, 2016 ), Identificar con precisión componentes de los alimentos. En los últimos años,
Next Generation Sequencing (NGS) tecnologías han cautivado rápidamente el campo de la biología
molecular fi, ya que generan grandes cantidades de datos de ADN con cada vez

⇑ El primer autor en: Laboratorio de Genética de Recursos Naturales, Área de Genética, Departamento de

Biología Funcional de la Facultad de Medicina de la calle Julián Clavería, 33006 Oviedo, Asturias, España.

Correos electrónicos: a.martam.colmenero@gmail.com (M. Muñoz-Colmenero),

secuenciacion@spi.uniovi.es (JL Martínez), aroca@uniovi.es (A. Roca), egv@uniovi.es
(E. Garcia-Vazquez).

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.07.121
0308-8146 / 2016 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
632 M. Muñoz-Colmenero et al. / Food Chemistry 214 (2017) 631-636
premios competitivos y asequibles ( Grada y Weinbrecht, 2013 ). Sus aplicaciones han sido ya
explorada en algunos campos, por ejemplo: la caracterización de las comunidades bacterianas
gastrointestinales ( Zarkasi et al., 2014 ), Gestión del agua de lastre (BWM;
Zaiko et al., 2015b ), La trazabilidad de los piensos acuícolas ( Galal-Khallaf, Osman, Carleos,
García-Vázquez, y Borrell, 2016 ), Etc. Sin embargo, a pesar de sus muchas ventajas potenciales,
estas nuevas técnicas no son maduras y se necesitan más estudios para mejorar su precisión
corrigiendo sus fuentes de error ( Zaiko et al., 2015A ). En el terreno de la trazabilidad de los alimentos
estas técnicas han sido propuestas como una buena alternativa ( Díaz-Sánchez, Hanning, Pendleton,
y D'Souza, 2013 ) Y han comenzado a aplicarse. Por lo tanto, es el momento de poner a prueba su e
fi ciencia y la precisión para resolver los problemas especí fi cos en ciencias de la alimentación.
productos altamente procesados ​son uno de los retos de la trazabilidad de los alimentos debido a
que sus proteínas y el ADN generalmente se degradan debido a dicho tratamiento intenso.
amplicones de ADN cortas son buscados para la PCR exitosa ( Mackie et al., 1999 ), Así como
fragmentos de ADN que se encuentran naturalmente en múltiples copias en los organismos vivos,
por ejemplo genes mitocondriales ( Galal-Khallaf et al., 2016 ).
En este estudio hemos explorado la aplicabilidad de los métodos de NGS para analizar la
composición de los diferentes tipos de dulces como ejemplos de productos alimenticios altamente
procesados. Hemos utilizado Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) para amplificar un
fragmento corto de 16S mitocondrial de genes ribosomal, y compararon los resultados con los datos
anteriores obtenidos a partir de la metodología de PCR-clonación secuenciación clásico.
2. Materiales y métodos
2.1. muestras analizadas
Cincuenta caramelos de diferentes tipos (caramelos duros, malvaviscos, gomitas, gomas,
caramelos, caramelos con chocolate) se analizaron mediante PCR-clonación-secuenciación
(PCR-CS; Muñoz-Colmenero et al., 2016 ) Y la plataforma de PGM. Después de la extracción de
ADN, un fragmento corto de 80-122 pares de bases (pb) en el gen de ARN ribosomal 16S fue
amplificado con los cebadores desarrollados por Horreo, Ardura, Pola, Martínez y García-Vázquez
(2013) . Los detalles sobre las condiciones de esterilidad, la extracción de ADN, PCR-CS y
metodología basada en BLAST para asignación especies se describen en Muñoz-Colmenero et al.
(2016) .
2.2. metodología de NGS
PCR se realizó con Horreo et al. (2013) cebadores y algunas modificaciones: un adaptador de
secuenciación PGM, los códigos de barras (uno por muestra) necesarios para diferenciar las lecturas
perteneciente a cada muestra de caramelo, y un espaciador '' GAT”. Las condiciones de la
amplificación fi eran el mismo utilizado en la metodología de PCR-clonación-secuenciación ( Muñoz-Colmenero
et al., 2016 ). Los amplicones fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de
etidio para comprobar el tamaño y purificó con Wizard SV Gel y el kit PCR Clean-Up System
(Promega). productos de PCR se cuanti fi usando un uorimeter Qubit 2,0 fl y una doble comprobación
en un Bioanalyser 2100 (Agilient Technologies, EE.UU.) para confirmar también el tamaño del
fragmento. Todas las muestras se diluyeron hasta 26 pmol para la preparación de una piscina
equimolar con todas las muestras. La piscina se procesó mediante PCR emulsión líquido en el
sistema One Touch usando el Ion PGM TM Plantilla OT2 200 Kit siguiendo las instrucciones del
fabricante. A continuación, la muestra se cargó en el Ion '' 314” chip (Life Technologies), y se
secuencia empleando el Ion Torrent Personal Genome Machine (Life Technologies), ubicado en las
instalaciones de secuenciación de la Universidad de Oviedo (España), siguiendo las especificaciones
de la protocolo Ion PGM TM Secuenciación Kit 200 v2 para 500 flujos. Bajo
secuencias de calidad y policlonales se filtraron automáticamente y el PGM 3 0 adaptador se recortó
en el software de PGM. Uno
/. Bam y /. FASTQ fi l por muestra (diferente de código de barras) se obtuvo.
2.3. Preparación de la base de datos 16S rDNA
Los datos usados ​para preparar la base de datos de referencia se tomaron de la base de datos
NCBI GenBank ( http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank/ ). Para más específico de búsqueda C y
posterior asignación de las especies utilizando la herramienta BLAST de la tubería QIIME
seleccionamos una base de datos parcial usando los filtros: '' organismo metazoos”y '' todos los
campos fi-16S”. Esta base de datos parcial (suficiente para incluir cualquier animal presente en los
dulces) se descargó y ejecuta el script pitón '' Entrez_qiime.py”( Baker, 2014 ), Que organiza la
información dentro de la base de datos en diferentes archivos coordinada, necesaria para el
gasoducto QIIME.
2.4. Análisis de secuencias de PGM chip
Para cada muestra tenemos uno 'FASTQ' fi l en la que recortamos las secuencias de los
cebadores y se filtra las secuencias resultantes como sigue: longitud mínima y máxima permitidas, 60
y 200 pb, respectivamente; > 15 puntuación media de calidad; máximo homopolímero dentro de
carreras utilizando el programa de versión CutAdapt 1.7.1. ( Martin, 2011 ). A continuación, se utilizó el
software QIIME dividir el 'FASTQ' archivos en constituyente /. Fna y /. cali fi les de ''
convert_fastqual_fastq. py”script en Python para continuar la tubería QIIME ( Caporaso et al., 2010 )
Con algunas modificaciones. Utilizamos% de identidad de 98 y 10 E-valor 12 como puntos de corte
para comparar nuestros resultados con la base de datos de ADNr 16S descrito anteriormente y para
obtener las especies contenidas en nuestras muestras.
Después de seguir la tubería, la minuciosidad de la asignación de las especies fue verificada
manualmente y se corrige si es necesario para asegurar que las especies asignación se hizo de la
manera más conservadora posible. La especie cuyas secuencias aparecido sólo en el análisis de
cinco veces o menos se eliminaron. De los restantes, un número de secuencias se analizaron
directamente utilizando la herramienta NBLAST contra la base de datos GenBank, como lo hicimos
con ADN PCR-CS, para asegurar que el porcentaje de especies y la identidad obtenidos fueron los
mismos que los obtenidos después de tubería QIIME, y todo nuestro cortes habían sido ful LLED fi.
Los resultados que no cumplan con todos los requisitos fueron retirados.
Por último, se determinó la composición de nucleótidos de secuencias al azar de PGM y se
comparó con secuencias de PCR-CS con el fin de comprobar los cambios en los porcentajes de
nucleótidos. se hizo la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para determinar la significación de la
diferencia en AT-contenido entre los métodos, utilizando el programa rstudio ( https://www.rstudio.com/
).
3. resultados
secuencias de ADN Animal se obtuvieron con éxito a partir de 40 y 41 caramelos por PCR-CS y
la técnica PGM respectivamente. Siete muestras coincidieron en ausencia de huellas de ADN para
ambas metodologías ( El cuadro complementario S1 ). datos PGM se presentaron al Archivo Europeo
de nucleótidos (ENA) de base de datos perteneciente al Instituto Europeo de Bioinformática en el
Laboratorio Europeo de Biología Molecular, EMBL-EBI ( http://www.ebi.ac.uk/ ), Dentro de El someter
leer la parte de datos (SRA). Están disponibles con el número de acceso PRJEB12336 estudio ( http://www.ebi.ac.uk/e
vista / PRJEB12336 ), Bajo el título '' fragmento 16S rDNA para detectar diferentes especies de
animales contenidos en los caramelos”. Las secuencias de PCR-CS tienen los siguientes números
de acceso en la misma base de datos: HG964177-81, HG964184-86, HG964191-2, HG964198-
4203, HG964205-7, HG964211-2, HG964216-8, HG964222-4,
 M. Muñoz-Colmenero et al. / Food Chemistry 214 (2017) 631-636
HG964228-30, HG964234-6, HG964239, HG964243-5, HG974257-60, HG974264-73,
HG974275-9, HG974282-5, HG974289-92,
HG974297-9, HG974305-7, HG974314-7, HG974326-30, HG974332-6, HG974342-6, HG974348-50,
HG974354-6, HG974362, HG974366, HG974370-1, HG974374, HG974376, HG974380-1 y
HG974388 ( Muñoz-Colmenero et al., 2016 ).
El número medio de ADN lee por muestra obtenida de software Ion Torrent PGM directamente
fue 2301, y después de todos los filtros de la tubería QIIME y manual comprobando que era 1798. El
porcentaje de lecturas que ha asignado correctamente a las especies animales (= útil lecturas) no fue
homogénea entre muestras, que cubren una gama
30,5% -94,8% con una media de 78,2% ( Figura 1 ). La proporción de cada especie que se encuentran
en las muestras totales de PGM se muestra en la Figura 2 Una, la cual estaba más alto para la carne
de cerdo, carne de res y humano, seguido de pollo. En cuanto a la proporción de caramelos donde
se encontró cada especie por PGM, el resultado fue similar. En la mayoría de la carne de cerdo
muestras, se detectaron carne y humano, seguidas por las especies de aves de corral ( Figura 2 SEGUNDO).
Las especies animales detectados por muestra se muestran en detalle en El cuadro complementario
S2 . PGM y PCR-CS resultados fueron consistentes para 61% de las muestras, lo que significa que
todas las especies encontradas de PCR-CS también se establecieron con PGM ( El cuadro
complementario S1 ). Más especies por caramelo se encontraron resultados para mayor que para
caramelos envasados, a partir de los dos métodos de análisis ( tabla 1 ). Para ambos tipos de
caramelos Se encontraron más especies con la plataforma de PGM, aumentando el porcentaje de los
caramelos con 4 o> 4 especies animales y disminuyendo el porcentaje de productos con sólo 1
especies en
Figura 1. Porcentaje de lecturas utilizado para asignar las especies animales por un caramelo a la fi inicial le de Ion Torrent PGM.
633
comparación con los datos PCR-CS ( tabla 1 ). El número promedio de especies por dulces a granel
era 3,56 (error estándar (SE) 1,98) y
2,13 (SE 1,58) para PGM y PCR-CS, respectivamente. Por medio de caramelo empaquetados
fueron, respectivamente, 2,56 (SE 1,82) y 1,78 (SE 1,26).
Para el porcentaje de los caramelos que contienen cada especie usando PCR-CS, en tanto a
granel y caramelos envasados ​tres especies fueron consistentemente dominante como se produjo
para los resultados de PGM: carne de cerdo, carne de res y trazas humanas ( Figura 2 ; Tabla 2 ). Sin
embargo, no parecen ser detectado por igual de los dos métodos, PGM ser más e fi ciente en
general para las especies de aves de corral y menos para el ADN merluza de PCR-CS (algunas
especies tales como aves de corral y la merluza Tabla 2 ). Las muestras que den diferentes
contenidos especies de los dos métodos moleculares, denominados en lo sucesivo ''
incongruencias”, eran el 39% del total ( El cuadro complementario S1 ). Algunas muestras
proporcionadas especies diferentes pero relacionadas taxonómicamente por cada método. Un
ejemplo era # 35, con más abundante vaca ( Bos taurus) y humano ( Homo sapiens) como las especies
compartidas y búfalos de agua ( Bubalus bubalis)
detectado por solamente PCR-CS, mientras que una baja proporción de lecturas fueron asignados a
ovejas ( Ovis aries) y la merluza ( Merluccius sp.) con PGM. Las secuencias cortas de vaca y búfalo de
agua exhibición 11 diferencias de nucleótidos en el largo fragmento de 81 pb obtenido (dependiendo
de los haplotipos) en la secuencia completa (datos no mostrados). En la muestra # 20, se obtuvo un
resultado similar para las secuencias de vaca y de oveja (13 pb diferente).
Otro tipo de muestras incongruentes eran aquellos en los que el ADN humano representado en
una muestra> 75% de las especies asignadas en PGM
634 M. Muñoz-Colmenero et al. / Food Chemistry 214 (2017) 631-636

Figura 2. Proporción de secuencias detectadas para cada especie en el total de datos de PGM (A), y la proporción de caramelos donde cada especie aparecieron en los análisis (B).

tabla 1 Tabla 3
Clasificación de los productos de caramelo analizados basado en el número de especies detectadas en ellos. El contenido promedio de AT (en%) de las secuencias de las especies más abundantes obtenidos de PCR-CS y PGM. El
PCR-clonación de secuenciación como PCR-CS, Máquina Ion Torrent Genoma Personal como PGM. valor de p para la prueba de Mann-Whitney la comparación de los dos métodos se da (fi valores significativos de p <0.05
están marcados con un asterisco).

Abultar Lleno % AT-contenido

PCR-CS PGM PCR-CS PGM PCR-CS PGM p-valor

Ninguna 21.88 15.63 11.11 16,67 S. scrofa 59,83 ± (0.69) 69.56 ± (3.05) 0,0058 /
1 especie 18.75 0 38.89 11.11 B. taurus 56.92 ± (0,76) 63.27 ± (3.84) 0,0056 /
2 especies 9.38 9.38 22.22 22.22 Merluccius sp. 61.98 ± (0) 72.06 ± (0,83) 0,0036 /
3 especies 31.25 15.63 22.22 22.22 G. gallus 46.72 ± (0,58) 50.81 ± (0,53) 0,0044 /
4 especies 12.50 25.00 0 16,67 M. gallopavo 48,07 ± (0,38) 51,07 ± (2.33) 0,0632
> 4 especies 6.25 34.38 5.56 11.11 H. sapiens 57.07 ± (0,38) 60,43 ± (2.92) 0,0594

( El cuadro complementario S2 ) Mientras que los pequeños% del ADN humano, en su caso, fue
Tabla 2
encontrado por PCR-CS. Este fue el caso de las muestras # 8, # 17, # 20 y # 34 ( Los cuadros
La aparición de diferentes especies en los dulces analizados, como productos que contienen% que las especies
detectadas a partir de PCR-clonación-secuenciación (PCR-CS), Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) o los suplementarios S1 y S2 ). En cuanto a composición de la secuencia, AT-contenido era
dos métodos ( '' compartida”). El porcentaje de caramelos en el que no se detectó la especie se encuentra en la consistentemente mayor para las secuencias obtenidas a partir de NGS que para los obtenidos de
columna '' None”. PCR-CS en las seis especies ensayadas, con estadísticamente diferencia significativa en cuatro de

Especies Shared% % Solamente % Ninguna

ellos y no puede fi marginalmente signi (p <0,10) en los otros dos ( Tabla 3 ).
PCR-CS Solamente PGM

Abultar Sus scrofa 44.44 7.41 29.63 18.52

Bos taurus 62.96 7.41 22.22 7.41
Bubalus bubalis 0 3.70 0 96.30
Ovis aries 0 0 7.41 92.59 4. Discusión
Gallus gallus 11.11 0 40.74 48.15
Meleagris gallopavo 18.52 3.70 22.22 55.56
Merluccius sp. 7.41 22.22 18.52 51.85
Los resultados del presente estudio muestran por primera vez la aplicación de la metodología de
Merluccius paradoxus 3.70 0 3.70 92.59 NGS a los productos de caramelo, en particular, la plataforma Ion Torrent PGM, que la tasa de error
Engraulis ringens 0 3.70 7.41 88.89 es 1,2% (Nota de aplicación Ion PGM TM Secuenciador, Life Technologies). Los resultados fueron
pelamis 0 0 7.41 92.59
generalmente consistentes con los obtenidos de PCR-cloningsequencing, por el método de Sanger
brevis Trichiurus 0 0 3.70 96.30
(tasa de error es de aproximadamente 1%;
Triglidae 0 0 3.70 96.30
Gadidae 0 0 3.70 96.30
Homo sapiens 55.56 0 40.74 3.70 Hoff, 2009; Keith et al., 1993 ), El método clásico empleado para la trazabilidad especies de productos

Lleno Sus scrofa 33,33 11.11 11.11 3.70 altamente procesados ​con una mezcla de ingredientes. En el Tabla 4 resumimos algunas ventajas y
Bos taurus 18.52 14.81 18.52 7.41 desventajas de los dos métodos que se comentarán más adelante.
Bubalus bubalis 0 0 3.70 55.56
Gallus gallus 0 3.70 18.52 37.04
En primer lugar, el principal beneficio de técnicas de NGS es el gran número de secuencias de
Meleagris gallopavo 0 0 3.70 55.56
Merluccius sp. 0 7.41 7.41 44.44
ADN que se pueden obtener en un solo análisis, dando mayor resolución que los métodos
Merluccius paradoxus 0 3.70 0 55.56 convencionales ( Codorniz et al., 2012 ). En consecuencia se han encontrado más especies en los
Engraulis ringens 0 0 3.70 55.56 dulces que utilizan la plataforma (PGM tabla 1 ), La adjudicación de análisis mayor potencia para
Sardina pilchardus 0 0 3.70 55.56
detectar rastros de ADN en comparación con PCR-clonación-secuenciación. La capacidad de
Sesamia nonagrioides 0 0 3.70 55.56
detección de especies escasos es una de las ventajas de
Homo sapiens 22.22 3.70 22.22 11.11
 M. Muñoz-Colmenero et al. / Food Chemistry 214 (2017) 631-636
Tabla 4
Resumen de ventajas y desventajas encontradas en este estudio para PCR-clonación secuenciación y la plataforma de PGM aplicado a la trazabilidad de los alimentos compleja.
PCR-clonación secuenciación
ventajas - control directo más alta ya que la participación directa de los técnicos en cada paso es
necesario
- Confiabilidad en los procedimientos de BLAST ya que los resultados son comprobados manualmente
- referencias sólidas a partir de experiencias anteriores ( Ardura et al, 2012.; Galal-Khallaf
et al, 2016.; Muñoz-Colmenero et al., 2016 )
desventajas - Mucho tiempo de análisis experimentales
- alto costo por muestra
- Presencia / ausencia se puede dar en lugar de proporciones de cada ingrediente (a
menos que muchos clones se secuencian)
herramientas NGS (por ejemplo, Zaiko et al., 2015b ), Y una razón sólida para seguir mejorando y
aplicando estas nuevas técnicas en diferentes campos.
La cobertura de la muestra fue en promedio 1.798 útil lecturas que deben ser su fi ciente para
detectar todos los ingredientes de una muestra. Por PCR-clonación de secuenciación fue necesario
limitar el número de clones secuenciados a un número razonable para no aumentar demasiado el
premio de análisis (10-16 clones; Muñoz-Colmenero et al., 2016 ), (<10%) pueden ser pasados ​por
alto por lo tanto ingredientes escasos. La tecnología de Ion Torrent PGM, de costo relativamente
bajo y alta velocidad de análisis, ha sido especıficamente destacó como primera elección para la
detección rápida de los amplicones en aplicaciones a pequeña escala ( Díaz-Sánchez et al., 2013 ).
ahorro de tiempo es una ventaja importante del PGM. Para procesar las muestras analizadas aquí
usando PCR-CS se necesitaba por lo menos un día y medio, mientras que PGM tomó varias horas y
las 50 muestras podrían ser analizados simultáneamente ( Tabla 4 ). Una posible ventaja de PCR-CS
es la exactitud en la determinación de especies. Las secuencias obtenidas de este método se lee
directamente de cromatogramas y muy fiable, mientras que las tuberías de NGS programas
bioinformáticos distintos parámetros ajustables tienen en sus guiones y el investigador decide sobre
la configuración más o menos conservadoras. Un ejemplo de este inconveniente, de NGS podría ser
la merluza detectado en nuestro estudio. De PCR-CS sólo se Merluccius paradoxus
se resolvió hasta el nivel de especie porque en bases de datos de varias especies dentro del género Merluccius
exhibir secuencia de nucleótidos idéntica en el 16S rDNA fragmento amplificado en este estudio.
Esto es claro en NBLAST manual que proporciona idéntica E-valor para los partidos con diferentes
especies. Sin embargo, los resultados PGM obtenidos directamente de la herramienta BLAST dentro
QIIME recuperar una especie de estas secuencias. Comprobar manualmente las secuencias de
FASTA fi les hemos visto que, efectivamente, es el mismo caso que en la PCR-CS, y de hecho el
fragmento 16S rDNA empleado no es lo suficientemente informativo para distinguir entre Merluccius especies.
trazabilidad de los alimentos, especialmente en mezclas de especies complejas. Por el contrario,
Algunas discrepancias entre los métodos de PCR PGM-CS y podría ser debido a los sesgos
inherentes a la nueva tecnología, que no está completamente desarrollado aún. Para las secuencias
de ARNr 16S, Salipante et al. (2014) descubiertos sesgos fi especie-específicas en las tasas de error
de truncamiento y leer el estudio de las comunidades bacterianas. Un sesgo hacia rica en
AT-genomas en la metodología Ion Torrent fue descrito en Codorniz et al. (2012) . En nuestro estudio
hemos encontrado que las secuencias obtenidas para las diferentes especies exhiben
consistentemente mayor AT-contenido para PGM que para la metodología de PCR-CS ( Tabla 3 ).
Este sesgo observado podría estar relacionada con las diferencias observadas entre los resultados
de PGM y PCR-CS. Por otro lado, se encontró mucho más alta proporción de ADN humano de
algunas muestras con PGM que con PCR-CS. El ADN humano se considera una contaminación
externa inadvertidamente adquirido durante o después de la elaboración de caramelo, y no un
verdadero ingrediente de hecho. Tales huellas de ADN, transferidos posteriormente al producto,
pueden ser menos degradado que verdaderos ingredientes de modo que constituyen
635
plataforma de PGM
- tiempo corto para el análisis (varias muestras se pueden procesar simultáneamente)
- Posibilidad de estimar las proporciones de cada especie
- Superior profundidad de análisis (detección de trazas mínimas)
- Aunque es caro hoy en día, el costo / muestra está disminuyendo
- sesgos fi c Especies especí en la tasa de error y truncamiento leer
- efectos poco claros relacionados con el AT-contenido
- Aún no fiable análisis bioinformático (necesidad de revisión del manual aún)
una mejor plantilla para la polimerasa y cebadores en la PCR cuando se realiza con PGM. En
general, nuestros datos apoyan la necesidad de herramientas de PGM a mejorarse antes de que
puedan ser aplicados en el análisis de alimentos de rutina. Liu et al. (2013) recomendado un
refinamiento fi de bases de datos genéticas, así como las tuberías utilizadas para el análisis de la
bioinformática de datos, para aumentar la gama de aplicaciones NGS.
Otro punto de inflexión en el diseño de estudios con etapas de PCR es la elección de cebadores.
Un equilibrio debe existir entre el fi cidad de los cebadores, que debe ser su fi ciente para anclar bien
a través de todas las especies objetivo e igualmente para un caso ideal; y la universalidad, que
debería ser suficiente para amplificar todas las especies que se pueden encontrar en el producto ( Wilcox
et al., 2013 ). Mientras que el par de cebadores elegidos en este caso ya había demostrado ser útil
para esta tarea ( Horreo et al, 2013.; Muñoz-Colmenero et al., 2016 de la clonación), algunas
desventajas pueden surgir de su uso en la trazabilidad utilizando métodos NGS. El amplicón objetivo
en este estudio fue necesariamente corto debido a que las muestras fueron altamente procesados, y
después de pasar los filtros de calidad de PGM analiza, algunas lecturas eran aún más corto. El
acortamiento de la lee en se ha observado en otros estudios que utilizan la plataforma PGM
muestras de ADN degradadas ( Zaiko et al., 2015A ), Y el problema es que los fragmentos de ADN
demasiado cortos no son lo suficientemente potente como para taxonómico identificación a nivel de
especie. marcadores adicionales se podrían usar, la combinación de las diferentes secuencias para
análisis más robustos ( Hadziavdic et al., 2014 ). Alternativamente, los ensayos con fragmentos más
largos podrían ser realizadas para el aumento de la información taxonómica de los amplicones ( Zaiko
et al., 2015A ).
Tomando todo lo anterior en cuenta esta metodología parece ser prematuro aún para su uso en
podría ser un buen método para detectar rastros en los alimentos menos complejo, o menos alimentos
procesados ​que permiten la amplificación de fragmentos de ADN más largos taxonómicamente más
informativo. La herramienta PGM puede ser una solución fantástica en estos casos, ahorrando mucho
tiempo y reduciendo el costo por muestra.
El conflicto de intereses
Los autores no divulgan ninguna financieros y financiera no fi interés en competencia.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen la ayuda de Daniel Serna Fuente (Unidad de Secuenciación de la Univ.
De Oviedo). Este estudio fue apoyado por el Principado de Asturias de Grant Grupin-2014-093, y la
Fundación Mapfre, España (SV13-MAPFRE-1). MM-C tiene un Natl. Español Grant (FPU
AP-2010-5211).
636 M. Muñoz-Colmenero et al. / Food Chemistry 214 (2017) 631-636

Apéndice A. Los datos complementarios halibut cultivado empaquetado ( Hippoglossus hippoglossus) sobre la base de ADNr 16S-DGGE.
Microbiología de los Alimentos, 24, 362-371 .

Keith, CS, Hoang, DO, Barrett, BM, Feigelman, B., Nelson, MC, tailandés, H., et al.
Los datos complementarios asociados a este artículo se pueden encontrar, en la versión en (1993). análisis de la secuencia Partia1 de 130 clones de cDNA de maíz seleccionadas al azar.

línea, en http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016. Fisiología Vegetal, 101, 329-332 .

Kelly, S., Heaton, K., y Hoogewerff, J. (2005). Buscando el origen geográfico de los alimentos:
07,121 .
La aplicación de múltiples elementos y el análisis multi-isótopo. Tendencias en Ciencia y Tecnología, 16
Alimentación, 555-567 .
referencias Lipton, CR, Dautlick, JX, Grothaus, GD, Hunst, PL, Magin, KM, Mihaliak, CA,
et al. (2000). Directrices para la validación y uso de inmunoensayos para la determinación de proteínas
introducidas en los cultivos de biotecnología mejorada e ingredientes alimentarios derivados. Alimentos e
Ardura, A., Horreo, JL, Hernández, E., Jardon, A., Pola, IG, Martínez, JL, et al.
Inmunología agrícola, 12, 153-164 .
(2012). análisis forense de ADN revela uso de alto nivel trófico fi marina sh en la acuicultura comercial comidas
Liu, S., Li, Y., Lu, J., Su, X., Tang, M., Zhang, R., et al. (2013). SOAPBarcode: Revelando
de peces. Fisheries Research, 115-116, 115-120 .
biodiversidad de artrópodos a través del conjunto de secuencias de Illumina escopeta de amplicones de PCR. Methods
Baker, C. (2014). Pierce Laboratorio, Departamento de Organísmica y Biología Evolutiva.
in Ecology and Evolution, 4, 1142-1150 .
Universidad Harvard. ccmbaker@fas.harvard.edu .
Mackie, IM, Pryde, SE, Gonzales-Sotelo, C., Medina, I., Pérez-Martín, R., Quinteiro,
Barling, D., Sharpe, R., y Lang, T. (2009). Trazabilidad y éticas preocupaciones en el Reino Unido
J., et al. (1999). Desafíos en la identificación de especies de conservas de pescado. Tendencias en Ciencia y Tecnología,
la cadena trigo-pan: A partir de la seguridad alimentaria a la procedencia de la transparencia.
10 Alimentación, 9-14 .
Revista Internacional de Sostenibilidad Agrícola, 7, 261-278 .
Martin, M. (2011). Cutadapt elimina secuencias adaptadoras de alto rendimiento
Caporaso, GJ, Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, FD, Costello, E.
secuenciación lee. EMBnetjournal. América del Norte, 1.7. http: //journal.embnet. org / index.php / embnetjournal
K., et al. (2010). QIIME permite el análisis de los datos de secuenciación comunidad de alto rendimiento. Métodos
/ article / view / 200/479 .
Naturaleza, 7, 335-336 .
Muñoz-Colmenero, M., Martínez, JL, Roca, A., & Garcia-Vázquez, E. (2016).
Carvalho, DC, Palhares, RM, Drummond, MG, y Frigo, la tuberculosis (2015). DNA
La detección de diferentes especies de animales de ADN en productos de caramelo comerciales.
códigos de barras de la identi fi cación de productos del mar en el sur de Brasil comercializado: Un programa forense
Journal of Food Science. http://dx.doi.org/10.1111/1750-3841.13225 (en prensa).
reguladora gubernamental. Control de Alimentos, 50, 784-788 .
Codornices, MA, Smith, M., Coupland, P., Otto, TD, Harris, SR, Connor, TR, et al.
Chang, A., Chung-Hui, T., y Min-ye, C. (2013). La creación de valor a partir de una trazabilidad de los alimentos
(2012). Una historia de tres plataformas de secuenciación de nueva generación: Comparación de Ion Torrent,
sistema basado en un modelo jerárquico de los rasgos de la personalidad del consumidor. British Food Journal, 115, 1361-1380
Pacífico Biociencias y Illumina MiSeq secuenciadores. BMC Genomics, 13,
.
341 .
Charlebois, S., Sterling, B., Haratifar, S., y Naing, SK (2014). Comparación de mundial
Reis-Santos, P., Gillanders, BM, Tanner, SE, Vasconcelos, RP, ELSDON, TS, y
alimentos regulaciones y requisitos de trazabilidad. Exámenes exhaustivos en Ciencias de los Alimentos y Seguridad
Cabral, HN (2012). La variabilidad temporal en los estuarios de los otolitos de peces ngerpints fi elementales:
Alimentaria, 13, 1104-1123 .
Implicaciones para las evaluaciones de conectividad. Estuario, costeras y de plataforma Science, 112, 216-224 .
Costa Leal, M., Pimentel, T., Ricardo, F., Rosa, R., y Calado, R. (2015). Mariscos
trazabilidad: necesidades actuales, las herramientas disponibles, y los retos biotecnológicos para el origen de certi fi
S ahan, Y., Basoglu, F., y Gücer, S. (2007). análisis ICP-MS de una serie de metales
cación. Trends in Biotechnology, 33, 331-336 .
(A saber: Mg, Cr Co, Ni, Fe, Cu, Zn, Sn, Cd y Pb) en muestras de negro y verde oliva de Bursa, Turquía. Food
Diaz-Sanchez, S., Hanning, I., Pendleton, S., y D'Souza, D. (2013). Próxima generación
Chemistry, 105, 395-399 .
secuenciación: El futuro de la genética molecular en la producción de aves de corral y la seguridad alimentaria. Poultry
Salipante, SJ, Kawashima, T., Rosenthal, C., Hoogestraat, DR, Cummings, LA,
Science, 92, 562-572 .
Sengupta, DJ, et al. (2014). Comparación de rendimiento de iluminación y plataformas de secuenciación Ion
Galal-Khallaf, A., Osman, AGM, Carleos, CE, García-Vázquez, E., y Borrell, YJ
Torrent de próxima generación para rRNA basado 16S bacteriana comunidad pro fi ling. Applied and
(2016). Un estudio de caso para la evaluación de fi sh trazabilidad en formulaciones de alimentos acuícolas egipcios
Environmental Microbiology, 80, 7583-7591 .
utilizando la pirosecuenciación y metabarcoding. Fisheries Research, 174,
Sardaro, SML, Marmiroli, M., Maestri, E., y Marmiroli, N. (2013). Genético
143-150 .
caracterización de variedades de tomate italiana y su trazabilidad en los productos alimenticios de tomate. Ciencias de la
Germain, C. (2003). aplicación de trazabilidad en los países en desarrollo, su
Alimentación y Nutrición, 1, 54-62 .
posibilidades y sus limitaciones: algunos estudios de casos disponibles a partir http: //
Wilcox, TM, McKelvey, KS, joven, MK, Jane, SF, Lowe, WH, Whiteley, AR,
ftp.fao.org/es/esn/food/traceability.pdf . Consultado el 11 Ene 2016.
et al. (2013). la detección robusta de especies raras utilizando ADN del medio ambiente: La importancia de
Grada, A., y Weinbrecht, K. (2013). La secuenciación de próxima generación: Metodología y
imprimación especificidad. PLoS ONE, 8, e59520 .
Solicitud. Journal of Investigative Dermatology, 133, E11 .
Woolfe, M., y Primrose, S. (2004). forense de alimentos: utiliza el ADN para el combate
Hadziavdic, K., Lekang, K., Lanzen, A., Jonassen, I., Thompson, EM, y Troedsson, C.
descripción errónea y el fraude. Trends in Biotechnology, 22, 222-226 .
(2014). Caracterización del gen 18S rRNA para el diseño especí fi cebadores universales eucariotas c. PLoS
Zaiko, A., Martínez, JL, Ardura, A., Clusa, L., Borrel, YJ, Samuiloviene, A., et al.
ONE, 9, e87624 .
(2015A). La detección de especies molestas utilizando NGST: deficiencias Metodología y su posible aplicación
Hall, JM, Parrish, CC, y Thompson, RJ (2002). regula ácido eicosapentaenoico
en el control del agua de lastre. Investigación del Medio Marino, 112, 64-72 .
Vieira ( Placopecten magellanicus) membrana fluidez en respuesta al frío. El Boletín Biológica, 202, 201-203 .

Zaiko, A., Martínez, JL, Schmidt-Petersen, J., Ribičić, D., Samuiloviene, A., y García
Hoff, K. (2009). El efecto de la secuencia de errores en la predicción de genes metagenomic.
Vázquez, E. (2015b). enfoque Metabarcoding para la vigilancia del agua de lastre
BMC Genomics, 10, 520 .
- Una solución ventajosa o un desafío torpe? Boletín de Contaminación Marina,
Horreo, JL, Ardura, A., Pola, IG, Martínez, JL, y García-Vázquez, E. (2013).
92, 25-34 .
cebadores universales para la autenticación de las especies de producto alimenticio animal en una única reacción en cadena de
Zarkasi, KZ, Abell, GCJ, Taylor, RS, Neuman, C., Hatje, E., Tamplin, ML, et al.
la polimerasa. Revista de la Ciencia de la Alimentación y la Agricultura, 93,
(2014). caracterización basada en la pirosecuenciación de bacterias gastrointestinales de salmón del Atlántico ( Salmo
654-661 .
salar L.) dentro de un sistema de maricultura comercial.
Hovda, MB, Sivertsvika, M., Lunestadb, BT, Lorentzenc, G., y Rosnesa, JT (2007).
Journal of Applied Microbiology, 117, 18-27 .
Caracterización de la población bacteriana dominante en modi atmósfera fi ed