MAKALAH BIOLOGI SEL

HOMOLOGI FUNGSI GEN KNAT1 ( Knotted 1– like Arabidopsis thaliana)

PADA ANGGREK BULAN Phalaenopsis amabilis (L.) Bl. DENGAN
MEDIATOR Agrobacterium tumefaciens

DOSEN :

Ika Maruya Kusuma SP, M.Si

NAMA KELOMPOK

Anindia Purnama 13330023

Riska Choirunnisa 13330024

Ayudita Elmira 133300

Filia Delfia Tahu 13330043

Fandy RezaSetiadi 13330045

Intan Wahyuni Saleh 14330152

FAKULTAS FARMASI
INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL
2017
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah
memberikan rahmat ddan kesempatan, sehingga kami dapat menyelesaikan
makalah yang berjudul “HOMOLOGI FUNGSI GEN KNAT1 ( Knotted 1–
like Arabidopsis thaliana) PADA ANGGREK BULAN Phalaenopsis
amabilis (L.) Bl. DENGAN MEDIATOR Agrobacterium tumefaciens”
dengan baik tanpa ada halangan yang berarti.Makalah ini telah kami selesaikan
dengan maksimal berkat kerjasama dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh
karena itu kami sampaikan banyak terima kasih kepada segenap pihak yang
telah berkontribusi secara maksimal dalam penyelesaian makalah ini.

Diluar itu, penulis sebagai manusia biasa menyadari sepenuhnya bahwa

masih banyak kekurangan dalam penulisan makalah ini, baik dari segi tata
bahasa, susunan kalimat maupun isi. Oleh sebab itu dengan segala kerendahan
hati , kami selaku penyusun menerima segala kritik dan saran yang membangun
dari pembaca.

Penulis
Jakarta, 11 Desember 2017
 BAB I

PENDAHULUAN

I.A Latar Belakang

Phalaenopsis amabilis adalah anggrek alam Indonesia yang mampu berbunga

sepanjang tahun dengan keistimewaan memiliki bunga yang tahan lama, habitus kuat, dan
mudah dipelihara. Dalam genus Phalaenopsis, Ph. amabilis berperan penting sebagai induk
silangan dan telah menghasilkan beraneka ragam hibrida unggulan. Dengan keunggulan yang
dimiliki tersebut maka pemerintah Indonesia menobatkan anggrek ini sebagai “Puspa
Pesona” (Djaafarer, 2006). Sebagai tanaman komersial, pemuliaan tanaman anggrek sangat
diperlukan. Metode pemuliaaan konvensional dengan hibridisasi dan diikuti penggunaan
teknik kultur in-vitro serta fusi protoplas belum dapat diprediksi hasilnya mengingat siklus
hidup tanaman anggrek yang lama serta sifat unggul tanaman adalah poligenik, sehingga
diperlukan metode rekayasa genetik dengan cara memasukkan gen spesifik ke dalam sistem
biologi tanaman dengan tujuan tertentu misalnya untuk ketahanan terhadap hama, penyakit,
gulma dan stress lingkungan; modifikasi sistem metabolisme untuk industri obat dan yang
tidak kalah pentingnya bahwa dengan rekayasa gen tanaman, bermanfaat sebagai sumber
informatif untuk mempelajari fungsi gen dan regulasi dari proses perkembangan dan fisiologi
tanaman.

Metode transformasi gen pada tanaman dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu
secara langsung (Direct Mediated Gene Transfer) menggunakan microprojectile
bombardment (particle-mediated), microinjection, perlakuan kimiawi pada protoplas (PEG-
mediated), vesicle fusion dan elektroporasi maupun tidak langsung dengan mediator
Agrobacterium.

Gen KNAT1 (Knotted1-like Arabidopsis thaliana) adalah kelompok gen KNOX kelas
1 yang berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dari tanaman Arabidopsis thaliana dan diketahui
berfungsi mengatur pembentukan, perkembangan dan pemeliharaan meristem ujung batang
agar sel-selnya tetap meristematik. Overekspresi gen KNAT1 pada Arabidopsis diketahui
menyebabkan terbentuknya tunas-tunas adventif baru pada permukaan atas dan bawah daun
serta bentuk daun menjadi berlobi.
 Berdasarkan asumsi bahwa gen-gen yang berperan dalam proses pertumbuhan dan
perkembangan tanaman Arabidopsis memiliki kesamaan dengan tanaman anggrek maka studi
homologi pada tanaman anggrek dengan menggunakan gen KNAT1 Arabidopsis akan sangat
membantu dalam identifikasi gen penentu yang berperan dalam proses pertumbuhan tunas
yang selanjutnya akan mempengaruhi daur hidup tanaman Ph. Amabilis.

II.B Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud dengan Gen KNATI?

2. Apa pengaruh Gen KNATI terhadap rekayasa genetika padda anggrek?

II.C TUJUAN PENULISAN

1. Untuk mengetahui yang dimaksud dengan Gen KNATI

2. Untuk mengetahui apa saja pengaruh Gen KNATI terhadap rekayasa genetika pada
anggrek

II.D MANFAAT PENEITIAN

Dapat menambah data ilmiah mengenai Rekayasa Genetika pada Tanaman Anggrek.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.A Definisi

II.A.1 Definisi Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika (Inggris: genetic engineering) dalam arti paling luas adalah
penerapan genetika untuk kepentingan manusia. Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaan
hewanatau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan. Demikian pula
penerapan mutasi buatan tanpa target dapat pula dimasukkan. Walaupun demikian,
masyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu
penerapan teknik – teknik biologi molekular untuk mengubah susunan genetik dalam
kromosom atau mengubah sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu.

Mahluk hidup terdiri atas gen, gen mengandung protein yang menjadi pusat atau
sumber informasi. Gen merupakan pembawa informasi turun-temurun dari generasi ke
generasi dan bertanggung jawab atas pewarisan genotipik (sifat yang diturunkan) dan
fenotipik (sifat yang tampak) dari seorang individu.

Secara ilmiah, rekayasa genetika adalah manipulasi atau perubahan susunan genetik
dari suatu organisme. Rekayasa genetika merupakan proses buatan/sintetis dengan
menggunakan Teknologi DNA rekombinan. Hasil dari rekayasa genetika adalah sebuah
organisme yang memiliki sifat yang diingingkan atau organisme dengan sifat unggul,
organisme tersebut sering disebut sebagai organisme transgenik. Rekayasa genetika sangat
terkait dengan bidang bioteknologi lain seperti kloning hewan dan kloning manusia.

Objek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai

dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan.
Bidang kedokteran dan farmasi paling banyak berinvestasi di bidang yang relatif baru ini.
Sementara itu bidang lain, seperti ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanian (termasuk
peternakandan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk
mengembangkan bidang masing – masing.
 Ilmu terapan ini dapat dianggap sebagai cabang biologi maupun sebagai ilmu-ilmu
rekayasa (keteknikan). Dapat dianggap, awal mulanya adalah dari usaha-usaha yang
dilakukan untuk menyingkap material yang diwariskan dari satu generasi ke generasi yang
lain. Ketika orang mengetahui bahwa kromosom adalah material yang membawa bahan
terwariskan itu (disebut gen) maka itulah awal mula ilmu ini. Tentu saja, penemuan
struktur DNA menjadi titik yang paling pokok karena dari sinilah orang kemudian dapat
menentukan bagaimana sifat dapat diubah dengan mengubah komposisi DNA, yang adalah
suatu polimer bervariasi.

Tahap – tahap penting berikutnya adalah serangkaian penemuan enzim restriksi

(pemotong) DNA, regulasi (pengaturan ekspresi) DNA (diawali dari penemuan operon
laktosa pada prokariota), perakitan teknik PCR, transformasi genetik, teknik peredaman gen
(termasuk interferensi RNA), dan teknik mutasi terarah (seperti Tilling). Sejalan dengan
penemuan-penemuan penting itu, perkembangan di bidang biostatistika, bioinformatika dan
robotika / automasi memainkan peranan penting dalam kemajuan dan efisiensi kerja bidang
ini.

II.A.2 Definisi Anggrek Vanda Tricolor

Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali adalah anggrek alam pulau Bali, salah
satu sumber kekayaan hayati pulau Bali yang perlu mendapat perhatian kita semua. Spesies
ini merupakan induk persilangan dari anggrek Vanda hibrida yang yang diperjualbelikan
secara komersial saat ini dan dengan harga yang relatif tinggi. Dwiyani (2012) menndapatkan
bahwa forma Bali memiliki karakter spesifik dibandingkan forma Merapi dan forma Jawa
Barat, yakni ukuran bunga dan buah yang lebih besar serta totol-totol dan labelum yang
berwarna ungu kemerahan, sementara forma Merapi berwarna ungu dan forma Jawa Barat
berwarna coklat. Lestari (2010) melaporkan bahwa forma Bali memiliki tingkat keharuman
bunga yang lebih tinggi dibanding forma Merapi.

Salah satu permasalahan dalam budidaya anggrek, khususnya genus Vanda, adalah
masa vegetatif yang panjang, sehingga saat (waktu) pembungaan (flowering) membutuhkan
waktu yang relative lama. Vanda tricolor Lindl. var. suavis membutuhkan waktu kurang
lebih 5 (lima) tahun setelah disemai untuk menghasilkan bunga pertama kali, padahal sebagai
tanaman hias, bunga merupakan organ tanaman penting yang dinikmati nilai estetikanya.
Perbaikan sifat-sifat (karakter) tanaman dapat dilakukan secara konvensional melalui plant
breeding maupun secara lebih modern dengan rekayasa genetika. Hasil yang diperoleh dari
kedua cara ini sama, yakni
individu tanaman baru dengan struktur gen yang baru. Perbedaan yang paling menyolok dari
kedua cara tersebut adalah dari segi waktu, dimana melalui cara konvensional diperlukan
waktu yang lebih panjang untuk mendapatkan individu baru tersebut sedangkan melalui
rekayasa genetika diperlukan waktu yang lebih singkat.

II.B Metode Transformasi

a. Metode Transformasi Langsung

Injeksi, macroinjection, teknik / biolistics, elektroporasi, transformasi dimediasi

liposome, dan transformasi dengan menggunakan bahan kimia seperti serat silikon karbida
pemboman.

b. Metode Transformasi Tidak Langsung

Transformasi berbasis vektor, vektor meliputi plasmid bakteri (dimediasi mentransfer

Agrobacterium), lamba fag, dan bakteriofag (partikel fag yang sangat efisien dalam
mengubah).

II.C Klasifikasi Macam – Macam Jenis Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika merupakan salah satu pengembangan dari teknologi reproduksi

dalam upaya pengubahan gen-gen sehingga dihasilkan oganisme dengan kualitas mutu yang
lebih baik. Ada beberapa macam rekayasa genetika, diantaranya meliputi:

1. Rekombinasi DNA
Rekombinasi DNA merupakan teknik pemisahan dan penggabungan DNA dari satu
spesies dengan DNA dari spesies lain dengan tujuan mendapatkan sifat baru yang lebih
unggul. Berikut ini beberapa produk yang dihasilkan dari rekombinasi gen.

a. Pembuatan Insulin
Insulin ini dihasilkan dari rekombinasi DNA sel manusia dengan plasmid
bakteri E.Coli. Insulin yang dihasilkan lebih murni dan baik diterima oleh tubuh
 manusia karena mengandung protein manusia dibandingkan dengan insulin yang
disintesis dari gen pankreas hewan.
b. Pembuatan Vaksin Hepatitis
Vaksin hepatitis dihasilkan dari rekombinan DNA sel manusia dengan sel
ragi Saccharomyces. Vaksin yang dihasilkan tersebut berupa virus yang dilemahkan
dan jika disuntikkan ke dalam tubuh manusia akan membentuk antibodi sehingga
kebal terhadap serangan hepatitis.

2. Fusi Sel

Istilah lain fusi sel dikenal dengan nama teknologi hibridoma. Fusi sel merupakan
peleburan dua sel yang berbeda menjadi satu kesatuan menjadi protein yang sangat baik yang
mengandung gen asli dari keduanya yang disebut hibridoma. Hibridoma sering digunakan
untuk memperoleh antibodi dalam pemeriksaan kesehatan dan pengobatan. Misalnya kita
ambil contoh fusi sel manusia dengan sel tikus. Tujuan fusi tersebut ialah menghasilkan
hibridoma berupa antibodi yang mampu membelah dengan cepat. Sifat tersebut didapatkan
dari sel manusia berupa antibodi yang difusikan dengan sel kanker tikus berupa mieloma
yang mampu membelah dengan cepat.

3. Transfer Inti (Kloning)

Kloning merupakan suatu proses reproduksi yang bersifat aseksual untuk

menciptakan replika yang tepat bagi suatu organisme. Teknik kloning akan menghasilkan
suatu spesies baru yang secara genetik persis sama dengan induknya yang biasanya
dikerjakan di dalam laboratorium. Spesies baru yang dihasilkan tersebut disebut klon. Klon
tersebut diciptakan oleh suatu proses yang disebut transfer inti sel somatik. Transfer inti sel
somatik ini merupakan suatu proses yang mengacu pada transfer inti dari sel somatik ke sel
telur. Sel somatik tersebut adalah semua sel di tubuh kecuali kuman. Adapun mekanismenya,
inti sel somatik akan dihapus dan dimasukkkan ke dalam telur yang tidak dibuahi yang
memiliki inti yang telah dihapus. Telur dengan intinya tersebut akan tetap dijaga hingga
menjadi embrio. Embrio ini kemudian akan ditempatkan di dalam ibu pengganti dan
berkembang di dalam ibu pengganti.
Keberhasilan kloning adalah kloning pada domba “Dolly”. Domba Dolly direproduksi
tanpa bantuan domba jantan, melainkan diciptakan dari sebuah kelenjar susu yang diambil
dari seekor domba betina. Kelenjar susu dari domba finndorset dimanfaatkan sebagai donor
inti sel dan sel telur domba blackface sebagai resipien. Penggabungan kedua sel tersebut
memanfaatkan tegangan listrik 25 Volt yang pada akhirnya terbentuk fusi antara sel telur
domba blackface tanpa nukleus dengan sel kelenjar susu domba finndorsat. Di dalam tabung
percobaan hasil fusi ini akan berkembang menjadi embrio yang selanjutnya akan dipindahkan
ke rahim domba blackface. Sehingga spesies baru yang dilahirkan ialah spesis dengan ciri
yang identik dengan domba finndorset.

II.D Proses dan Teknik Rekayasa Genetika

Secara sederhana proses rekayasa genetika dapat meliputi tahapan – tahapan berikut ini :

 Mengindetifikasikan gen dan mengisolasi gen yang diinginkan,

 Membuat DNA/AND salinan dari RNAd,
 Pemasangan cDNA pada cincin plasmid,
 Penyisipan DNA rekombinan kedalam tubuh/sel bakteri,
 Membuat klon bakteri yang mengandung DNA rekombinan,
 Pemanenan produk.

II.D.1 Proses Rekayasa Genetika

Proses rekayasa genetika diatas, praktiknya mengadopsi prinsip dari teknik rekayasa beikut
ini.

1. Kloning Gen

Kloning gen merupakan tahapan awal dari rakayasa genetika. Adapun tahapan-
tahapan dalam kloning gen, diataranya pemotongan DNA menjadi fragmen-fragmen dengan
ukuran beberapa ratus hingga ribuan kb (kilobase), kemudian fragmen tersebut dimasukkan
ke dalam vektor bakteri untuk kloning. Berbagai macam vektor disesain untuk membawa
DNA dengan panjang yang berbeda. Setiap vektor hanya mengandung satu DNA yang
kemudian teramplifikasi membentuk suatu klon di dalam dinding bakteri. Dari setiap klon
sejumlah fragmen DNA akan diisolasi yang kemudian akan diekspresikan. DNA rantai
tunggal akan diubah menjadi rantai ganda dengan bantuan DNA polimerase. Fragmen DNA
yang dihasilkan selanjutnya dikloning ke dalam plasmid untuk menghasilkan bank cDNA.
2. Sequensing DNA

Sekuensing merupakan teknik penentuan urutan basa suatu fragmen DNA yang
membutuhkan proses dan waktu yang lama. Saat ini proses ini sudah bersifat automatis,
dalam artian sekuensing yang dilakukan memungkinkan dalam skala industri hingga ribu
kilobasa per hari.

3. Amplifikasi gen secara in-vitro

Proses amplifikasi DNA untuk mensitesis komplementer suatu fragmen DNA yang
dimulai dari suatu rantai primer dikenal dengan teknik PCR (Polimerase Chain Reaction).

4. Konstruksi Gen

Setiap gen terdiri dari promotor (daerah yang bertanggungan jawab utuk transkripsi
gen yang berakhir pada wilayar terminator), gen pendanda dipilih (gen yang berperan sebagai
resistensi antibiotik yang membantu dalam memebedakan perubahan sel), dan terimanator.
Konstruksi gen mengandung sedikitnya daerah promotor, daerah transkrip, dan daerah
terminator. Oleh sebab itu, konstruksi gen kemudian disebut vektor ekspresi.
Konstruksi gen mengimplikasikan penggunaan elemen-elemen seperti enzim restriksi
yang memotong DNA pada daerah spesifik, sistesis nukleotida secara kimiawi, amplifikasi
fragmen DNA secara in vitro menggunakan teknik PCR, serta menyambungn fragmen DNA
yang berbeda dengan ikatan kovalen menggunakan enzim ligase. Kemudian fragmen tersebut
ditambahkan dalam plasmid yang selanjutnya ditransfer ke dalam bakteri membentuk klon
bakteri. Klon bakteri ini akan diseleksi dan diamplifikasi.
Peambahan elemen dalam konstruksi gen bergantung pada tujuan eksperimen,
terutama dimana jenis sel konstruksi tersebut akan diekspresikan.

5. Transfer gen ke dalam sel

Suatu gen hasil isolasi dapat ditranskripsikan secara in vitro dan mRNA nya juga
dapat ditranskripsikan pada suatu sistem bebas sel. Untuk dikodekan secara efektif dan
ditranslasikan menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel yang secara alami
dapat mengandung semua faktor yang diperlukan dalam proses transkripsi dan translasi.
Transfer gen sendiri dalam praktiknya terdiri atas variasi teknik, diantaranya fusi sel,
penggunaan senyawa kimia, elektroporasi, mikroinjeksi, dan injeksi menggunakan vektor
virus.
II.E Manfaat Rekayasa Genetika
Perkembangan rekayasa genetika memberikan banyak manfaat bagi manusia dalam
berbagai aspek kehidupan. Adapun manfaat rekayasa genetika jika ditinjau berdasarkan
aspeknya, meliputi:

1. Bidang Industri

Di bidang industri, prinsip rekayasa genetika dimanfaatkan dalam upaya

pengkloningan bakteri untuk beberapa fungsi tertentu seperti melarutkan logam-logam
langsung dari dalam bumi, menghasilkan bahan mentah kimia seperti etilen yang diperlukan
untuk pembuatan plastik, menghasilkan bahan kimia yang digunakan sebagai pemanis pada
pembuatan berbagai macam minuman, dan lain sebagainya.

2. Bidang Farmasi

Dalam bidang farmasi, rekayasa genetika dimanfaatkan dalam usaha pembuatan

protein yang sangat dibutuhkan untuk kesehatan. Protein ini merupakan gen hasil
pengkloningan bakteri yang berperan dalam mengongtrol sintesis obat-obatan yang jika
diproduksi secara alami akan membutuhkan biaya yang mahal.

3. Bidang Kedokteran

Lahirnya rekayasa genetika memberikan banyak manfaat dalam perkembangan ilmu

medis, diantaranya:

a. Pembuatan Insulin

Insulin yang dulunya disintesis hewan mamalia sudah dapat dihasilkan dengan
melakukan pengkloningan bakteri. Insulin yang dihasilkan ini pun jauh lebih baik dan
lebih dapat diterima oleh tubuh manusia dibandigkan insulin yang disintesis dari
hewan.

b. Pembuatan Vaksin terhadap Virus AIDS

Mengingat AIDS merupakan virus yang berbahaya dan dapat menyerang

sistem kekebalan tubuh, maka dalam upaya pencegahan penyakit tersebut peneliti
membuat suatu vaksin memanfaatkan rekayasa genetika dalam upaya proteksi diri
terhadap penularan virus AIDS.
 c. Terapi Gen

Rekayasa genetika juga dimanfaatkan dalam upaya terapi kelainan genetik

dengan disisipkannya beberapa gen duplikat secara langsung ke dalam sel seseorang
yang mengalami kelainan genetis.

4. Bidang Pertanian

Di bidang pertanian, rekayasa genetika banyak dimanfaatkan dalam upaya penyisipan

gen ke dalam sel sel tumbuhan sehingga memberikan banyak keuntungan seperti:

 Menghasilkan tanaman yang mampu menangkap cahaya dengan lebih efektif untuk
meningkatkan efisiensi fotosintesis.
 Menghasilkan tanaman yang mampu menghasilkan pestisida sendiri.
 Menggantikan pemakaian pupuk nitrogen yang mahal namun banyak digunakan
dengan melakukan fiksasi nitrogen secara alamiah seperti pada tanaman padi.
 Dapat digunakan untuk menadapatkan tanaman baru yang lebih menguntungkan lewat
pencangkokan gen, seperti pada golongan solanaceae.
5. Bidang Peternakan

Serupa halnya dengan pemanfaatan rekayasa genetika di bidang pertanian, di bidang

peternakan juga dilakukan penyisipan gen ke dalam sel-sel hewan tertentu dengan
menerapkan prinsip rekayasa genetika. Hewan yang paling banyak digunakan ialah sapi.
Rekayasa di bidang peternakan memberikan banyak manfaat, seperti:

 Diperoleh vaksin yang dapat mencegah mencret ganas pada anak babi.
 Diperoleh vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku dan mulut, yang merupakan
penyakit ganas dan menular pada sapi, domba, kambing, rusa dan babi.
 Sedang dilakukan pengujian hormone pertumbuhan tertentu untuk sapi yang
diharapkan dapat meningkatkan produksi susu.

II.F Dampak Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika sangat berperan dalam pengembangan ilmu pengertahuan di

berbagai bidang kehidupan. Namun, penggunaan rekayasa genetika tidak memberikan
keuntungan semata melainkan juga timbul dampak tertentu yang tidak diinginkan. Adapun
dampak dari penerapan rekayasa genetika diantaranya, meliputi:
1. Tanaman transgenik tertentu dapat memungkinkan keracunan, alergi, perbedaan nutrisi
dan komposisi, serta adanya kemungkinan menyebabkan bakteri dalam tubuh manusia
menjadi resisten terhadap antibiotik tertentu.
2. Terlepasnya organisme transgenik di alam bebas tanpa pengawasan dapat menghasilkan
pencemaran biologis yang berdampak pada terganggunya ekosistem dan meningkatnya
prevalensi penyakit tertentu.
3. Menyisipkan DNA atau gen organisme lain yang tidak berkerabat, dianggap sebagai
pelanggaran terhadap hukum alam dan masih sulit di terima oleh masyarakat. Oleh sebab
itu, rekayasa genetika yang dilakukan pada manusia dianggap sebagai penyimpangan
moral dan pelanggaran etik.
 BAB III

METODE PENELITIAN

III.A Waktu dan Tempat Penelitian

II.A.1 Waktu

Penelitian berlangsung dari bulan Maret hingga Agustus 2014

II.A.2 Tempat

Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Udayana,

jalan Pulau Moyo Denpasar.

III.B Desain/Rancangan Penelitian

Gen pembungaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah PaFT (Phalaenopsis amabilis
Flowering locus T). Promoter yang digunakan adalah Ubiquitin, yang merupakan ‘strong
promoter’ untuk overekspresi suatu gen. Gen ketahanan terhadap higromisin yaitu
Higromisin Posphotransferase (hpt) digunakan sebagai gen penyeleksi transforman dan
disertakan dalam konstruksi gen. Konstruksi gen diperoleh dari Dr. Seonghoe Jang
(Academia Sinica, Biotechnology Center in Southern Taiwan) melalui Dr. Endang Semiarti
(Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada). Konstruksi gen dapat dilihat pada Gambar 1
(Sumber: Komunikasi pribadi Mercuriani, 2014).

Gambar 1. Konstruksi Gen yang digunakan dalam penelitian (Sumber: Komunikasi pribadi
Mercuriani, 2014)
III.C Populasi, Sampel, dan Teknik Sampling

Bunga Anggrek Vanda Tricolor yang ada di sekitar lingkungan peneliti akan menjadi
populasi penelitian. Sampel penelitian adalah Bunga Anggrek Vanda Tricolor. Teknik
sampling adalah dengan mengambil secara sak Bunga Anggrek Vanda Tricolor yang akan
digunakan dalam penelitian.

III.D Pengumpulan Data dan Teknik Analisis Data

Transformasi dilakukan secara in vitro dengan target berupa irisan pangkal batang
dari seedling yang berusia 12 bulan setelah semai. Eksplan irisan batang diprekultur pada
media New Phalaenopsis/NP (Islam et al. 1998) yang ditambah 2 ppm Benzyl adenine (BA)
tiga hari sebelum inokulasi. Eksplan direndam selama 1 atau 2 jam (perlakuan) pada suspensi
A.tumefaciens yang sudah membawa gen tersebut. Pada larutan suspensi bakteri ditambahkan
2 tetes tween serta asetosiringon (AS) dengan konsentrasi 0 ppm dan 25 ppm sebagai
perlakuan, sehingga ada 2 x 2 perlakuan kombinasi.
Selanjutnya, eksplan di ko-kultivasi selama 3 hari pada media NP dengan 2 ppm BA.
Setelah ko-kultivasi, eksplan dicuci dengan larutan cefotaxime 300 ppm, dibilas hingga
bersih dan ditanam kembali pada media NP + 2 ppm BA+ 50 ppm cefotaxime. Tahap ini
disebut tahap eliminasi. Eliminasi diulang 3 – 5 kali hingga eksplan benar benar terbebas dari
Agrobacterium. Selanjutnya eksplan dipelihara hingga tumbuh tunas dan akar (membentuk
plantlet). Plantlet kemudian diseleksi dengan jalan menanamnya pada media NP yang
ditambah 10 ppm higromisin. Plantlet yang bertahan hidup sampai 6 minggu pada media
higromisin disebut kandidat transforman. Kandidat transforman dihitung dan dipersentase
dari jumlah eksplan yang diinokulasi untuk setiap perlakuan.
Genom dari kandidat transforman (dari daunnya) diisolasi menggunakan metode
Doyle & Doyle (1990), selanjutnya dianalisis secara molekuler menggunakan metode PCR
dengan primer Ubiquitin(forward: 5'-TTGTCGATGCTCACCCTG-3') and TNos (reverse: 5'-
GATCTAGTAACATAGATGACACCGCG-3') yang akan mengamplifikasi fragmen
sepanjang 1,1 kb (Mercuriani et al., 2015). Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi sebagai
berikut: 94oC selama 5 menit (denaturasi awal), kemudian dilakukan 30 siklus yang terdiri
dari 94oC selama 45 detik (denaturasi), 59 oC selama 1 menit (annealing), dan 72oC selama
1 menit 30 detik (elongation). Pemanjangan waktu selama 5 menit dilakukan pada suhu
72oC, dan terakhir suhu dijaga pada 4oC. DNA hasil amplifikasi selanjutnya dicek dengan
elektroforesis dengan gel agarose 1%, kemudian divisualisasi dengan UV transluminator.
 DAFTAR PUSTAKA

1. www.wikipedia.com
2. http://www.biologi-sel.com/2013/05/rekayasa-genetika.html
3. http://www.ilmudasar.com/2017/04/Pengertian-Fungsi-Jenis-dan-
Proses-Rekayasa-Genetika-adalah.html