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Marcadores moleculares: Qué son, cómo se obtienen y para qué valen

M. Gonzalo Claros Díaz

Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y microbianas

basándose en el fenotipo. Las mejoras genéticas eran posible gracias a la variabilidad genética, a la
heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la eficacia e intensidad de la selección aplicada, y al tiempo
necesario para realizar un ciclo de selección. Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son
el número y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter, la localización de estos genes, y su
función fisiológica. Por otra parte, la taxonomía siempre ha estudiado características morfológicas, lo cual
requiere observaciones muy exhaustivas de los organismos en diferentes estadios de desarrollo. Los criterios
utilizados carecen muy a menudo de definición y objetividad y, en cualquier caso, son marcadores ambiguos
debido a las influencias ambientales.
Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los
inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de
especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva. Los marcadores moleculares son
biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores
moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia
y función desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un rasgo
genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un marcador molecular
monomórfico es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso
molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el
grado de variación es tal que se denominan hipervariable.
Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificación de proteínas e
isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la
estructura y heterogeneidad genética entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen
geográfico. Pero esta técnica tenía una límitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente
polimorfismo entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión
génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente
a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología del DNA recombinante han permitido el
desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificación
de especies y variedades. El número de técnicas descritas es cada vez más numeroso, por lo que vamos a
reunirlas en 3 categorías: RFLP, MAAP y STS. Pero antes conviene saber lo que es una PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las técnicas esenciales para la preparación de
huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por sí sola. La reacción básica de la PCR
comienza con la desnaturalización del DNA molde para separar las cadenas, continúa con el alineamiento de
un par de oligonucleótidos con su DNA molde, y termina con la polimerización para sintetizar un nuevo DNA
entre los dos oligonucleótidos. De aquí se vuelve a la desnaturalización para comenzar un nuevo ciclo. Hoy en
día todo el proceso esta completamente automatizado en un aparato llamado ?termociclador?, y existe una
batería de enzimas y condiciones que permiten polimerizar hasta 35 kpb sin errores, aunque las condiciones
normales amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb de longitud.

RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción).

Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso
molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más
fáciles de analizar son los ?pequeños? derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los
cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón

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de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso
molecular. En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de
bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos
mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes
previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas.
Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los
primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de
entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas
para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP

MAAP (Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación)

Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas que emplean oligonucleótidos
arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas técnicas caben destacar:

RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Es una de las técnicas más versátiles desde que se
desarrolló en el año 1990. Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR áreas
específicas distribuídas al azar por el genoma. Su pequeñez y la baja temperatura de alineamiento
(36°C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos
fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles
electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los distintos individuos o grupos de individuos, y
proporcionarán una huella dactilar característica. Es muy cómoda, rápida, requiere poco DNA que
además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se
pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los
fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino redundante, y que
no da información sobre el número de copias que el DNA genómico contiene de la secuencia
amplificada. Esta tecnología ha sido utilizada para la catalogación de frutos, selección de variedades, y
diferenciación de líneas clonales. También se está utilizando para el análisis de las variedades de apio,
uva, limón y olivo.
AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): La idea es similar a la de la RAPD, desarrollándose
a la vez que ésta, aunque se cambia el diseño de los oligonucleótidos y el tipo de PCR. Los
oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja
astringencia (poco específicos) que permite la polimerización de una batería de fragmentos
característicos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar
(visualizar) específicamente las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un
gel de agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede marcar
radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho más finos y precisos.
Existe una variación denominada DAF (Huellas dactilares por amplificación de DNA) que utiliza
oligonucleótidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difíciles
de interpretar.
AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Esta técnica se desarrolló en
1995 y combina el uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de manera que se
obtienen marcadores moleculares muy específicos sin necesidad de conocer la secuencia con
anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy frecuente, y otra de
corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las
enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando con la complementariedad del oligonucleótido con el
sitio de restricción se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas. Una ventaja
especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola
reacción. Por eso el resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolución, puesto que
no se resolverían en agarosa. Esta técnica ya se ha usado con éxito en patatas y cebada.
STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias
discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las secuencias conocidas, únicas dentro del

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genoma, para amplificarlas por PCR. El polimorfismo se suele encontrar fácilmente cuando lo que se
amplifican son intrones en lugar de exones. La ventaja principal es la velocidad con la que se pueden
realizar los análisis una vez que las parejas de oligonucleótidos se han establecido claramente. Por tanto
se combinan la rapidez de la RAPD con la especificidad de la RFLP. Por la manera en que se
determinan los oligonucleótidos y por la forma de analizar los polimorfismos, esta técnica ha derivado
en otras que enumeramos a continuación:
SSR (Repetición de secuencias discretas), descrita en 1989. En los genomas existe un DNA ubicuo y
abundante denominado "microsatélite" que consiste en mono-, di-, tri- y tetranucleótidos repetidos en
tándem. Este DNA, que es muy polimórfico, se ha utilizado como marcador molecular cuando la
secuencia del motivo repetido se clona y secuencia para usarla en el análisis de poblaciones. De esta
manera se han estudiado con éxito numerosos árboles, aunque en algunos se ha visto que los
microsatélites son menos variables de lo que se esperaba. Otras siglas para designar esta técnica son
ISSR, IMA, ISA, IRA, y RAMP.
EST (Sitios etiquetados por la expresión), descrita en 1991. Su particularidad proviene del hecho que
los oligonucleótidos se han deducido a partir de cDNA parcial o completamente secuenciado.
Curiosamente el polimorfismo sólo se observa claramente cuando los fragmentos amplificados se cortan
con enzimas de restricción, lo que hace que el método sea realmente costoso en tiempo y dinero.
CAPS (Secuencia polimórfica amplificada y cortada), descrita en 1993. Los fragmentos amplificados
se someten a una restricción enzimática y se migra en un gel de agarosa. Las variaciones se detectan
por presencia o ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar cambios finos en una zona
específica.
SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas), descrita en 1993. Esta técnica
aprovecha que las RAPD proporcionan principalmente fragmentos de DNA altamente repetido. Estos
fragmentos de RAPD se clonan y secuencian para elaborar oligonucleótidos específicos. Aunque
permite el desarrollo rápido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo obtenido es bastante
bajo.
D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/térmico), descrita en 1987. Analiza el
polimorfismo a través de la estabilidad, a distintas condiciones Desnaturalizantes o Temperaturas, del
DNA amplificado. Su principal problema reside en las dificultades técnicas para manetener estables las
condiciones experimentales.
SSCP (Polimorfismo de conformaciones monocatenarias), descrita en 1989. Esta técnica se basa en el
análisis del polimorfismo a través de las diferencias conformacionales de fragmentos de DNA
monocatenario. Las distintas conformaciones son detectables como un cambio de movilidad en geles de
poliacrilamida no desnaturalizante. Es especialmente útil cuando las reacciones de PCR producen
bandas de DNA de gran tamaño (en general superior a 1?5 kpb) o bien bandas de tamaño muy próximo.
Puede llegar a distinguir cambios de pocos nucleótidos en una secuencia de más de 1 kpb. Se está
utilizando para caracterizar árboles de interés forestal.

Las aplicaciones de los marcadores moleculares son muy diversas y es de esperar que cada vez se les
encuentren nuevos usos. Por ahora se vienen empleando en la diferenciación de individuos, discriminación
entre clones, análisis filogenéticos y taxonómicos, mapeo de genomas, cuantificación de variabilidad génica
intra e interespecífica, mejoras genéticas, detección de infecciones o propensión a sufrirlas, localización de
resistencia a enfermedades, y dispersión de especies. En internet se puede obtener información adicional en
las páginas web: www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/ y opbs.okstate.edu/~melcher
/MG/MG01.html.

M. Gonzalo Claros Díaz es Investigador Contratado en el Dpto. de Biología Molecular y Bioquímica

(Universidad de Málaga)

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