Anda di halaman 1dari 23

BAB II

PEMBAHASAN

A. PENGERTIAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana
fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa
analit dalam martiks sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern,
yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem
pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa
kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil
dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada
kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam
analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat
diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat
digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan
dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat
yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian
bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam
analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya,
antara lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa
dicapai.
b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena
pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-
detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT
dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang
digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan
terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki
beberapa kelemahan, yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam
analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar.
Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak
stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang
dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik
makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif
dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal,
namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil
analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

B. Jenis- Jenis HPLC


Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih
polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar
dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC
dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas,
HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi
atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam
yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial
karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi
lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian
yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi
ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal
digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi
penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau
kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan
retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion
fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik
dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam
yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul
yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut
dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia
antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika
ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat
digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
C. Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa,
alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan
fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem
kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

1 . Wadah fase gerak (Reservoir)


Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak
akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya
terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,
polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector,
fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC
merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fas e gerak HPLC:


1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-
polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan
pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak
polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk
cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara
2-5
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan
harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh
ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan
pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya
ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di
ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan
bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000
psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara
otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :


a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan
aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan
resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi
septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari
septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai,
volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke
dalam kolom.

 Syarat- syarat injektor yang baik :


 Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
 Mudah digunakan
 Keberulangan tinggi
Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor
Tabung Stainless steel Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
cm Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci Diameter dalam 1 atau 2 mm
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil, Porous, silika ukuran kecil, silika
silika yang dimodofikasi yang dimodofikasi secara kimiawi
secara kimiawi (bonded (bonded phase), atau polimer-
phase), atau polimer- polimer stiren/divinil benzen.Rata-
polimer stiren/divinil rata diameter partikel 3,5 atau
benzen.Rata-rata diameter 10µm dengan kisaran sempit.
partikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi
operasional (35-215 bar (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi


terklorinasi atau alkohol atau alkohol untuk fase normal.
untuk fase normal. Untuk Untuk fase terbalik (reversed
fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau
phase) digunakan metanol asetonitril + air atau
atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100
bufer.Kecepatan alir : 1-3 µl/menit.Modifikasi instrumen
ml/menit Sistem penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10µl/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan
bekurannya ukuran partikel tetapi lambat,konsumsi fase gerak
fase diam, akan tetapi umur hanya ¼ dari kolom konvensional.
kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom


konvensional, yakni:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100
μl/menit).
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi
secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun
tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-
silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak
dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang
hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat
kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Karakteristik detector HPLC:
Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas suhu
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

D. Prinsip Kerja HPLC


Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase
diam
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya,
alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang
paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya,
dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan
asam.
HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara
yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak
yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat.
Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat
yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara
dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun
memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di
dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada
kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan
untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang
khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang
khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses
separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam
sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram
dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk
sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih
mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya
melalui proses pelarutan saja.

E. Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC


Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis
terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya.

Kelebihan itu antara lain:


a . Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran
b . Mudah melaksanakannya
c . Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d . Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik
e . Dapat digunakan bermacam- macam detektor
f . Kolom dapat digunakan kembali
g . Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
h . Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC
dilakukan pada suhu kamar.
i . Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi
seperti polimer
k . Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
l. Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis
yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-
12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll,
dapat juga digunakan dalam HPLC
q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven
yang digunakan
r. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC
dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
s. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.
t. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.

Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu


b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

F. Teknik Pengoperasian Alat


Diagram alir HPLC

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa
senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
 Komposisi yang tepat dari pelarut
 Temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu
retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum
yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.
Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor
pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan
menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang
dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya
menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan
yang salah dari pelarut.

G. Analisis Kromatogram/ interpretasi data


Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah
mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa
yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.
Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui
jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa
tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari
senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan
sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X.
Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y
mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin
ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak
yang kecil.
H. Contoh Analisa
Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC
dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat
kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi
Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa
obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan
metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah beberapa
contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :
Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Detektor
Asetonitril-asam Fluoresen
Adriamisin (serum) C18 fosfat 0,01 N ph EK : 465 nm
2,3 (50:50) EM : 580 nm
CH3CN-H2O
Aktinomisin (Serbuk) C18 Elektrometer
(1:1)
KH2PO4 0,05M;
Allopurinol (tablet) C18; 4 x 30 cm UV 254 nm
1,5 ml/menit

1. Parasetamol:
Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida

Rumus Molekul : C8H9NO2

Berat Molekul : 151,16

Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.

Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut
dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino


fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti yang
baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan
pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan. Asetaminofen
merupakan analgetik dan antipiretis.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan
fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui
saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma
antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat
protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.
Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses
analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu
larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC
dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini
dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari
pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi.
Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan
kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar
lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan
kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor
UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian
ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan panjang gelombang
methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse
phase” atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak
sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam
yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya
saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu
yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk melewati kolom
ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur
adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu
citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang
dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa
grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar
dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC,
difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu
sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa
disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter
pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner
kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas.
Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti
pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan
terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju
difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari
grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat.
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar
parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg
diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat disimpulkan
bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg per tabletnya.
2. Kafein
Rumus struktur :
Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin

Rumus Molekul : C8H10N4O2

Berat Molekul : 194,19

Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal,
tidak berbau, rasa pahit.

Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform,
sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).

Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC
yang digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom :
Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat 70% dan methanol
30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap
injection ke HPLC.

ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif
diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar /
konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau
tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak
diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak
memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:
Peak area
No
Kafein standar Kafein dalam sampel
1 2601417,40 2216635,31
Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis
dengan mengunakan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
= x 200 ppm
= 170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.
Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:
Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap
komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-
komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita
harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen
Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.
Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan
mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana
jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis.
Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau
asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya.
Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan
untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira
100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak
mungkin. Letargi, iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih
dari 600 mg kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek,
2001).

Preparasi Sampel
 Sampel harus dalam bentuk larutan
 Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh
terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.
Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.
Preaparasi Fase Gerak
 Fase Gerak ( eluen ) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk air
digunakan akuabidest.
 Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore kemudian diawagaskan ( di digest )
dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.
 Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan untuk menghindari
adanya gelembung pada selang penghubung.
 Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di gunakan.

BAB III
PENUTUP
Kesimpulan

a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.

b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-
senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam).
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk
hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya
adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan
pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak
tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah
larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic,
harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya
mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University
Press. Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.

Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan
Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta


http://ruangdiskusiapoteker.blogspot.co.id/2012/06/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://paramita-kromatografi.blogspot.co.id/2012/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-
kckt_6.html