LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

STIKes MEGA REZKY MAKASSAR

PERCOBAAN V

PEMERIKSAAN MIKROSKOPIK DAN PENGECATAN GRAM

OLEH :
KELOMPOK 2
ARFIANI : 173145201074
SRI MULYANI PUTRI. A : 173145201038
RIRIN ALFITAH : 173145201062
ANGGELA VERAWATI : 173145201042
RESA PARASSA : 173145201057
NOVRIL FRANCO S : 173145201070
NUR SYAMSURIANI : 173145201054

KELAS : B

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN MEGA REZKY
MAKASSAR
2018
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Mikrobiologi merupakan suatu ilmu yang mempelajari kehidupan

mahkluk yang bersifat mikroskopik yang disebut mikroorganisme atau jasad

renik yaitu mahkluk yang mempunyai ukuran sel sangat kecil dimana setiap

selnya hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop (Fardiaz, 1992).

Mikrobiologi pangan merupakan ilmu yang mepelajari pola interaksi

antara mikroba dengan bahan pangan baik secara keseluruhan maupun

komponen bahan pangan secara sendiri-sendiri. Oleh karena itu pada

hakikatnya ilmu ini mempelajari masalah ekologi mikroba sebagai satu sistem,

dimana komponen – komponen bahan pangan dan sel-sel mikroba sebagai

sub-sistemnya yang berintraksi secara kompleks (Ali, 2012).

Satu sel jasad mikroba merupakan satu kesatuan hidup dimana satu sel

tersebut mengerjakan seluruh fungsi hidup jasad, oleh karena itu satu sel

mikroba dianggap sebagai satu jasad sedangkan satu sel jasad tingkat tinggi

merupakan satu kesatuan struktur dimana sel dari jasad tingkat tinggi ini

hanya mengerjakan fungsi sesuai dengan jaringan dimana sel tersebut berada

(Ali, 2011).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau

tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan

lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan
 spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, bakteri gram positif dan gram

negatif (Wikipedia, 2010).

1.2.Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dari percobaan ini adalah bagaimana cara

mengetahui bentuk morfologi dari bakteri dengan menggunakan metode

pengecatan gram, sederhana dan negative?

1.3. Tujuan Percobaan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah ;

1. Melakukan pemeriksaan mikroskopik bakteri.

2. Melakukan pengecatan bakteri, khususnya dapat membedakan bakteri

gram positif dan gram negative.

1.4. Manfaat Percobaan

Adapun manfaat pratikum ini adalah agar kita dapat mengetahui dan

mengamati perbedaan bakteri gram positif dan gram negatif. Serta mengetahui

bagaimana cara pengecetan bakteri Eschericila coli dan staphylococcus

aures. .
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Teori Umum

Menurut cohn, cat bakteri atau mikkroorganisme adalah suatu senyawa

organic yang mengandung gugus chromofor dengan gugus auxochrom yang

terikat dalam suatu cincin benzen. Sedang untuk mempelajari morfologi,

struktur, sifat – sifat kuman untuk membantu identifikasinya kuman perlu

diwarnai (Sujudi, 1993).

Studi tentang bakteri dimulai dengan tinjauan terhadap berbagai bakteri,

pada umumnya dikenal 3 bentuk yang berbeda, oleh sebab itu berdasrakan

bentuknya dapat dubagi menjadi tiga bagian, yaitu (Volk,1984):

a. Cocus (bulat)

b. Basil (batang)

c. Spiral (melingkar)

Bakteri merupakan mikroba uniseluler yang termasuk Schizomycetes.

Pada umumnya bakteri tidak memiliki klorofil, ada beberapa yang

fotosintetik dan reproduksi seksualnya secara pembelahan transversal atau

biner (Jutono, 1980).

Untuk tujuan pengidentifikasian mikroorganisme baik melalui

pemeriksaan langsung maupun tidak langsung. Pemeriksaan mikroskopik

lapisan tipis yang dibuat dari pus, spatum, urin, fases, cairan

serebrospinal,deringkali memungkinkan ahli bakteriologi untuk menentukan

organisme penyebabnya. Ara ini terutama bermanfaat pada meningitis,

tuberkolosis paru , pada saluran kencing, penyakit kelamin, gas gengreng dan

jamur dan dapat mebantu pada kasus pneumonia difteri dan pada

infeksipirulen Pada prosedur tersebut, pengecatan gram sangat bermanfaat

(Djide, 2005).

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak

mengadsorbsi atau membiaskan cahaya, alasan inilah yang menyebabkan zat

warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Penggunaan zat warna

memungkinkan pengamatan struktural sel seperti spora, flagella dan bahan

inklusi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan gram

merupakan contoh pewarnaan difrensial yang memisahkan bakteri menjadi

kelompok gram posisitif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial yang lain

yaitu pewarnaan Zielth Nielsen yang terbagi dalam kelompok bakteri tahan

asam dan tidak tahan asam (Bibiana, 1992).

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang

dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi

mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan

sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat

digunakan untuk identifikasi awal. Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4

macam yang masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda,

yaitu (Waluyo, 2004):

1. Cat Gram A

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat

Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna

 mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme

akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.

2. Cat Gram B

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu

cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap

mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan

warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

3. Cat Gram C

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat

sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan yang

pertanama mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena

tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan

oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram

positif. Sedangkan bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan

terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh

alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri

Gram negatif.

4. Cat Gram D

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras.

Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target.

Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer.

Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan yang pertama

bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh
 mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.

Sedangkan yang kedua bakteri Gram negatif akan berwarna merah,

karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan

mampu mengikat cat Gram D.

Pengecatan gram mempunya kelebihan dimana pengecatan Gram penting

sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia

bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri

terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif

mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.

Selain itu kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram

mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan

Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka

memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

Disamping itu pengecatan gram juga mempunyai kekurangan dimana

pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni

lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme

misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk

mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil

sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara

mikroskopis (Waluyo, 2004).

Dalam pengamatan mikroskopik terhadap mikroorganisme paling

digunakan olesan terwarnai dalam keadaan hidup. Mikroorganisme terwarnai

adalah mikroorganisme yang telah diwarnai dengan zat warna kimia, agar
 mudah diamati dan dipelajari. Pada umumnya olesan terwarnai terhadap

mikroorganisme mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya

sturktur internal, seperti spora dan butiran lainnya (Djide, 2003).

Zat pewarna khusus yang dibutuhkan untuk melihat baik kapsul atau

flagella, maupun yang lain-lainnya terperinci didalam sel. Zat warna dapat

juga digunakan untuk melihat perbedaan susunan kimia pada struktur

mikroorganisme. Zat tersebut disebut zat pewarna diperensial (Djide, 2003).

2.2. Uraian Bahan

1. Kristal Violet (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Kristal violet

Pemerian : Hablur berwarna hijau tua

Kelarutan : Sukar larut dalam air; agak sukar larut

dalam etanol (95%) P dan dalam asam

asetat glasial P. Larutannya berwarna

lembayung tua

Kegunaan : Pewarna.

2. Alkohol (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aethanolum.

Nama lain : Etanol/Alkohol.

Pemerian : Cairan tak berwarna, jernih, mudah menguap

dan mudah bergerak; bau khas; rasa panas.

Mudah terbakar dengan memberikan nyala

biru yang tidak berasap.

 Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari

cahaya; di tempat sejuk, jauh dari nyala api.

Kegunaan : Sebagai larutan pencuci.

3. Air suling (DiRjen POM, 1979)

Nama resmi : Aqua Destillata.

Nama lain : Air suling/aquades.

RM/BM : H2O/18,02.

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau,

dan tidak mempunyai rasa.

Penyimpanan: Dalam wadah tertutup baik.

4. Iodium ( Ditjen,POM,1979)

Nama resmi : Iodum

Nama lain : Iodium

RM/BM : I/126,91

Pemerian : Keping atau butir, berat, mengkilat, seperti logam;

hitam kelabu; bau khas

Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 3500 bagian air, dalam

13 bagian etanol (95%) P, dalam lebih kurang

80 bagian gliserol P dan dalam lebih kurang 4

bagian karbondisulfida P; larut dalam kloroform

P dan dalam karbontetraklorida P

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan : Sebagai komposisi cat B.

 5. Safranin (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Safranin

Pemerian : Serbuk halus berwarna biru keunguan.

Kelarutan : Tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup

Kegunaan : Sebagai komposisi cat D.

2.3. Uraian Uji Mikroba

1. Escheriachia coli (Pelczaer .1986)

Kingdom : Procaryotae

Divisio : Gracilicutes

Class : Scotobacteria

Ordo : Eubacterials

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escheriachia coli

Morfologi Escheriachia coli adalah Batang lurus, motil dengan

flagellum paritrikus atau non motil. Gram negatif. Tumbuh dengan mudah

pada medium nutrient sederhana. Laktose difermentasi oleh sebagian besar

galur dengan produksi asam dan gas.

2. Staphylococcus aureus

Domain: Bacteria

Kerajaan: Eubacteria
 Filum: Firmicutes

Kelas: Bacilli

Ordo: Bacillales

Famili: Staphylococcaceae

Genus: Staphylococcus

Spesies: S. aureus

Morfologi S. aureus adalah Bakteri Staphylococcus berbentuk bulat

menyerupai bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak teratur satu

sama lain. Sifat dari bakteri ini umumnya sama dengan bakteri coccus yang

lain
 BAB III

PROSEDUR KERJA

1.1. Alat

Adapun alat-alat yang digunakan pada saat praktikum adalah:

1. Deck glass

2. Mikroskop

3. Objek glass

4. Ose

5. Spiritus

1.2.Bahan

Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah :

1. Kristal violet

2. Logol

3. Alcohol HCl

4. Safranin
1.3.Cara Kerja

1. Pembuatan preparat untuk pengecatan

a. Diambil objek glas yang bersih steril.

b. Dibebaskan dari lemak dengan memanaskannya diatas nyala api

spiritus

c. Dengan ose steril, diambil sedikit satu koloni bakteri, diratakan pada

objek glass dan ditipiskan.

d. Ose yang sudah digunakan untuk mengambil kuman harus disterilkan

kembali dengan cara dibakar dengan nyala api sampai membara dan

disterilkan kembali sebelum dipakai.

e. Preparat kemudian dikeringkan diatas nyala api spiritus sambil

digoyangkan. Setelah kering, preparat siap untuk dicat.

2. Cara melakukan pengecatan gram

a. Preparat yang siap dicat, digenangi dengan cat Gram A selama 1-3

menit. Kemudian cat dibuang dan tanpa dicuci. Semua bakteri pada

pengecatan Gram A akan berwarna ungu sesuai dengan cat Gram A.

b. Preparat digenangi dengan cat Gram B selama 1 menit. Akibat

pemberian cat gram B, maka pengkilatan warna oleh bakteri menjadi

lebih baik. Setelah itu cat dibuang dan dicuci dengan air mengalir.

c. Preparat ditetesi dengan cat Gram C sampai warna cat tepat

dihilangkan. Setelah pemberian cat Gram C maka akan terjadi:

Bakteri Gram positif : tahan terhadap alcohol sehingga bakteri tetap

berwarna ungu.
 Bakteri gram negative : tidak tahan terhadap alcohol sehinga warna

ungu dari cat akan dihilangkan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

d. Digenangi dengan cat Gram D selama 1-2 menit. Gram D bertindak

sebagai warna kontras.

e. Setelah itu amati kedua sampel di mikroskop.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil Pengamatan

Gambar Keterangan

Nama Bakteri : Staphylococcus

aureus

Bentuk : Coccus (bulat)

Susunan : Monococcus

Warna : Ungu

Gram : Positif

Zat warna : KKV

Nama Bakteri : Escherchia coli

Bentuk : Batang (bacil)

Susunan : Monobacil

Warna : Merah Muda

Zat Warna : Fuchsin basa

Gram : Negatif

4.2. Pembahasan

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau

tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan

spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, bakteri gram positif dan gram

negative.

Pada praktikum ini, yang bertujuan untuk melakukan pengecatan gram

khusunya untuk membedakan gram positif dan gram negative. Pada

percobaan pertama yaitu dengan sampel bakteri Staphylococcus aures ditetesi

Kristal violet sebanyak satu tetes kemudian dibuang lalu ditetesi lagi dengan

lugol sebanyak satu tetes kemudian di diamkan selama satu menit lalu dibilas

dengan air mengalir, selanjutnya ditetsi lagi dengan alcohol asam sebanyak

satu tetes kemudian ditunggu hingga kering lalu teraksir ditetesi dengan

safranin kemudian dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop

untuk melihat bentu dan warna. Melalui pengamatan kami Staphylococcus

aures memiliki bentuk bulat dan berwarna ungu sehingga bakteri

Staphylococcus aures adalah merupakan gram positif.

Sedangkan untuk percobaan kedua dengan menggunakan sampel

Escherchia coli yang ditetesi Kristal violet sebanyak satu tetes kemudian

dibuang lalu ditetesi lagi dengan lugol sebanyak satu tetes kemudian di

diamkan selama satu menit lalu dibilas dengan air mengalir, selanjutnya

ditetsi lagi dengan alcohol asam sebanyak satu tetes kemudian ditunggu

hingga kering lalu teraksir ditetesi dengan safranin kemudian dilakukan

pengamatan dengan menggunakan mikroskop untuk melihat bentu dan warna.

Melalui pengamatan kami Escherchia coli memiliki bentuk basil atau batang
dan memiliki warna merah sehingga Escherchia coli merupakan gram

negative.
 BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan, pada percobaan pewarnaan gram terhadap

bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli didapatkan bahwa

bakteri Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif sedangkan

bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif.

5.2. Saran

Pengamatan pewarnaan gram diperlukan ketelatenan dan ketelitian dalam

pelaksanaan step demi stepnya karena jika dilakukan dengan cereboh dan

tidak menggunakan prosedur yang telah ditetapkan akan mempengaruhi hasil

dan tidak menutup kemungkinan akan terjadi kecelakaan kerja, serta sebelum

praktikum diharapkan praktikan memahami terlebih dahulu apa yang akan

dikerjakan.
 DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Penerbit : PT Gramedia Pustaka Utama,

Jakarta.

Krueger, RG , N.W. Gillham, dan J.H. Coggin JR. 1973. Introduction To

Microboilogy. Penerbit : The Macmillan Compony. New York.

Muhamad, Ali. 2011 . Mikrobiologi Dasar. Penerbit : Universitas Pasundan,

Bandung.

Muhamad, Ali. 2012 . Mikrobiologi Pangan. Penerbit : Universitas Pasundan,

Bandung.

Pelczar, M. J. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit : Universitas Indonesia,

Jakarta.

Reyza, M. 2008. Metode Pewarnaan Gram, http://qi206.wordpress.co. Akses

1/12/12